Đánh giá hàm lượng aflatoxin b1 trong một số loại dược

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHAN THANH LAM Mã sinh viên: 1101278 ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG AFLATOXIN B1 TRONG MỘT SỐ LOẠI DƯỢC LIỆU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2016 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHAN THANH LAM Mã sinh viên: 1101278 ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG AFLATOXIN B1 TRONG MỘT SỐ LOẠI DƯỢC LIỆU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Lê Đình Chi TS Trần Cao Sơn Nơi thực hiện: Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia HÀ NỘI - 2016 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới TS Lê Đình Chi TS Trần Cao Sơn người thầy trực tiếp hướng dẫn, cho định hướng dành nhiều thời gian, tâm huyết bảo, giúp đỡ hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo, cán Viện Kiểm Nghiệm An Toàn Vệ Sinh Thực Phẩm Quốc Gia, 65 Phạm Thận Duật - Hà Nội tạo điều kiện quan tâm, giúp đỡ thời gian nghiên cứu tiến hành thực nghiệm vừa qua Tôi xin cảm ơn Ban giám hiệu, phòng ban, thầy cô giáo cán nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội – người dạy bảo giúp đỡ suốt năm học tập trường Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, anh chị em giúp đỡ động viên thời gian nghiên cứu Hà Nội, ngày 12 tháng năm 2016 Sinh viên Phan Thanh Lam MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan aflatoxin B1 1.1.1 Vài nét chung aflatoxin 1.1.2 Điều kiện sinh Aflatoxin B1 1.1.3 Cấu tạo hóa học tính chất aflatoxin B1 1.1.4 Cơ chế gây bệnh Aflatoxin B1: 1.1.5 Độc tính Aflatoxin B1 đến thể người: 1.2 Tổng quan sắc ký lực miễn dịch sắc ký lỏng – khối phổ (LC/MS): 1.2.1 Sắc ký lực miễn dịch: 1.2.2 Sắc ký lỏng khối phổ: 10 1.3 Các phương pháp phát định lượng aflatoxin B1: 14 1.4 Aflatoxin B1 dược liệu: 19 1.4.1 Hiện trạng: 19 1.4.2 Giới hạn aflatoxin B1 dược liệu: 20 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị: 22 2.1.1 Nguyên vật liệu: 22 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ: 23 2.2 Nội dung nghiên cứu: 24 2.2.1 Khảo sát điều kiện LC-MS/MS: 24 2.2.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu: 24 2.2.3 Thẩm định phương pháp: 24 2.2.4 Úng dụng phương pháp: 24 2.3 Phương pháp nghiên cứu: 24 2.3.1 Phương pháp kiểm nghiệm: 24 2.3.2 Thẩm định phương pháp: 25 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 29 3.1 Tối ưu hóa điều kiện tách xác định AFB1 LC-MS/MS: 29 3.1.1 Tối ưu hóa điều kiện khối phổ: 29 3.1.2 Lựa chọn điều kiện sắc ký lỏng: 31 3.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu: 33 3.3 Thẩm định phương pháp phân tích: 37 3.3.1 Tính chọn lọc/ đặc hiệu: 37 3.3.2 Giới hạn phát LOD giới hạn định lượng LOQ: 40 3.3.3 Khoảng tuyến tính: 41 3.3.4 Độ lặp lại độ thu hồi: 43 3.4 Kết phân tích aflatoxin B1 số dược liệu: 44 3.5 Bàn luận: 46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 Kết luận 48 Kiến nghị 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT AF Aflatoxin AFB1 Aflatoxin B1 AFB2 Aflatoxin B2 AFG1 Aflatoxin G1 AFG2 Aflatoxin G2 AOAC Hiệp hội nhà hóa phân tích hóa học (Association of Official Analytical Chemists) CE CE/MS Năng lượng va chạm (Collision Energy) Điện di mao quản - khối phổ (Capillary Electrophoresis - Mass Spectrometry) CV% Hệ số biến thiên (Coefficient of Variation) ELISA