Nghiên cứu tinh chế saponin từ dây thìa canh lá to bằng nhựa macroporous d101

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐẶNG THỊ LAN HƢƠNG MSV : 1101236 NGHIÊN CỨU TINH CHẾ SAPONIN TỪ DÂY THÌA CANH LÁ TO BẰNG NHỰA MACROPOROUS D101 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI – 2016 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐẶNG THỊ LAN HƢƠNG MSV: 1101236 NGHIÊN CỨU TINH CHẾ SAPONIN TỪ DÂY THÌA CANH LÁ TO BẰNG NHỰA MACROPOROUS D101 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS NGƢT Trần Văn Ơn Nơi thực hiện: Bộ môn Thực vật Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội HÀ NỘI - 2016 LỜI CẢM ƠN ! Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, trước tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo PGS.TS Trần Văn Ơn, DS Phạm Thị Linh Giang, TS Trần Văn Hân người trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình giúp đỡ em hoàn thành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc toàn thể thầy cô giáo, anh chị kĩ thuật viên, bạn chị làm môn Thực vật tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ em hoàn thành khóa luận thời hạn Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội, người dạy dỗ bảo em tận tình suốt tháng năm học tập trường Cuối cùng, với lòng biết ơn vô hạn, em xin phép gửi lời cảm ơn tới gia đình, ngƣời thân, bạn bè động viên hỗ trợ em suốt thời gian qua Do thời gian có hạn trình độ thân hạn chế nên khóa luận tránh khỏi thiếu sót Vì vậy, em mong nhận bảo tận tình thầy cô góp ý chân thành bạn bè Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 04 năm 2016 Sinh viên: Đặng Thị Lan Hƣơng MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ LOÀI GYMNEMA LATIFOLIUM WALL EX WIGHT 1.1.1 Đặc điểm thực vật vị trí phân loại 1.1.3 Tác dụng sinh học 1.1.4 Các nghiên cứu phân lập acid gymnemic từ dây thìa canh 1.2 TỔNG QUAN VỀ PHƢƠNG PHÁP CHIẾT PHA RẮN 1.2.1 Nguyên tắc chiết pha rắn 1.2.2 Vật liệu sử dụng CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 ĐỐI TƢỢNG, NGUYÊN LIỆU, HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 13 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 13 2.1.2 Nguyên liệu 13 2.1.3 Hoá chất, thiết bị, dụng cụ 13 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 14 2.2.1 Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến khả hấp phụ hoạt chất dịch chiết hạt nhựa D101 14 2.2.2 Khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến trình phản hấp phụ hoạt chất dịch chiết hạt nhựa D101 15 2.3.1 Phương pháp chiết xuất 15 2.3.2 Phương pháp phân lập hoạt chất từ dịch chiết tổng sử dụng cột nhựa… 16 2.3.3 Phương pháp khảo sát trình hấp phụ acid gymnemic hạt nhựa D101 17 2.3.4 Phương pháp khảo sát trình phản hấp phụ hoạt chất dịch chiết hạt nhựa D101 18 2.3.5 Phương pháp bán định lượng gymnemagenin HPTLC 21 2.3.6 Phương pháp định tính saponin sắc ký lớp mỏng 23 CHƢƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25 3.1 ĐÁNH GIÁ PHƢƠNG PHÁP BÁN ĐỊNH LƢỢNG GYMNEMAGENIN BẰNG HPTLC 25 3.1.1 Độ đặc hiệu 25 3.1.2 Tính tuyến tính 25 3.1.3 Độ thích hợp hệ thống 26 3.2 KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH HẤP PHỤ CỦA HẠT NHỰA D101 27 3.2.1 Tỷ lệ khối lượng hạt thể tích dịch chiết 27 3.2.2 Thời gian hấp phụ 29 3.3 KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH PHẢN HẤP PHỤ HOẠT CHẤT TRONG DỊCH CHIẾT CỦA HẠT NHỰA D101 30 3.3.1 Dung môi phản hấp phụ 30 3.3.2 Tỉ lệ chiều cao/đường kính khối hạt 32 3.3.3 Tốc độ thể tích dung môi rửa giải 33 4.1 KẾT LUẬN 39 4.2 KIẾN NGHỊ 39 PHỤ LỤC Error! Bookmark not