Nghiên cứu tính sạch mimosine từ cây mắc cỡ mimosa pudica linn và thử tác dụng kháng khuẩn

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TRẦN NGỌC CẨM THANH NGHIÊN CỨU TINH SẠCH MIMOSINE TỪ CÂY MẮC CỠ Mimosa pudica Linn VÀ THỬ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, THÁNG 12 NĂM 2009 LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn thầy cơ, gia đình bạn bè giúp đỡ, hỗ trợ em hoàn thành luận văn Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến: Cô Đống Thị Anh Đào tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm sống quý báu cho em suốt thời gian học, trình thực luận văn Q thầy phụ trách phịng thí nghiệm mơn Công Nghệ Thực Phẩm, cô Nguyễn Thị Nguyên tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt thời gian thực luận văn Quý thầy cô trường Đại Học Bách Khoa TpHCM quý thầy cô Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm giảng dạy, hướng dẫn để em có kiến thức hơm Các bạn học viên cao học giúp đỡ hỗ trợ suốt thời gian thực luận văn Các thành viên gia đình ln hỗ trợ, động viên tạo điều kiện thuận lợi cho hoàn thành luận văn Một lần em xin chân thành cảm ơn nhiều! TÓM TẮT Mimosine alkaloid độc có mắc cỡ Mimosa pudica Linn gây tác hại cho thể người động vật Cơ chế gây độc mimosine phức tạp liên quan đến ngăn cản trình chép DNA tế bào ức chế sinh tổng hợp protein Các nghiên cứu gần tận dụng chế gây độc mimosine để ứng dụng lĩnh vực y học khả chống lại tăng sinh mimosine tế bào ung thư nghiên cứu khả kháng loại vi khuẩn nấm da gây bệnh người mimosine Trong nghiên cứu chúng tơi khảo sát quy trình trích ly, tinh mimosine từ mắc cỡ đạt độ tinh cao để thử sơ khả kháng khuẩn mimosine Hàm lượng mimosine tất nghiên cứu xác định xác phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC (High performance liquid chromatography) Q trình trích ly mimosine nghiên cứu tối ưu với điều kiện trích ly tỉ lệ ngun liệu: dung mơi 0,046, nhiệt độ trích ly 66oC thời gian 140 phút đạt hiệu suất trích ly 95.04% Dịch trích mimosine nghiên cứu tinh sắc ký cột trao đổi ion khảo sát điều kiện lượng hạt nhựa cationit nhồi cột chiều dài cột 80mm, lượng dung môi rửa giải 40ml đạt độ tinh 87,28% Kết khảo sát sơ thử khả kháng khuẩn mimosine độ tinh 87,28% cho thấy vi khuẩn Staphylococcus aureus môi trường ni cấy nhạy với mimosine nồng độ 40µg/ml cho đường kính vịng kháng khuẩn 11,5mm ABSTRACT Mimosine, a toxic alkaloid presented in Mimosa pudica Linn affect human and animals The mechanisms of its toxicity are complicated and relate to inhibition of DNA replication and protein synthesis The recent researchs indicated the use of those mechanisms in medicine fields such as antiproliferative effect of mimosine in ovarian cancer or antidermatophytic and bacterial activity of mimosine We studied extraction and purification conditions of mimosine from Mimosa pudica Linn to get high purification rate for antibacterial activity premilinary test of mimosine Mimosine concentration in this study was determined by high performance liquid chromatography (HPLC) analysis method The mimosine extraction conditions were optimized at the ratio of material and solvent 0,046, the temperature 66oC in 140 minutes with gained mimosine extraction yield 95,04% The mimosine extract was carried out study of mimosine purification by ion exchange column chromatography The eluted mimosine gained purification rate 87,28% with the cationit volume equal to column length 80mm and elute volume 40ml The initial test of antibacterial activity of purified mimosine on Staphylococcus aureus indicated that Staphylococcus aureus sensitive with mimosine at concentration 40µg/ml and zone of inhibition 11,5mm LỜI MỞ ĐẦU Cây mắc cỡ loài mọc hoang nước ta, thân có chứa nhiều hoạt chất sinh học cần thiết cho thể Selen, Ca, Mg, P, flavonoid, acid