Kỹ thuật miễn dịch liên kết với enzyme (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) ESI Ion hóa tia điện (Electrospray Ionization) G1P Glucose – – phosphate G6P Glucose – – phosphate GSH Glutathion HCC Ung thư biểu mô tế bào gan (Hepatocellular carcinoma) HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) IARC Cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế (International Agency for Research on Cancer) LC-MS Sắc ký lỏng khối phổi (Liquid Chromatography Mass Spectrometry) LC-MS/MS Sắc ký lỏng khối phổ hai lần (Liquid Chromatography tandem Mass Spectrometry) LOD Giới hạn định tính (Limit of detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of quantitation) MeOH Methanol PBS Dung dịch đệm phosphat (Phosphate-Buffered Saline) R% Độ thu hồi (Recovery) RP-HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao pha đảo (Reversed - phase High Performance Liquid Chromatography) RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) SD Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) SPE Chiết pha rắn (Solid phase extract) TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography) TLTK Tài liệu tham khảo DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Bảng 1.1 Một số tính chất vật lý aflatoxin B1 Bảng 1.2 Một số phương pháp phân tích aflatoxin 17 Bảng 1.3 Một số khảo sát aflatoxin dược liệu chế phẩm từ dược liệu thực Bảng 1.4 Quy định hàm lượng aflatoxin tối đa dược liệu chế phẩm từ dược liệu số quốc gia Bảng 1.5 Giới hạn aflatoxin B1 số thực phẩm theo quy định Bộ Y tế Bảng 2.1 Các mẫu dược liệu phân tích Bảng 2.2 Độ lặp lại tối đa chấp nhận nồng độ khác theo AOAC 19 20 21 22 28 Bảng 2.3 Quy định độ thu hồi hội đồng châu Âu 28 Bảng 3.1 Kết lựa chọn ion phân tử ion sản phẩm AFB1 29 Bảng 3.2 Các chương trình gradient khảo sát 32 Bảng 3.3 Kết khảo sát quy trình xử lý mẫu 35 Bảng 3.4 Kết khảo sát tỷ lệ dung môi chiết 36 Bảng 3.5 Kết phân mảnh aflatoxin B1 38 Bảng 3.6 Kết xác định LOD, LOQ 40 Bảng 3.7 Kết phân tích dãy dung dịch chuẩn có nồng độ từ 0,3 µg/L đến 100 µg/L 42 Bảng 3.8 Kết đánh giá độ tuyến tính 43 Bảng 3.9 Kết xác định độ lặp lại độ thu hồi 43 Bảng 3.10 Kết hàm lượng afltoxin B1 số mẫu dược liệu 45 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Hình 1.1 Hình 1.2 Tên hình Công thức cấu tạo aflatoxin B1 Aflatoxin B1 chuyển thành aflatoxin B2α môi trường acid Trang Hình 1.3 Sơ đồ khối máy khổi phổ 12 Hình 1.4 Bộ phân tích tứ cực chập ba 13 Hình 3.1 Phổ đồ phân mảnh aflatoxin B1 30 Hình 3.2 Sắc ký đồ thu sử dụng gradient 32 Kết khảo sát lựa chọn quy trình chiết mẫu: Hình 3.3 (A) - Sắc ký đồ mẫu chiết quy trình 1; (B) - Sắc ký đồ mẫu chiết quy trình 2; 35 (C) - Sắc ký đồ mẫu chiết quy trình Hình 3.4 Hình 3.5 Sắc ký đồ thu sử dụng dung môi chiết MeOH : H2O (8 : 2) Sắc ký đồ thu sử dụng dung môi chiết MeOH : H2O (6 : 4) 36 36 Hình 3.6 Sắc ký đồ mẫu trắng 38 Hình 3.7 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn aflatoxin B1 10 µg/L 39 Hình 3.8 Sắc ký đồ mẫu trắng thêm chuẩn 39 Hình 3.9 Sắc ký đồ mức nồng độ LOD 0,1 µg/L 40 Hình 3.10 Sắc ký đồ mức nồng độ LOQ 0,3 µg/L 41 Hình 3.11 Đường chuẩn Aflatoxin B1 42 ĐẶT VẤN ĐỀ Các độc tố vi nấm (mycotoxin) nhóm chất chuyển hóa sinh số loài nấm mốc có khả gây độc cho động vật người Có nhiều loại mycotoxin phải kể đến aflatoxin – độc tố vi nấm sản sinh tự nhiên số loài nấm mốc thuộc chi Aspergillus, có nhiều độc tính động vật người, đặc biệt có khả gây ung thư [20] Trong nhóm aflatoxin, aflatoxin B quan trọng nhất, nguyên nhân chủ yếu bệnh lý cấp mạn tính aflatoxin xác định nguyên nhân gây ung thư biểu mô tế bào gan (HCC) - bệnh lý ác tính tế bào gan [17] Các loài Aspergillus thường sinh trưởng sản sinh aflatoxin điều kiện nhiệt độ độ ẩm cao nên nước có khí hậu nhiệt đới Việt Nam số nước châu Á thường có tỷ lệ nhiễm aflatoxin cao Đối tượng sản phẩm bị nhiễm aflatoxin từ nấm mốc đa dạng, có dược liệu sản phẩm từ dược liệu Việt Nam nước có y học cổ truyền phát triển, dược liệu sử dụng rộng rãi có vai trò quan trọng chăm sóc sức khỏe người Tuy nhiên, khí hậu Việt Nam phù hợp cho sinh sản nấm mốc, điều kiện bảo quản không đảm bảo, dược liệu chế phẩm từ dược liệu bị nhiễm aflatoxin B1 gây nguy hiểm cho người sử dụng Tuy nhiên chưa có quy chế quy định kiểm soát hàm lượng aflatoxin B1 dược liệu Vì vậy, tiến hành nghiên cứu “Đánh giá hàm lượng aflatoxin B1 số loại dược liệu” với mục tiêu là: Xây dựng phương pháp xác định aflatoxin B1 dược liệu Áp dụng phương pháp đánh giá mức độ nhiễm Aflatoxin B1 số loại dược liệu Hà Nội 41 Hình 3.9.Sắc ký đồ mức nồng độ LOQ Nhận xét: Kết cho thấy phương pháp có giới hạn phát thấp (0,2 µg/Kg), nhỏ nồng độ aflatoxin B1 giới hạn dược liệu chế phẩm từ dược liệu quy định Việt Nam nhiều nước giới [2], [12], [14] Vì phương pháp có giới hạn phát giới hạn định lượng đáp ứng yêu cầu 3.3.3 Khoảng tuyến tính: Để xác định khoảng tuyến tính, tiến hành pha dãy chuẩn có nồng độ từ 0,3 µg/L đến 100,0 µg/L đo máy LC-MS/MS thu kết sau: 42 Bảng 3.7: Kết phân tích dãy dung dịch chuẩn có nồng độ từ 0,3 µg/L đến 100 µg/L Nồng độ dung dịch chuẩn (µg/L) Diện tích pic (cps.s) Nồng độ tính theo đường chuẩn (µg/L) Độ xác Độ chệch (%) (%) 0,3 57 0,35 115,2 15,2 0,5 84 0,50 100,6 0,6 1,0 156 0,92 92,0 -8,0 2,0 330 1,93 96,5 - 3,5 10,0 1487 8,64 86,4 -13,6 20,0 3760 21,83 109,2 9,2 50,0 8702 50,51 101,0 1,0 100,0 17076 99,11 99,1 -0,9 Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ tuyến tính nồng độ chất phân tích diện tích pic sắc ký thu được: Hình 3.11: Đường chuẩn Aflatoxin B1 43 Bảng 3.8: Kết đánh giá độ tuyến tính Phương trình đường chuẩn y = 172,313825x-2,359734 R 0,999 Nhận xét: Kết thực nghiệm cho thấy khoảng nồng độ từ 0,3 µg/L đến 100,0 µg/L, nồng độ aflatoxin B1 diện tích pic sắc ký tuyến tính với hệ số tương quan tuyến tính R = 0,999, đạt yêu cầu 0,995 ≤ R ≤ Độ chệch nồng độ tính lại theo đường chuẩn không vượt ±15% với nồng độ không vượt ±20% với nồng độ LOQ 3.3.4 Độ lặp lại độ thu hồi: Để xác định độ lặp lại độ thu hồi, tiến hành phân tích mẫu dược liệu Cát biết sơ aflatoxin B1 thêm chuẩn nồng độ µg/L, µg/L µg/L (nồng độ tính dịch chiết cuối cùng) Bảng 3.9: Kết xác định độ lặp lại độ thu hồi 6 Diện tích pic (cps.s) 462 492 458 465 540 550 Trung bình 922 904 1032 1007 804 822 Trung bình Nồng độ chuẩn Nồng độ chuẩn tìm lại (µg/L) thêm (µg/L) 1,80 2,00 1,92 2,00 1,78 2,00 1,81 2,00 2,11 2,00 2,15 2,00 3,67 3,60 4,12 4,01 3,19 3,26 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 RSD (%) 9,6 15,0 Độ thu hồi (%) 90,0 96,0 89,0 90,5 105,5 107,5 96,4 91,8 89,9 103,0 100,4 79,8 81,5 91,1 44 2037 2124 1653 1978 1799 2038 Trung bình 8,21 8,57 6,65 7,98 7,24 8,22 8,00 8,00 8,00 8,00 8,00 8,00 