defined DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU - TỪ VIẾT TẮT HPTLC: High performance thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng hiệu cao) TLC: Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng) DTCLT: Dây thìa canh to (Gymnema latifolium Wall ex Wight) DTCLN: Dây thìa canh nhỏ (Gymnema sylvestre (Retz) R Br Ex Schult.) GA: Acid gymnemic BV: Bed volume (thể tích khối hạt) v/v/v: volume/volume/volume (thể tích/thể tích/ thể tích) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Cấu trúc hoá học, tính chất vật lývà tác dụng hạ đường huyết Trang 1.1 tương ứngcủa acid gymnemic phân lập từ DTCLN 1.2 Thông số vật lý hạt nhựa hấp phụ D101 10 2.1 Các dãy nồng độ dung dịch mẫu chuẩn 21 3.1 Giá trị Rf diện tích pic vết sắc ký 26 Hiệu suất hấp phụ gymnemagenin nhựa D101 khối 27 3.2 3.3 3.4 3.5 lượng hạt khác Hiệu suất hấp phụ gymnemagenin sau khoảng thời gian khác 29 Hiệu suất phản hấp phụ gymnemageninkhi sử dụng dung dịch rửa 30 giải nồng độ cồn khác Hàm lượng phần trăm gymnemagenin cắn sử dụng cột có tỷ lệ chiều cao/đường kính khối hạt khác 32 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình 1.1 Đặc điểm hình thái Gymnema latifolium Wall ex Wight Cấu trúc khung gymnemagenin thu kiềm hoá aglycon 1.2 5 Gymnema sylvestre (Retz) R Br ex Schult Định tính gymnemagenin phân đoạn ethyl acetat 1.5 Gymnema sylvestre (Retz) R Br ex Schult Cấu trúc phần phần đường acid gymnemic phân lập từ 1.4 acid gymnemic Cấu trúc phần aglycon acid gymnemic phân lập từ 1.3 Trang mẫu Gymnema latifolium Wall ex Wight 3.1 Kết chồng pic mẫu thử, mẫu chuẩn mẫu trắng 25 3.2 Mối liên hệ nồng độ diện tích pic 26 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 Mối liên hệ khối lượng hạt/50 ml dịch chiết hiệu suất hấp 28 phụ gymnemagenin (%Hhp) Mối liên hệ hiệu suất gymnemagenin hấp phụ (%Hhp) thời 29 gian hấp phụ Hiệu suất gymnemagenin phản hấp phụ (%Hphp) khỏi nhựa D101 31 sử dụng dung dịch cồn nồng độ khác Mối liên hệ thể tích rửa giải tổng diện tích pic rửa giải 33 với tốc độ 2BV/h Mối liên hệ thể tích rửa giải tổng diện tích pic rửa giải với tốc độ 4BV/h 34 ĐẶT VẤN ĐỀ Dây thìa canh nhỏ (Gymnema sylvestre (Retz.) R Br Ex Schult.) từ lâu biết đến rộng rãi với tác dụng hạ đường huyết kiểm soát béo phì [29] Giai đoạn gần đây, loài dây thìa canh khác dây thìa canh to (Gymnema latifolium Wall ex Wight) khẳng định có kết tốt thử tác dụng hạ đường huyết mô hình với dây thìa canh nhỏ (Gymnema sylvestre (Retz) R Br Ex Schult.) [6] Ở Việt Nam, dây thìa canh thương mại hoá nhiều dạng bào chế trà túi lọc, viên nang để hỗ trợ điều trị cho bệnh nhân đái tháo đường Tuy nhiên, sản phẩm từ nguyên liệu ban đầu dược liệu thô dịch chiết tổng chưa qua tinh chế chưa tìm thấy quy trình phân lập phù hợp [2] Gần đây, loại nhựa macroporous tập trung nghiên cứu việc tinh chế dịch chiết thô quy mô phòng thí nghiệm lẫn quy mô công nghiệp [38], tính đặc hiệu, hiệu suất cao, chi phí vận hành thấp, sử dụng dung môi độc hại dễ tái sử dụng [24], [40], [41] Đặc biệt, tác giả Wu cộng có nghiên cứu cho kết khả quan phân lập tổng phân đoạn saponin DTCLN (Gymnema sylvestre(Retz) R Br Ex Schult.) với loại hạt macroprous phổ biến D101 [39] Vì vậy, nhằm bước đầu xây dựng phương pháp phân lập acid gymnemic hiệu quả, kinh tế có tính thực tiễn, đề tài: “Nghiên cứu tinh chế saponin từ dây thìa canh to nhựa macroporous D101” tiến hành nghiên cứu với mục tiêu: Khảo sát lựa chọn số điều kiện hấp phụ, phản hấp phụ acid gymnemic từ dịch chiết tổng dây thìa canh to (Gymnema latifolium Wall ex Wight) sử