ascorbic, beta carotene, acid béo oleic linoleic có ích cho thể bên cạnh có chứa loại alkaloid độc mimosine Cơ chế gây độc mimosine phức tạp gây nên rụng tóc, chậm phát triển, đục nhân mắt, bướu cổ, làm giảm khả sinh sản thể sống… Mặt khác, nghiên cứu gần giới tận dụng chế gây độc mimosine ức chế trình sinh tổng hợp protein ngăn cản chép DNA tế bào để ứng dụng lĩnh vực y học khả tiêu diệt số vi sinh vật, nấm gây bệnh viêm nhiễm da ngưởi khả ức chế phát triển số tế bào ung thư Kết nghiên cứu cho thấy mimosine có khả kháng số loại nấm da vi khuẩn gây viêm Trichophyton rubrum, Trichophyton mentaprophytes, Microsporum canis Epidermophyton floccosum, vi nấm Pityrosporum ovale, vi nấm Candida số vi khuẩn yếm khí gây viêm xoang Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Moraxella catarrhalis, Heamophylus influenzae Trong mimosine có khả ức chế hoàn toàn phát triển số loại nấm da Trichophyton ức chế mạnh với Staphylococcus aureus loài vi khuẩn Trong phạm vi nghiên cứu này, tiến hành khảo sát điều kiện trích ly, tinh mimosine từ nguồn nguyên liệu mắc cỡ mọc hoang bước đầu thử khả kháng khuẩn mimosine loại vi khuẩn Staphylococcus aureus MỤC LỤC -i- MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN TÓM TẮT ABSTRACT LỜI MỞ ĐẦU MỤC LỤC i DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vii CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Cây mắc cỡ 1.1.1 Phân loại thực vật 1.1.2 Đặc điểm hình thái: 1.1.3 Phân bố đặc tính sinh học 1.1.4 Đặc điểm sinh sản phát triển 1.1.5 Nhân giống thu hoạch 1.1.6 Thành phần hóa học 1.2 Độc tố Mimosine 1.2.1 Tính chất vật lý 1.2.2 Tính chất hóa học 1.2.3 Sự tổng hợp mimosine phân bố 11 1.2.4 Cơ chế gây độc mimosine 12 1.3 Giới thiệu trích ly phương pháp trích ly 15 1.3.1 Bản chất trình trích ly 15 1.3.2 Đặc điểm q trình trích ly 15 1.3.3 Phương pháp trích ly 15 1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới q trình trích ly 18 1.4 Phương pháp tinh mimosine 19 1.4.1 Nguyên tắc chung 19 GVHD: PGS TS ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO TRẦN NGỌC CẨM THANH MỤC LỤC - ii - 1.4.2 Ionit 19 1.4.3 Cơ chế trao đổi ion 20 1.5 Các phương pháp phân tích dịch mimosine sau tinh 21 1.5.1 Phương pháp sắc ký mỏng 21 1.5.2 Phương pháp hấp phụ quang phổ 22 1.5.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC 22 1.6 Các phương pháp thử kháng khuẩn 23 1.7 Kết cơng trình nghiên cứu liên quan nước giới 24 CHƯƠNG II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 Nguyên liệu 28 2.1.1 Cây mắc cỡ 28 2.1.2 Chất chuẩn L - Mimosine 28 2.2 Phương pháp nghiên cứu 29 2.2.1 Sơ đồ thí nghiệm 29 2.2.2 Sơ đồ quy trình cơng nghệ 30 2.2.3 Thuyết minh qui trình cơng nghệ 31 2.3 Nội dung nghiên cứu 31 2.3.1 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện trích ly mimosine đến hiệu suất trích ly mimosine từ mắc cỡ 31 2.3.1.1 Khảo sát phương pháp xác định hàm lượng mimosine tổng 31 2.3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng chế độ xử lý nguyên liệu đến hiệu suất trích ly mimosine 33 2.3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng hệ dung môi đến hiệu suất trích ly mimosine 35 2.3.1.4 Khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ nguyên liệu: dung môi đến hiệu suất trích ly mimosine 36 2.3.1.5 Khảo sát ảnh hưởng kích thước nguyên liệu đến hiệu suất trích ly mimosine 36 2.3.1.6 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ thời gian đến hiệu suất trích ly mimosine 38 GVHD: PGS TS ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO TRẦN NGỌC CẨM THANH MỤC LỤC - iii - 2.3.2 Tối ưu hóa trình trích ly mimosine 39 2.3.3 Nghiên cứu tinh mimosine 39 2.3.3.1 Mục đích 39 2.3.3.2 Phương pháp phân tích mức độ tinh 39 2.3.3.3 Phương pháp tinh sắc ký trao đổi ion 39 2.3.3.4 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả tinh 43 2.3.4 Khảo sát khả kháng khuẩn chế phẩm mimosine 45 2.4 Các phương pháp phân tích 46 2.4.1 Phương pháp xác định độ ẩm 46 2.4.2 Phương pháp xác định hàm lượng tro 46 2.4.3 Phương pháp xác định hàm lượng mimosine 47 CHƯƠNG III KẾT QUẢ - BÀN LUẬN 51 3.1 Khảo sát thành phần nguyên liệu 52 3.2 Khảo sát phương pháp xác định hàm lượng mimosine tổng 52 3.3 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly mimosine 53 3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng chế độ xử lý nguyên liệu đến hiệu suất trích ly mimosine 53 3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng hệ dung mơi trích ly đến hiệu suất trích ly mimosine 54 3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ nguyên liệu: dung môi đến hiệu suất trích ly mimosine 55 3.3.4 Khảo sát ảnh hưởng kích thước nguyên liệu đến hiệu suất trích ly mimosine 56 3.3.5 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ thời gian đến hiệu suất trích ly mimosine 57 3.4 Tối ưu hóa q trình trích ly mimosine 59 3.5 Nghiên cứu tinh mimosine 65 3.5.1 Khảo sát ảnh hưởng lượng hạt nhồi cột đến hiệu suất trao đổi mimosine 65 3.5.2 Khảo sát ảnh hưởng lượng dung môi rửa giải NH4OH đến hiệu suất thu hồi mimosine: 66 GVHD: PGS TS ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO TRẦN NGỌC CẨM THANH MỤC LỤC - iv - 3.5.3 Khảo sát ảnh hưởng pH đến độ tinh mimosine 68 3.5.3.1 Khảo sát giá trị pH thích hợp để loại tạp chất dịch trích mimosine 68 3.5.3.2 Khảo sát độ tinh mimosine sắc ký trao đổi ion sau xử lý pH 69 3.6 Khảo sát khả kháng khuẩn chế phẩm mimosine 70 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC GVHD: PGS TS ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO TRẦN NGỌC CẨM THANH DANH MỤC HÌNH -v- DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Các thành phần vô mắc cỡ Bảng 1.2: Thành phần chất béo có mắc cỡ (% chất khô) Bảng 1.3: Thành phần chất béo có hạt mắc cỡ Bảng 2.1: Số liệu nồng độ mimosine diện tích đỉnh 48 Bảng 3.1: Thành phần nguyên liệu 52 Bảng 3.2: Khảo sát thời gian trích ly tồn hàm lượng mimosine tổng nguyên liệu 52 Bảng 3.3: Ảnh hưởng chế độ xử lý nguyên liệu đến hiệu suất trích ly 53 Bảng 3.4: Ảnh hưởng hệ dung mơi trích ly đến hiệu suất trích ly mimosine 54 Bảng 3.5: Ảnh hưởng tỉ lệ ngun liệu: dung mơi đến hiệu suất trích ly mimosine 55 Bảng 3.6: Ảnh hưởng kích thước nguyên liệu đến hiệu suất trích ly mimosine 56 Bảng 3.7: Ảnh hưởng nhiệt độ thời gian đến hiệu suất trích ly mimosine 57 Bảng 3.8: Các mức yếu tố thực tối ưu 59 Bảng 3.9: Các thí nghiệm tiến hành tối ưu 60 Bảng 3.10: Các yếu tố chuyển qua hệ mã hóa 60 Bảng 3.11: Ma trận quy hoạch thực nghiệm nhân tố toàn phần 23 61 Bảng 3.12: Các hệ số phương trình hồi quy 61 Bảng 3.13: Thí nghiệm tâm 62 Bảng 3.14: Các giá trị phân vị Student, tj 62 Bảng 3.15: Các giá trị tính tốn 63 Bảng 3.16: Kết thực nghiệm tối ưu hóa 64 Bảng 3.17: Ảnh hưởng lượng hạt nhồi cột đến hiệu suất trao đổi mimosine 65 Bảng 3.18: Ảnh hưởng lượng dung môi rửa giải NH4OH đến hiệu suất thu hồi mimosine 66 Bảng 3.19: Nồng độ mimosine nồng độ phần trăm chất khơ hịa tan dịch lọc sau xử lý pH 68 GVHD: PGS TS ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO TRẦN NGỌC CẨM THANH ... bệnh người mimosine Trong nghiên cứu khảo sát quy trình trích ly, tinh mimosine từ mắc cỡ đạt độ tinh cao để thử sơ khả kháng khuẩn mimosine Hàm lượng mimosine tất nghiên cứu xác định xác phương... aureus loài vi khuẩn Trong phạm vi nghiên cứu này, tiến hành khảo sát điều kiện trích ly, tinh mimosine từ nguồn nguyên liệu mắc cỡ mọc hoang bước đầu thử khả kháng khuẩn mimosine loại vi khuẩn Staphylococcus... protein Các nghiên cứu gần tận dụng chế gây độc mimosine để ứng dụng lĩnh vực y học khả chống lại tăng sinh mimosine tế bào ung thư nghiên cứu khả kháng loại vi khuẩn nấm da gây bệnh người mimosine