9,6 107,1 83,1 99,7 90,6 102,7 95,9 97,7 Nhận xét: Kết thực nghiệm (bảng 3.9) cho thấy mức nồng độ tiến hành đánh giá độ lặp lại độ (tỷ lệ thu hồi), độ lệch chuẩn tương đối phương pháp không vượt 21% hiệu suất thu hồi nằm khoảng 91- 98%, nằm giới hạn cho phép AOAC Kết thẩm định cho thấy phương pháp có đủ độ tin cậy, độ nhạy tính xác để ứng dụng phân tích aflatoxin B dược liệu 3.4 Kết phân tích aflatoxin B1 số dược liệu: Dựa vào phương pháp xây dựng thẩm định, tiến hành xác định hàm lượng aflatoxin B1 số dược liệu mua từ cửa hàng kinh doanh thuốc đông dược chợ Đồng Tâm, chợ Ninh Hiệp, phố Lãn Ông (Hà Nội) Kết phân tích 25 mẫu dược liệu 14 loại dược liệu bảng sau: 45 Bảng 3.10: Kết hàm lượng afltoxin B1 số mẫu dược liệu TT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Tên dược liệu Câu kỳ tử Liên nhục Hoài sơn Thổ phục linh Đào nhân Hạnh nhân Ý dĩ Cam thảo Trần bì Cát Diệp hạ châu Địa điểm lấy mẫu Hàm lượng (µg/Kg) Chợ Ninh Hiệp 3,73 Phố Lãn Ông - Chợ Ninh Hiệp 1,42 Chợ Đồng Tâm - Chợ Ninh Hiệp 1,04 Chợ Ninh Hiệp - Chợ Ninh Hiệp - Phố Lãn Ông - Chợ Ninh Hiệp - Phố Lãn Ông - Chợ Ninh Hiệp - Chợ Đồng Tâm - Chợ Ninh Hiệp - Phố Lãn Ông - Chợ Ninh Hiệp - Chợ Đồng Tâm - Chợ Ninh Hiệp - Chợ Đồng Tâm - Phố Lãn Ông - Chợ Ninh Hiệp - Chợ Ninh Hiệp - Phố Lãn Ông - 23 Thảo Chợ Ninh Hiệp - 24 Táo đen Phố Lãn Ông - 25 Cúc hoa Phố Lãn Ông - *(-): Không phát 46 Kết phân tích cho thấy có 3/25 mẫu dược liệu kiểm tra bị nhiễm aflatoxin B1, chiếm khoảng 12%, với hàm lượng dao động khoảng từ 1,04 – 3,73 µg/Kg Trong có mẫu dược liệu có hàm lượng aflatoxin B 3,73 µg/Kg, vượt giới hạn aflatoxin B1 cho phép dược liệu theo quy định vài quốc gia khu vực [31], [14] 3.5 Bàn luận: Dựa vào tài liệu tham khảo thực nghiệm, xây dựng thẩm định phương pháp phân tích aflatoxin B số dược liệu Mẫu phân tích chiết cột chiết pha rắn sử dụng vật liệu lực miễn dịch phân tích phương pháp sắc ký lỏng – khối phổ LC-MS/MS với điều kiện sau: - Cột sắc ký C18 Acquity UPLC BEH (2,1×100mm, 1,7µm) - Pha động: hỗn hợp methanol – dung dịch amoni acetat 10 mM với tỷ lệ điều chỉnh theo chương trình gradient dung môi - Tốc độ dòng 0,4 mL/phút - Detector khối phổ sử dụng kỹ thuật ion hóa ESI (+) sử dụng Phương pháp có độ nhạy độ đặc hiệu cao, đáp ứng yêu cầu AOAC, phù hợp để phân tích aflatoxin B dược liệu Trong trình xây dựng phương pháp, lựa chọn phương pháp tốn dung môi hữu cơ, hạn chế sử dụng dung môi hữu có hại Tuy nhiên, chưa có điều kiện khảo sát nhiều loại mẫu cột lực miễn dịch có giá thành cao hạn chế nghiên cứu Dựa vào phương pháp xây dựng thẩm định, phân tích aflatoxin B1 số mẫu thuốc đông dược mua địa bàn Hà Nội thu kết 3/25 (chiếm 12%) mẫu nhiễm aflatoxin B 1, có mẫu có hàm lượng lớn µg/Kg (giới hạn tối đa AFB1 số loại dược 47 liệu theo quy định Dược điển Châu Âu [14]) Số lượng mẫu kiểm tra chưa hệ thống, nhằm đánh giá sơ hàm lượng aflatoxin B1 số dược liệu Khí hậu thời tiết Hà Nội mùa xuân, hè ẩm mưa nhiều, phù hợp cho phát triển nấm mốc sản sinh aflatoxin B1 nên áp dụng phương pháp để đánh giá toàn diện tình trạng nhiễm aflatoxin B1 dược liệu để có phương hướng giải phù hợp 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Qua trình thực đề tài, đạt mục tiêu đề ra: Xây dựng quy trình phân tích aflatoxin B dược liệu, cụ thể sau:  Xử lý mẫu: - Dung môi chiết: hỗn hợp dung môi methanol – nước 