dụng nhựa macroporous D101 CHƢƠNG I TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ LOÀI GYMNEMA LATIFOLIUM WALL EX WIGHT 1.1.1 Đặc điểm thực vật vị trí phân loại 1.1.1.1 Vị trí phân loại Theo hệ thống phân loại Takhtajan công bố năm 2009 [33], DTCLT (Gymnema latifolium Wall ex Wight) có vị trí phân loại sau: Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân Lớp Bạc hà (Lamiidae) Bộ Long đởm (Gentianales) Họ Trúc đào (Apocynaceae) Phân họ Thiên lý (Asclepiadoideae) Chi Gymnema R.Br Loài Gymnema latifolium Wall ex Wight Ở Ấn Độ, DTCLT (Gymnema latifolium Wall ex Wight) biết đến với tên đồng nghĩa khác Gymnema khandalense Gymnema Kollimalayanum [34] Phân bố: Đảo Andaman Nicobar, Bangladesh, Trung Quốc (Quảng Đông, Quảng Tây, Vân Nam), Ấn Độ (Arunachal Pradesh, Assam, Kerala, Maharashtra, Tamil Nadu), Myanmar, Thái Lan [34], Việt Nam (Cúc Phương, Hoà Bình, Thái Nguyên) [9] 1.1.1.2 Đặc điểm thực vật Dây leo, dài lên tới 7-10 m Toàn thân có nhựa mủ màu vàng tươi Thân non đường kính 1-3 mm, phủ lông màu đỏ, dày đặc ngọn; thân bánh tẻ có lỗ bì lông thưa; thân già có bần hóa xốp có khía dọc; lóng thân từ 4-18 cm [5] Lá đơn, nguyên, mọc đối; cuống 3-5 cm, phủ lông dày; phiến hình bầu dục, dài 10-14 cm, rộng 5-8 cm; gốc tròn, có lõm lệch; mép nguyên; nhọn; mặt xanh thẫm, phủ lông ráp; mặt màu xanh 36 Dung môi phản hấp phụ lựa chọn để khảo sát EtOH với nồng độ khác Đây dung môi độc hại, sử dụng nhiều công nghiệp, dung môi có độ phân cực phù hợp rửa giải acid gymnemic chứng minh nghiên cứu trước nên lựa chọn để khảo sát [39] 3.4.2 Bàn luận kết nghiên cứu Các kết bước đầu cho thấy, sử dụng hạt D101 để loại bớt tạp chất dịch chiết dây thìa canh với tỷ lệ 1g/10ml dịch chiết sau xử lý (nồng độ Gymnemagenin 0,2 mg/ml), hấp phụ sau giờ, rửa giải 37 BV dung môi EtOH 70% với tốc độ BV/h cột có tỉ lệ chiều cao/đường kính khoảng 13 lần đem lại hiệu suất thu hồi khoảng 48%, với hàm lượng phần trăm Gymnemagenin/cắn sau phân lập khoảng 58,85% 3.4.2.1 Dung lượng hấp phụ Dung lượng hấp phụ gymnemagenin từ dịch chiết nghiên cứu tính khoảng 2.06 mg/g hạt, thấp nhiều so với dung lượng hấp phụ acid gymnemic nghiên cứu DTCLN (Gymnema sylvestre) trước (93.90 mg/g) [39] Điều giải thích lý Thứ nhất, đề tài tiến hành dịch chiết dây thìa canh lẫn nhiều tạp chất nên làm giảm dung lượng hấp phụ hạt riêng acid gymnemic Trong nghiên cứu tác giả Wu cộng tiến hành dung dịch acid gymnemic chuẩn Thứ hai, điều kiện tiến hành nghiên cứu đề tài có khác so với nghiên cứu (quá trình ngâm hạt để 24 giờ, lắc nghiên cứu họ sử dụng máy lắc liên tục 24 giờ) ) Thứ ba, phương pháp định lượng hoạt chất đề tài khác so với nghiên cứu tác giả Wu Đề tài lựa chọn gymnemagenin làm chất chuẩn đại diện cho tổng acid gymnemic nghiên cứu trước, tác giả chọn chất (gọi acid gymnemic chuẩn) nhóm 18 chất để tiến hành định lượng lấy kết kết luận đại diện cho toàn hỗn hợp acid gymnemic Việc chọn khung gymnemagenin làm chất chuẩn mang tính đại diện cao kết tìm có ý nghĩa Thứ tư, hai loài tiến hành nghiên cứu hai loài khác nên có khả có khác biệt thành phần 37 acid gymnemic tỷ lệ thành phần hỗn hợp, dẫn đến sai khác khả hấp phụ hạt 3.4.2.2 Thời gian hấp phụ Thời gian hấp phụ vào khoảng phù hợp với nghiên cứu trước [39] 3.4.2.3 Dung môi phản hấp phụ Dung môi phán hấp phụ tối ưu nghiên cứu chọn EtOH 70%, nghiên cứu trước, tác giả Wu lại đưa kết luận EtOH 50% Điều giải thích lý thứ ba thứ tư Do nghiên cứu tác giả Wu dùng chất số 18 acid gymnemic nên thông số nghiên cứu chất mà không đại diện cho toàn acid gymnemic Ngoài ra, tỷ lệ acid gymnemic phân cực dịch chiết tổng DTCLT lớn DTCLN dẫn đến việc dùng dung môi phân cực rửa giải nhiều hoạt chất DTCLT Tuy nhiên so với số nghiên cứu tiến hành phân lập saponin triterpenoid loài khác (Chè đắng (Ilex latifolia Thunb.) [20]) kết hoàn toàn phù hợp Hiệu suất thu hồi (%Hhp x %Hphp) đạt sau trình tinh chế hạt nhựa hấp phụ khoảng 48% Có thể giải thích hỗn hợp acid gymnemic gồm nhiều chất có độ phân cực trải dài, chất bị rửa giải phân đoạn khác Tuy nhiên nhìn chung, rửa giải phân đoạn EtOH 70% mà thu hồi 48% lượng hoạt chất kết chấp nhận Kết có ý nghĩa thực tiễn chặt chẽ đem phân đoạn rửa giải khác để thử hoạt tính sinh học, nhiên thời gian điều kiện hạn chế nên đề tài chưa thể tiến hành công việc 3.4.2.4 Tỉ lệ chiều cao/đường kính khối hạt Do số lượng cột tiến hành thí nghiệm giới hạn nên đề tài khảo sát tỉ lệ chiều cao/đường kính khối hạt 2, 13 Hàm lượng phần trăm Gymnemagenin/cắn tối ưu hoá tăng tỉ lệ này, có điều kiện đề tài đề xuất tiếp tục khảo sát thông số tương lai để đạt hiệu tối đa Tuy nhiên, nghiên cứu việc sử dụng hạt nhựa D101 để 38 tinh chế flavonoid từ Houttuynia cordata Thunb., tác giả khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ chiều cao đường kính khối hạt đến độ tinh khiết hoạt chất sau tinh chế với tỉ lệ 4, 13 40, kết thu tỉ lệ 13 độ tinh khiết đạt cao (khoảng 89%) [42] Kết dù tăng tỉ lệ lên nhiều lần (lên đến 40) độ tinh khiết đạt không tăng mà giảm (còn khoảng 86%) Như vậy, dự đoán sơ việc tăng tỉ lệ chiều cao/đường kính cột lên nhiều chưa hẳn có tác dụng làm tăng độ tinh khiết, có tăng không đáng kể Vì kết luận sơ sau tinh chế, hàm lượng phần trăm gymnemagenintrong tổng cắn rửa giải nằm khoảng ~60% Hàm lượng phần trăm Gymnemagenin/cắn (%G) sau tối ưu hoá thông số quy trình tinh chế đạt 58,85%, điều phù hợp với nghiên cứu trước với hàm lượng phần trăm Gymnemagenin/cắn sau phân lập 56,01% [39] Trong nghiên cứu tiến hành nhằm chiết xuất Akepia saponin D (một loại saponin triterpenoid) tục đoạn (Dipsaci Radix) quy mô công nghiệp, người ta làm tăng hàm lượng phần trăm hoạt chất/cắn sau phân lập qua hai bước sử dụng hạt Bước đầu cho dịch chiết chạy qua hạt không phân cực (HPD-722), hàm lượng phần trăm tăng từ 6,27% lên đến 59,41%, sau tiếp tục cho dịch rửa giải chạy qua hạt phân cực (ADS-7), hàm lượng tiếp tục tăng từ 59,41% đến 95,05% Điều gợi mở hướng nhằm làm tăng độ tinh khiết hoạt chất dịch rửa giải cách tiếp tục nghiên cứu thêm loại hạt dùng để tinh chế bước hai sau sử dụng hạt nhựa D101 để tinh chế bước Nhìn chung, với kết thu được, với việc hạt D101 tái sử dụng nhiều lần (16 lần nghiên cứu [43]), nhận thấy phương pháp khả thi áp dụng với quy mô công nghiệp cách tiến hành đơn giản, chi phí rẻ hiệu suất thu hồi cao 39 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Mặc dù thời gian có hạn điều kiện thực nghiệm nhiều hạn chế, đạt mục tiêu đề ra: Khảo sát thông số ảnh hưởng đến trình hấp phụ, phản hấp phụ, từ bước đầu xây dựng quy trình tinh chế hoạt chất từ dịch chiết tổng DTCLT hạt nhựa macroporous D101 Cụ thể sau: - Tỉ lệ hạt hấp phụ thể tích dịch chiết 5g hạt/50ml dịch chiết qua xử lý (tỉ lệ cao 100g bột DL/500ml nước cất, nồng độ gymnemagenin 0,2 mg/mL) - Thời gian đạt cân hấp phụ sau - Dung môi rửa giải EtOH 70% - Tỉ lệ chiều cao/đường kính khối hạt tối ưu 13 - Tốc độ rửa giải 4BV/h với thể tích rửa giải khoảng 37BV Sau trình tinh chế, lượng chất thu hồi khoảng 48% với hàm lượng phần trăm gymnemagenin/cắn 58,84% 4.2 KIẾN NGHỊ Trên kết nghiên cứu bước đầu, làm sở cho nghiên cứu Chúng xin đề xuất: Nghiên cứu phương pháp định lượng tổng saponin Dây thìa canh to nhanh, xác tốn dung môi hoá chất (ví dụ phương pháp đo quang) Tiếp tục khảo sát quy trình tinh chế acid gymnemic từ dịch phản hấp phụ thu nâng dần quy mô khảo sát 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Viện Kiểm Nghiệm thuốc trung ương - Bộ Y Tế (2012) (2012), "Khóa đào tạo thẩm định quy trình phân tích SKLM HPLC thuốc đông dược (theo thông tư số 22)" Nguyễn Hương Giang (2010), Nghiên cứu chiết xuất GS4 từ dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br.ex Schult), Khóa luận tốt nghiệp, Bộ môn Thực vật, Đại học Dược Hà Nội Phạm Văn Hải (2010), Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học tác dụng sinh học Dây thìa canh to Hòa Bình, Khóa luận tốt nghiệp, Đại học Dược Hà Nội, Thư viện đại học Dược Hà Nội Nguyễn Thị Thu Hiền (2014), Nghiên cứu đặc điểm hình thái, di truyền bán định lượng Gymnemagenin loài dây thìa canh to (Gymnema Latifolium Wall Ex Wight) Việt Nam, Luận văn thạc sĩ, trường Đại học Dược Hà Nội Trần Thị Oanh (2014), Nghiên cứu sản xuất chế phẩm hỗ trợ điều trị tiểu đường từ dâu thìa canh to (Gymnema latifolium Wall Ex Wight), Báo cáo kết khoa học công nghệ, Hà Nội Trần Văn Ơn Phùng Thanh Hương (2011), Sàng lọc dược liệu có tác dụng điều trị đái tháo đường Việt Nam nghiên cứu thành phần hóa học, độc tính, hạ đường huyết số dược liệu điển hình, Đề tài khoa học phát triển công nghệ cấp Bộ Trịnh Thị Diệp Thanh (2013), Xây dựng phương pháp định lượng saponin toàn phần giảo cổ lam phương pháp đo quang, Khoá luận tốt nghiệp, trường Đại học Dược Hà Nội Nguyễn Ngọc Tú (2013), Nghiên cứu dấu vân tay hoá học loài chi Gymnema R.Br Việt Nam, Khoá luận tốt nghiệp, Đại học Dược Hà Nội 41 Phạm Hà Thanh Tùng (2012), Nghiên cứu tính đa dạng thực vật thành phần hoá học loài chi Gymnema R.Br Việt nam, Đề tài thạc sĩ, Đại học Dược Hà Nội 10 A Bakrundeen Ali cộng (2007), Compendium of Bioactive Natural Products Studium Press LLC, tr.75-99 11 Ahmed A B A Komalavalli N (2009), "Pharmacological activities, phytochemical investigations and in vitro studies of Gymnema sylvestre R.Br - a historical review", Comprehensive Bioactive Natural products– Potential & Challenges 1, tr 75-99 12 Ramachandran A Natarajan D (2010), "Antibacterial Activity of Gymnema kollimalayanum", A New Plant from Peninsular India 4(6), tr 292-295 13 A.Guyot M.Bartholin (1982), Handbook of HPLC, second edition, Tập 8, Progress in Polymer Science, tr.277 14 Baskaran et al (1990), "Antidiabetic effect of a leaf extract from Gymnema sylvestre in non-insulin-dependent diabetes mellitus patients", Journal of Ethnopharmacol 30(3), tr 295-300 15 L.D Belyakova cộng (1984), "Porous organic polymers: Structure, surface chemistry and adsorption of certain gases", Advances in Colloid and Interface Science 21, tr 55 16 Natarajan D (2011), "Antibacterial potential and FT-IR analysis of Gymnema Kollimalayanum A Ramachandran & M B Viswan: A new record plant, India", International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research 7(2), tr 167-170 17 S.A Daignault cộng (1988), "Review of the use of XAD resins to concentrate organic compounds in water", Water Research 22(7), tr 803813 42 18 Ding Zhou Hui (2000), "Macroporous resin in the application of traditional Chinese medicines in the research", Medicaltheory and practice 13 (12), tr 730 19 Giovanni Di Fabio cộng (2014), "Triterpenoids from Gymnema sylvestre and Their Pharmacological Activities ", Molecules 19, tr 1095610981 20 Rui-Bing Feng cộng (2015), "Crude