6:4 (tt:tt) - Làm cột chiết pha rắn lực miễn dịch Aflatest  Điều kiện LC-MS/MS để phân tích aflatoxin B1: - Pha tĩnh: cột C18 Acquity UPLC BEH (2,1×100mm, 1,7µm) (Waters, Mỹ) - Pha động: amoni acetat methanol, chế độ gradient - Phân tích MS/MS nguồn ion hóa ESI (+) sử dụng ion sơ cấp m/z = 313  Thẩm định phương pháp khẳng định phương pháp đáp ứng yêu cầu phân tích aflatoxin B1 dược liệu, kết sau: - Phương pháp có độ đặc hiệu/chọn lọc phù hợp với aflatoxin B1 - Có tương quan tuyến tính đáp ứng phân tích nồng độ khoảng nổng độ từ 0,3 µg/L đến 100 µg/L - Giới hạn phát LOD 0,1 µg/L (0,2 µg/kg mẫu), giới hạn định lượng 0,3 µg/L (0,6 µg/kg mẫu), thấp giới hạn cho phép Aflatoxin B1 dược liệu - Phương pháp có độ lặp lại độ thu hồi đạt yêu cầu: CV% < 21%, hiệu suất thu hồi từ 90 – 108% Áp dụng phương pháp xây dựng thẩm định để đánh giá hàm lượng aflatoxin B1 số dược liệu: Dựa vào quy trình phân tích trên, tiến hành phân tích aflatoxin B1 25 mẫu 14 loại dược liệu Kết phân tích cho thấy có 3/25 mẫu 49 dương tính với aflatoxin B1 (chiếm 12%) có mẫu có hàm lượng lớn µg/kg (giới hạn tối đa AFB1 số loại dược liệu theo quy định Dược điển Châu Âu [14]) Kiến nghị - Mở rộng đối tượng nghiên cứu: nghiên cứu phân tích đồng thời aflatoxin, nghiên cứu độc tố vi nấm khác dược liệu - Khảo sát số lượng mẫu lớn để sàng lọc đối tượng dược liệu có tỷ lệ nhiễm aflatoxin B1 cao - Khảo sát sâu đối tượng dược liệu có nguy nhiễm aflatoxin B1 cao để có phương hướng khắc phục, xử lý TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt GS.TS Trần Tử An (2007), Hóa phân tích, Nhà xuất Y học, Hà Nội Tr.107-316 Bộ Y tế (2011), Thông tư Ban hành Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia giới hạn ô nhiễm hóa học thực phẩm Số 02/2011/TT-BYT Tr.20-22 Lê Thị Hồng Hảo (2014), Khảo sát mức độ nhiễm mycotoxin ngô lạc tỉnh Bắc Giang, Luận văn tốt nghiệp Dược sĩ Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội Tr.18-19 GS.TS Từ Quang Hiển, GS.TS Đậu Ngọc Hào, TS Lê Thị Ngọc Diệp, TS Từ Trung Kiên (2012), Độc tố thức ăn chăn nuôi, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Tr.8-10 Nguyễn Đinh Nga, Nguyễn Thị Kiều Khanh, Văn Phố (2012), "Khảo sát mức độ nhiễm nấm aflatoxin B1 (AFB1) số mẫu dược liệu bán quận – thành phố Hồ Chí Minh", Y Học TP Hồ Chí Minh, tập 16 số Tr.93– 96 TS Trần Cao Sơn (2010), Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật, Nhà xuất Khoa Học Kỹ Thuật, Hà Nội, Tr.5-35 Tiếng Anh Agag BI (2004), "Mycotoxins in foods and feeds: 1-aflatoxins", Univ Bull Env Res, Số 7.(1) pp.173–205 Alejandro Espinosa-Calderón, Irineo Torres-Pacheco, Jesús Roberto MillánAlmaraz, Luis Miguel Contreras-Medina, Rafael Francisco Muñoz-Huerta, Ramón Gerardo Guevara González (2011), "Methods for detection and quantification of aflatoxins", Aflatoxins – Detect Meas Control, INTECH Open Access Publisher, Pp.109-123 Anna Yu Kolosova, Won-Bo Shim, Zheng-You Yang, Sergei A Eremin, Duck-Hwa Chung (2006), "Direct competitive ELISA based on a monoclonal antibody for detection of aflatoxin B1 Stabilization of ELISA kit components and application to grain samples", Anal Bioanal Chem, Số 384.(1), pp.286– 294 10 Bbosa GS, A Lubega, David B Kyegombe, David Kitya, Jasper OgwalOkeng, William W Anokbonggo (2013), "Review of the biological and health effects of aflatoxins on body organs and body systems", Aflatoxins - Recent Adv Future Prospects, Pp.239-256 11 Bbosa GS, Kitya D, Odda J, Ogwal-Okeng J (2013) "Aflatoxins metabolism, effects on epigenetic mechanisms and their role in carcinogenesis", Health, 5, pp.14-34 12 Barbara S Delmulle, Sarah M D G De Saeger, Liberty Sibanda, Ildiko Barna-Vetro, Carlos H Van Peteghem (2005), "Development of an Immunoassay-Based Lateral Flow Dipstick for the Rapid Detection of Aflatoxin B1 in Pig Feed", J Agric Food Chem, Số 53.(9), pp.3364–3368 13 D Dhanasekaran, A Panneerselvam, N Thajuddin, S Shanmugapriya (2011) "Aflatoxins and aflatoxicosis in human and animals", Aflatoxins – Biochem Mol Biol, INTECH, pp 221–244 14 Elena DL (2012), "Pharmacognostic methods for analysis of herbal drugs, according to European pharmacopoeia", Promis Pharm, pp 37–62 15 Goldblatt L (2012), Aflatoxin: scientific background, control, and implications, Elsevier, Dutch 16 Halil Tosun, Recep Arslan (2013), "Determination of Aflatoxin B1 Levels in Organic Spices and Herbs" Sci World J, số 2013, pp.1-4 17 Hamid AS, Tesfamariam IG, Zhang Y, Zhang ZG (2013), "Aflatoxin B1induced hepatocellular carcinoma in developing countries: Geographical distribution, mechanism of action and prevention (Review)", Oncology Letter, Số 5.(4), pp.1087–1092 18 Hilal Colak, Enver Baris Bingol, Hamparsun Hampikyan, Bulent Nazli (2006), "Determination of aflatoxin contamination in red-scaled, red and black pepper by ELISA and HPLC", J Food Drug Anal, Số 14.(3), pp.292–296 19 Humans IWG on the E of CR to, Organization WH, Cancer IA for R on (2002), Some traditional herbal medicines, some mycotoxins, naphthalene and styrene, World Health Organization 20 Jonathan H Williams, Timothy D Phillips, Pauline E Jolly, Jonathan K Stiles, Curtis M Jolly, Deepak Aggarwal (2004), "Human aflatoxicosis in developing countries: a review of toxicology, exposure, potential health consequences, and interventions", Am J Clin Nutr Số 80.(5), pp.1106–1122 21 Klaus Reif, Wolfgang Metzger (1995), "Determination of aflatoxins in medicinal herbs and plant extracts", J Chromatogr A Số 692.(1–2), pp.131– 136 22 Laura Anfossi, Gilda D’Arco, Marianna Calderara, Claudio Baggiani, Cristina Giovannoli, Gianfranco Giraudi (2011), "Development of a quantitative lateral flow immunoassay for the detection of aflatoxins in maize", Food Addit Contam: Part A, Số 28.(2), pp.226–34 23 Laura Mejía-Teniente, Angel María Chapa-Oliver, Irineo Torres-Pacheco, Moises Alejandro Vazquez-Cruz, Ramón Gerardo Guevara-González (2011), "Aflatoxins Biochemistry and Molecular Biology-Biotechnological Approaches for Control in Crops", Aflatoxins – Detect Meas Control, INTECH Open Access Publisher, pp 317–343 24 Lina Liu, Hongyu Jin, Lei Sun, Shuangcheng Ma, Ruichao Lin (2012), "Determination of Aflatoxins in Medicinal Herbs by High-performance Liquid Chromatography–Tandem Mass Spectrometry", Phytochem Anal, Số 23.(5), pp.469–476 25 Luciana de Castro, Eugenia Azevedo Vargas (2001), "Determining aflatoxins B1, B2, G1 and G2 in maize using florisil clean up with thin layer chromatography and visual and densitometric quantification", Food Sci Technol Camp, Số 21.