triterpenoid saponins from Ilex latifolia (Da Ye Dong Qing) ameliorate lipid accumulation by inhibiting SREBP expression via activation of AMPK in a non-alcoholic fatty liver disease model", Chinese Medicine 10, tr 23 21 Wang Hong, Li Yongji Feng Cai-li (2004), "Macroporous resin in the Saponin Research", Traditional Chinese Medicine Journal 22(2), tr 373 22 Zhang Hong, Liu Zheng-liang WANG Hong-Quan (2001), "Macroporous resin in the pharmaceutical field applications", Chinese Journal of Pharmaceutical Industry 32(1), tr 40 23 J.E.Sinsheimer, G.S.Rao H.M.McIlhenny (1970), "Constuents from Gymnema sylvestre leaves.V: isolation and preliminary characterization of the gymnemic acids", Journal of Pharmaceutical Sciences 59(5), tr 622– 628 24 Zhang J.K cộng (2012), "Separation and purification of neohesperidin from the albedo of Citrus reticulata cv Suavissima by combination of macroporous resin and high-speed counter-current chromatography.", Journal of Separation Science 35, tr 128-136 25 J.Seidl cộng (1967), "Macroporose styrol-divinylbenzol copolymere und ihre anwendung in der chromatographie und zur darstellung von ionenaustauschern", Advances in Polymer Science 5(113) 26 Guo Jian-jun cộng (2015), Study on purification and antioxidant activity of total saponins of gynostemma tea, College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University 43 27 K.Dusek (1982), "Polymer Networks in Developments in polymerization", AppliedScience 3, tr 143 28 Ramkumar K.M, Rajaguru P Ananthan R (2007), "Antimicrobial Properties and Phytochemical Constituents of an Antidiabetic Plant Gymnema montanum", Advances in Biological Research 1(2), tr 67 - 71 29 Parijat Kanetkar, Rekha Singhal Madhusudan Kamat (2006), "Gymnema sylvestre: A Memoir", Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition 41, tr 77-78 30 Jing Li Howard A Chase (2010), "Development of adsorptive (non-ionic) macroporous resins and their uses in the purification of pharmacologicallyactive natural products from plant sources", Natural Product Reports 27, tr 1493-1510 31 Yang OuYang cộng (2014), "Enrichment and purification process of astragalosides and their anti-human gastric cancer MKN-74 cell proliferation effect", African Health Sciences 14(1), tr 22-27 32 S.Foster (2012), Alternative Medicine Review Monographs, Thorne Research Inc., tr.205–207 33 Takhtajan (2009), Flowering Plants, Springer Verlag, 521-529 34 Meve Ulrich, Alejandro Grecebio Jonathan (2013), "Taxonomy of the Asian Gymnema Marsdenieae), latifolium including (Apocynaceae, lectotypification of the Asclepiadoideae, synonymous G khandalense", Botanic Garden and Botanical Museum Berlin-Dahlem 43, tr 81-86 35 V.A.Khramov, A.A.Spasov M.P.Samokhina (2008), "Chemical composition of dry extracts of Gymnemasylvestre leaves", Pharmaceutical Chemistry Journal 42(1), tr 30–32 36 Stocklin W (1969), "Chemistry and Physiological Properties of Gymnemic Acid, the Antisaccharine Principle of the Leaves of Gymnema sylvestre", J Agr Food Chem 17(4) 44 37 Warren, Plaffman R M (1959), "Early experience and taste aversion", Journal of Applied Physiology 14, tr 40 38 Yue Wu cộng (2012), "Industrial-Scale Preparation of Akebia Saponin D by a Two-Step Macroporous Resin Column Separation", Molecules 17(07), tr 7798-7809 39 Wu Xiang-yang cộng (2007), "Isolation and purification of total saponins in Gymnema sylvestre by adsorption resin", Journal of Jiangsu University (Natual Science Edition) 28 (5), tr 434-437 40 Kong Y cộng (2010), "Preparative enrichment