(1), pp.115–122 26 Magda Carvajal, Pável Castillo (2002), "Effects of aflatoxins contaminating food on human health", Trop Biol Conserv Manag, Số 3, pp.1–6 27 Mei-Hua Yang, Jian-Min Chen, Xue-Hui Zhang (2005), "Immunoaffinity column clean-up and liquid chromatography with post-column derivatization for analysis of aflatoxins in traditional Chinese medicine", Chromatographia, Số 62.(9-10), pp.499–504 28 Mustafa Ardic, Yakup Karakaya, Mustafa Atasever, Hisamettin Durmaz (2008), "Determination of aflatoxin B1 levels in deep-red ground pepper (isot) using immunoaffinity column combined with ELISA", Food Chem Toxicol, Số 46.(5), pp.1596–1599 29 Nadeem Ahmad Siddique, Mohd Mujeeb, Sayeed Ahmad, Bibhu P Panda, Mohd Makhmoor (2013), "Determination of aflatoxins in medicinal plants by high-performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry", J Pharm Sci, Số 16.(2), pp.321–330 30 Organization WH, others (2007), WHO guidelines for assessing quality of herbal medicines with reference to contaminants and residues Geneva: World Health Organization 31 Steinhoff B (2003), Laws and regulation on medicinal and aromatic plants in Europe, Acta Hortic, 678, pp.13-22 32 Trucksess Mw, Brumley Wc, Nesheim S (1983), "Rapid quantitation and confirmation of aflatoxins in corn and peanut butter, using a disposable silica gel column, thin layer chromatography, and gas chromatography/mass spectrometry", J - Assoc Off Anal Chem, Số 67.(5), pp.973–975 33 Turner NW, Sreenath Subrahmanyam, Sergey A Piletsky (2009), "Analytical methods for determination of mycotoxins: a review", Analytica Chimica Acta, Số 632.(2) pp.168–180 34 Vicam (1999), Afla Test Instruction Manual, pp.28-87 35 Vikash Sewram, Gordon S Shephard, Lize van der Merwe, Thomas V Jacobs (2006), "Mycotoxin contamination of dietary and medicinal wild plants in the Eastern Cape Province of South Africa", J Agric Food Chem, Số 54.(15) pp.5688–5693 36 Wogan GN (1966), "Chemical nature and biological effects of the aflatoxins", Bacteriol Rev, Số 30.(2), pp.460-470 37 Wongwiwat Tassaneeyakul, Ebrahim Razzazi-Fazeli, Supatra Porasuphatana, Josef Bohm (2004), "Contamination of Aflatoxins in Herbal Medicinal Products in Thailand", Mycopathologia, Số 158.(2), pp.239–244 38 Wu F, Stacy SL, Kensler TW (2013), "Global risk assessment of aflatoxins in maize and peanuts: Are regulatory standards adequately protective?", Toxicol Sci Số 135.(1), pp.251–259 39 Xuehui Zhang, Huiling Liu, Jianmin Chen (2005), "Immunoaffinity column cleanup with liquid chromatography using post-column bromination for aflatoxins in medicinal herbs and plant extracts", J Chromatography Sci Số 43.(1), pp.47–51 [...]... mẫu dược liệu có nhiễm AFB1 với hơn 50% có hàm lượng hơn 5 ppb Diệp hạ châu, liên nhục là các dược liệu có tỷ lệ nhiễm cao [5] 1.4.2 Giới hạn aflatoxin B1 trong dược liệu: Thế giới: Tại EU, không có quy định cụ thể giới hạn aflatoxin B1 trong sản phẩm thuốc từ dược liệu nói chung Dược điển châu Âu (chương 2.1.18) quy định giới hạn AFB1 cho một số loại dược liệu là 2 µg/Kg [14] Bảng 1.4: Quy định hàm lượng. .. hàm lượng aflatoxin tối đa trong dược liệu và chế phẩm từ dược liệu ở một số quốc gia [30], [31] Giới hạn AFB1 Giới hạn tổng AFB1, AFB2, (µg/Kg) AFG1, AFG2 (µg/Kg) Đức 2 4 Argentina 5 20 Quốc gia Việt Nam: Ở Việt Nam hiện chưa có quy định nào quy định hàm lượng tối đa Aflatoxin B1 trong dược liệu Thông tư 02/2011/TT-BYT quy định giới hạn ô nhiễm aflatoxin B1 trong một số thực phẩm sử