and separation of astragalosides from Radix Astragali extracts using macroporous resins", Journal of Separation Science 33, tr 2278-2286 41 Li Y.N cộng (2010), "A simple and efficient protocol for largescale preparation of three flavonoids from the flower of Daphne genkwa by combination of macroporous resin and counter-current chromatography", Journal of Separation Science 33, tr 2168–2175 42 Zhang Ying cộng (2007), "Macroporous Resin Adsorption for Purification of Flavonoids in Houttuynia cordata Thunb", Chinese Journal of Chemical Engineering 15(6), tr 872-876 43 Sun Yongcheng cộng (2011), "Influence of Reusing Time of Macroporous Resin on Adsorption Rate of HSYA A", Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 44 E.R.B Shanmugasundaram et al (1990), "Use of Gymnema sylvestre leaf extract in the control of blood glucose in insulin-dependent diabetes mellitus", Journal of Ethno-pharmacology 30, tr 281-290 45 Y Okabayashi et al (1990), "Effect of Gymnema sylvestre R Br on glucose homeostasis in rats", Diabetes Research and Clinical Practice 9(2), tr 142148 45 PHỤ LỤC Phụ lục Một số loại hạt macroporous có thị trƣờng đặc tính chúng[28] Tên Độ phân Bản chất Diện tích bề Đƣờng kính Kích thƣớc hạt cực hạt mặt (m2/g) lỗ xốp (Å) hạt (µm) SDVB 480 – 520 130 – 140 300 – 1250 Acrylic ≥100 25 – 30 300 – 1250 Acrylic 250 – 300 90 – 150 300 – 1250 SDVB 550 – 600 150 – 250 300 – 1250 SDVB 480 – 550 90 – 150 300 – 1250 SDVB ≥ 500 70 – 80 315 – 1250 SDVB ≥ 330 140 – 170 300 – 1250 SDVB ≥ 480 120 – 140 300 – 1250 SDVB 600 520 300 – 1250 SDVB 650 – 700 85 – 90 300 – 1250 SDVB 700 – 750 85 – 90 300 – 1250 SDVB 500 – 550 100 – 120 300 – 1200 AB-8 ADS-7 Phân cưc yếu Phân cực mạnh ADS- Phân cực 17 trung bình AL-2 Phân cực D101 DM11 Không phân cực Không phân cực DM- Phân cực 301 yếu DS-401 Phân cực yếu HP-20 HPD100 HPD- Không phân cực Không 200 phân cực HPD- Phân cực 46 500 HPD- SDVB 500 – 550 100 – 120 300 -1250 SDVB 485–530 130– 140 300 -1200 SDVB 1100 – 1300 85 – 95 300 – 1200 Methacrylic 500 – 540 85 – 90 300 – 1250 Methacrylic 420 – 500 85 – 90 300 – 1250 NKA II Phân cưc SDVB 160 – 200 145 – 155 300 – 1250 XAD-7 Acrylic 450 90 250 – 840 SDVB 630 210 250 – 840 SDVB 700 400 250 – 840 SDVB 800 150 250 – 840 Acrylic 800 – 1000 85 – 95 300 – 1250 Acrylic 450 – 500 120 – 160 600 HPD722 HPD850 LSA-10 LSA-20 Phân cực Phân cực yếu Phân cực Phân cực trung bình Không phân cưc XAD16 XAD1180 XAD1600 XDA-1 Không phân cưc XDA-6 Phân cực 300 -1250 47 Phụ lục Hình ảnh mỏng đánh giá phƣơng pháp bán định lƣợng HPTLC DM: Dung môi; MC: Mẫu chuẩn; MT: Mẫu thử; GC: Gymnemagenin chuẩn Phụ lục Hình ảnh mỏng khảo sát khối lƣợng hạt thể tích dịch chiết 48 Phụ lục Hình ảnh mỏng khảo sát thời gian hấp phụ, đƣờng kính/chiều cao cột Phụ lục Hình ảnh mỏng khảo sát dung môi rửa giải 49 Phụ lục Hình ảnh mỏng khảo sát thể tích rửa giải tốc độ 2BV/h Phụ lục Hình ảnh mỏng khảo sát thể tích rửa giải tốc độ 4BV/h 50 Phụ lục Hình ảnh mỏng khảo sát tỉ lệ đƣờng kính/chiều cao cột [...]... cỏc cng s ó s dng ht D101 tỏch tng phõn on saponin triterpenoid trong cõy Kh inh tr (Ilex latifolia Thunb.), sau ú em cỏc phõn on sau ra giith tỏc dng sinh hc Sau khi hp ph ht dch chit tng qua ct D101 v ra gii ln lt ra cỏc phõn on nc, EtOH 45%, EtOH 75% v EtOH 96%; ó xỏc nh s cú mt ca cỏc saponin triterpenoid phõn on EtOH 75% [20] Trong mt nghiờn cu khỏc tin hnh phõn lp tng saponin t cõy Gio c lam... Trong ú, ht nha D101 c ng dng tỏch phõn on cho mt lot cỏc nhúm cht thiờn nhiờn nh saponin, flavon, alkaloid, cht mu [30].Wang