dụng như dược liệu... nhiễm aflatoxin 1.4.1 Hiện trạng: Nhiễm aflatoxin là một vấn đề toàn cầu và nhiều khảo sát đã được tiến hành ở nhiều vùng trên thế giới để kiểm tra hàm lượng aflatoxin trong dược liệu và sản phẩm từ dược liệu Bảng 1.3: Một số khảo sát aflatoxin trong dược liệu và chế phẩm từ dược liệu đã thực hiện TT Năm 1 2004 2 2006 3 2012 Quốc gia Aflatoxin Thái AFB1, AFB2, Lan AFG1, AFG2 Nam Phi AFB1 Trung AFB1,... Aceton (9:1) *AF tổng: Aflatoxin B1, Aflatoxin B2, Aflatoxin G1, Aflatoxin G2 82 2 [32] 19 1.4 Aflatoxin B1 trong dược liệu: Không chỉ thực phẩm và thức ăn chăn nuôi mà dược liệu và các chế phẩm từ dược liệu cũng là những đối tượng có thể bị nhiễm aflatoxin Sự tổng hợp aflatoxin thích hợp trên những cơ chất giàu năng lượng dạng tinh bột hoặc trên các loại hạt có dầu nên những dược liệu như cát căn,... polyketide Ngày nay, người ta đã xác định được khoảng 20 loại aflatoxin trong đó 6 loại aflatoxin quan trọng nhất lần lượt là B1, B2, M1, M2, G1 và G2 [38] Aflatoxin B1 là loại aflatoxin độc nhất và phổ biến nhất, chiếm 60-80% tổng số aflatoxin nhiễm độc trong lương thực thực phẩm Thông thường nếu không có AFB1 thì cũng sẽ không có AFB2, AFG1 và AFG2 [7], [13] Aflatoxin được ghi nhận gây ra nhiều bệnh và tổn... Nam Phi AFB1 Trung AFB1, AFB2, Quốc AFG1, AFG2 Số mẫu Hàm nhiễm lượng aflatoxin (%) (µg/Kg) 5/28 (18,0) 1,7 – 14,3 [37] 8/30 (26,7) 8 – 1533 [35] 27/174 (16) 0,05 290,80 TLTK [27] Tại Việt Nam, aflatoxin trong dược liệu chưa được kiểm soát chặt chẽ Một khảo sát năm 2012 trên tạp chí Y học thành phố Hồ Chí Minh khảo sát mức độ nhiễm aflatoxin trong một số dược liệu bán tại quận 5 – thành phố Hồ 20 Chí... [36]: Aflatoxin B1 không bền khi để dưới ánh sáng (đặc biệt là tia UV) và có mặt oxy Tuy nhiên tinh thể aflatoxin rất bền vững khi không có ánh sáng tác động, kể cả ở nhiệt độ 100oC Dung dịch aflatoxin trong chloroform hoặc benzen ổn định nhiều năm nếu được giữ lạnh trong bóng tối Aflatoxin B1 không bền trong môi trường pH < 3 hoặc pH > 10 Vòng lacton trong công thức khiến aflatoxin B1 dễ bị thủy phân trong. .. ứng trả lại aflatoxin ban đầu Trong môi trường acid, aflatoxin B 1 bị chuyển thành aflatoxin B2α do phản ứng cộng nước vào liên kết đôi trên vòng furan dưới xúc tác acid Aflatoxin dễ bị oxi hóa bởi các tác nhân oxi hóa như hydrogen peroxide, ozon… và mất huỳnh quang 6 Hình 1.2: Aflatoxin B1 chuyển thành aflatoxin B2α trong môi trường acid 1.1.4 Cơ chế gây bệnh của Aflatoxin B1: Aflatoxin B1 được chuyển... phần trong mẫu có nhiều thành phần 1.3 Các phương pháp phát hiện và định lượng aflatoxin B1:  Tách chiết aflatoxin B1: Phát hiện và định lượng aflatoxin yêu cầu quy trình tách chiết hiệu quả Aflatoxin thường tan trong các dung môi phân cực protic như methanol, acetone, chloroform, acetonitril Vì vậy, tách chiết aflatoxin thường sử dụng các dung môi hữu cơ: methanol hoặc acetonitril hoặc aceton và lượng. .. mất hoàn toàn nhiễm sắc thể; gây ung thư trong đó HCC là loại ung thư thường gặp do aflatoxin B1 [10], [13] Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng những thức ăn nhiễm độc Aflatoxin B1 là yếu tố nguy cơ chính dẫn đến ung thư gan IARC phân loại Aflatoxin B1 là tác nhân gây HCC nhóm I [20] Cơ chế HCC do AFB1 được chứng minh là do đột biến gen p53 – gen ức chế khối u Một số nghiên cứu tại Trung Quốc và Nam Phi