Hong v cng s ó s dng nha D101, v mt s nha macroporous khỏc nh DA20111, D3520, AB8, nghiờn cu v ti u hoỏ vic tỏch v tinh ch saponin ton phn t Sn thự du (Cornus officinalis) Kt qu thu c hm lng saponin ton phn l 2,49%, cao hn so vi phng phỏp tỏch chit bng dung mụi hu c l 2,19% Nghiờn... bng ht D101, hm lng phn trm ca tng saponin/ cn tng t 26,2% lờn n 83% [26] Gn vi loi m chỳng ta ang tin hnh nghiờn cu nht, nm 2006, mt nhúm nghiờn cu thuc trng i hc Jiangsu Trung Quc ó nghiờn cu vic tinh ch tng saponin triterpenoid trong DTCLN bng ht nha hp ph Nhúm tỏc gi ó nghiờn cu dung lng hp ph saponin ca cỏc ht D101, NKA v AB-8 v sau ú l cỏc thụng s nh hng n quỏ trỡnh tinh ch Kt qu cho thy ht D101. .. kớnh l xp trung bỡnh ca D101 l khong 10 nm, do vy nờn cú kh nng ht D101 cú dung lng hp ph saponin cao c ng dng trong tỏch chit saponin Trong hai thp k gn õy, ht nha macroporous c nghiờn cu phỏt trin v s dng rt rng rói Cỏc ng dng ch yu ca ht nha ny l: lc ng, hp ph du khớ [15], x lý nc [17], tỏch v lm giu cỏc hot cht thiờn nhiờn, tinh ch cỏc sn phm sinh hc [30] Trong ú, ht nha D101 c ng dng tỏch phõn... cha triterpen saponin thuc nhúm oleanan (acid gymnemic v gymnema -saponin) v nhúm dammaran (gymnemaside) [32], [35] Ngoi ra, trong dch chit nc v dch chit cn ca DTCLNcũn cú flavon, anthraquinon, hentri-acontane, phytin, resin, acid tartaric, acid formic, acid butyric, lupeol, -amyrin, stigmasterol [23], [36], v cholorphyl, inositol, d-quercitol, alkaloid [10], [23] Trong ú, thnh phn to nờn tỏc dng... gi Nguyn Hng Giang ó ti u hoỏ quy trỡnh to ta GS4 t DTCLN v quy trỡnh thu c l nh sau: Dch chit bng EtOH 60% sau khi c loi nha bng dung mụi thớch hp, nh t t H2SO4 5% vo cao 1:2 cho ti pH=3, va nh va khuy u, dung dch s to ta (GS3), ly 9 tõm thu ta Ta to thnh tip tc ho tan trong dung dch KOH 0,1M ti pH=11 Nh t t H2SO4 5% cho ti pH=3, va nh va khuy u, dung dch s to ta (GS4), ly tõm thu v sy ta n khi lng... EtOH 50% tinh khit ca saponin sau tinh ch l 56,10% vi t l gii hp ph l 83,83% [39] Nhỡn chung, phng phỏp tỏch chit dung mụi thụng thng cú chi phớ cao, quỏ trỡnh phc tp, c bit l vic s dng chit xut bng dung mụi hu c rt khú ỏp dng trong sn xut thc t Quy trỡnh s dng nc ethanol v nha hp ph khụng ch n gin, tit kim m sn lng sn phm v cht lng cũn c ci thin ỏng k [21] V qua nhiu nghiờn cu ó chng minh, ht D101. .. mg/ml) 2.3.2.2 Phng phỏp chy ct - Chun b nha hp ph D101: Ngõm nha D101 trong 2 bed volume (BV) EtOH 96% trong 24 gi, sau khi trng n hon ton, ra li ht nha vi mt lt cn Cui cựng ra vi nc ct cho n khi ht mựi cn Bo qun ht trong nc ct [31] Cụng thc tớnh BV: BV (ml) = L x x r2 Trong ú: + L: Chiu cao khi ht (cm) + r: bỏn kớnh khi ht (cm) - Chun b ct: Ct thu tinh cú khoỏ v nỳt mi, ng kớnh v chiu di xỏc nh, ra... cht trong dch chit ca ht nha D101 2.3.4.1 Kho sỏt dung mụi phn hp ph Tin hnh: - Chit 100g bt dc liu theo mc 2.3.1.2 v x lý theo mc 2.3.2.1 - Cõn 50g nha ó x lý theo mc 2.3.2.2 cho vo cc cú m 1000 ml - ong 500 ml dch chit sau x lý cho vo cc cú m, ngõm 24 gi, thnh thong lc u - Sau 8 gi, nhi ht vo ct - Tin hnh ra gii vi ln lt cỏc phõn on nc, EtOH 25%, EtOH50%, EtOH 70%, EtOH 96% mi phõn on, trin khai... (2011), dch chit lỏ DTCLT Vit Nam cú tỏc dng h ng huyt trờn cỏ th chut bỡnh thng (24,07%) cao nht sau 4 gi, kộo di n 5 gi v trờn chut gõy tng ng huyt bi Streptozotocin (36,31%) sau 10 ngy cho ung dch chit Liu dựng thớch hp lỏ dõy thỡa canh l cn ton phn c pha thnh hn dch trong nc ct vi t l 1:1, vi liu 0,5ml/25g, tng ng vi 10g lỏ khụ/kg th trng [6] Kt qu th nghim cho thy tỏc dng h ng huyt ca dch chit