Xây dựng panel lympo và bộ sinh phẩm chẩn đoán kháng nguyên hòa hợp mô lớp 1
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y KHOA Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Tổng quan tài liệu Phương pháp nghiên cứu Kết - Bàn luận Kết luận - Kiến nghị MỞ ĐẦU VAI TRỊ CỦA PHÂN TỬ HLA HLA: (Human Lymphocyte Antigen) hệ hoà hợp mô chủ yếu người, có vai trò chủ yếu: * Ghép tạng * Chẩn đoán mối quan hệ huyết thống * Nhân chủng học * HLA bệnh lý… MỞ ĐẦU KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH PHÂN TỬ HLA & GIÁ THÀNH Kỹ thuật Độc tế bào PCR MỞ ĐẦU CHIẾT TÁCH KHÁNG HUYẾT THANH KHÁNG HLA Phụ nữ mang thai Người truyền máu nhiều lần Người sau ghép tạng… MỤC TIÊU * Xác đònh phân tử HLA lớp I 150 người tình nguyện hiến mô kỹ thuật PCR-SSO * Thiết lập dàn panel HLA lớp I * Sử dụng dàn panel để phân tích diện kháng thể kháng HLA lớp I, từ huyết thanh, chiết tách máu sản phụ hứng sau sổ * Phân lập huyết thanh, tạo mẫu huyết đơn đặc hiệu dùng để xác đònh phân tử HLA lớp I kỹ thuật độc tế bào TỔNG QUAN Y VĂN NHÁNH NGẮN NST HLA nằm cánh ngắn NST số TỔNG QUAN Y VĂN Human MHC Class I α -chain and β -2m MHC Class II α and β chains α Màng tế bào β HLA TRONG DI TRUYỀN VAI TRỊ HLA TRONG Y HỌC Trong ghép tạng Bệnh học Quan hệ huyết thống Pháp Y Nhân chủng học… BÀN LUẬN So sánh tỷ lệ kháng thể kháng HLA-A với kiể hình HLA-A người Việt Nam tác giả Bạch Khánh Hòa (BKH), Bạch Quốc Tuyên (BQT) 91 người Kinh Việt Nam (KVN) BÀN LUẬN KINH-VIỆTNAM Kinh Việt Nam ANTI HLA-B KHTK HLA-B So sánh tỷ lệ kháng thể kháng HLA-B tìm 297 mẫu huyết sản phụ sau sanh kiểu hình HLA-B 91 người Kinh Việt Nam BÀN LUẬN So sánh tỷ lệ kháng huyết kháng HLA-B với HLA-B tác giả Bạch Khánh Hòa (BKH), Bạch Quốc Tuyên (BQT) 91 người Kinh Việt Nam (KVN) BÀN LUẬN * Về kỹ thuật xét nghiệm: Kỹ thuật độc tế bào Terasaki: kỹ thuật miễn dòch tương đối đơn giản, thực có huyết xác đònh kiểu hình phân tử HLA Ngược lại, áp dụng kỹ thuật để phát kháng thể kháng HLA huyết có dàn panel lympho BÀN LUẬN Kiểm chứng : * Từ kết kiểm tra độ đặc hiệu độ nhạy kháng huyết mà chiết tách được, với kiểu hình tương ứng dựa mẫu tế bào lympho lấy từ dàn panel Kết hoàn toàn tương ứng * Từ kết kiểm chéo kháng huyết trường Đại học UCL BÀN LUẬN • Kháng huyết tìm dù không nhiều đặc hiệu hoàn toàn tương ứng với kháng huyết thanh, làm phòng xét nghiệm HLA trường Đại học Louvain Với độ nhạy phản ứng cao, biểu kết mức điểm 4+ 5+ KẾT LUẬN * Bước đầu với kết trên, hy vọng tiền đề tốt cho nghiên cứu sau, việc chiết tách huyết có kháng thể kháng HLA máu sản phụ sau sổ nhau, nguồn kháng huyết có giá trò, thời gian qua bỏ nhiều KẾT LUẬN Chúng xác đònh HLA số người tình nguyện phương pháp (PCR-SSO) Xây dựng dàn panel lympho HLA lớp I cho người Việt Nam TPHCM Dàn panel chưa đầy đủ, tiếp tục nghiên cứu, nhằm xây dựng panel ngày hoàn chỉnh tiền đề mở rộng thêm bước nghiên cứu khác như: dò tìm KT kháng mô nhận sau ghép mô nhằm theo dõi trình thải ghép đề biện pháp hữu hiệu để hạn chế việc thải loại mảnh ghép KẾT LUẬN Chiết tách thành công số kháng thể kháng HLA từ huyết máu sản phụ sau sanh Với số lượng kháng huyết chiết tách đưọc giúp xác đònh phân tử HLA lớp I với lượng khoảng 25.000 mẫu thử KẾT LUẬN Hy vọng, tương lai sử dụng sản phẩm việc xác đònh kiểu hình phân tử HLA lớp I, để xác đònh vấn đề phù hợp mô ghép, góp phần việc chẩn đoán bệnh, việc nghiên cứu huyết thống, nghiên cứu phả hệ lãnh vực nhân chủng học KẾT LUẬN * Giá thành xét nghiệm không cao kỹ thuật khác, sử dụng sản phẩm nước cung cấp * Góp phần giải số vấn đề tồn đọng cho nước ta nay, đặc biệt việc xác đònh cho bệnh nhân có nhu cầu ghép thận Đặc biệt, luật cho phép sử dụng tạng người chết cho nhu cầu ghép quan KIẾN NGHỊ Có thể sử dụng kháng huyết điều chế để xác đònh HLA lớp I Bước đầu sàng lọc người hiến mô tạng, chuẩn bò ghép mô tạng Bởi loại xét nghiệm cần thiết bắt buộc ghép Với phương pháp này, giảm giá thành cho xét nghiệm cao cấp này, phù hợp với hoàn cảnh thực tế Việt Nam KIẾN NGHỊ Nếu kết ứng rộng rãi, giúp phục vụ tốt chuyên ngành ghép mô, ghép tạng Việt Nam Có thể ứng dụng thử nghiệm HLA chẩn đoán số bệnh lý liên quan KIẾN NGHỊ Dàn panel lympho cần bổ sung thêm cập nhật hoá thường xuyên hoàn thiện dần với đầy đủ kiểu hình HLA lớp I, theo xu hướng chung phòng xét nghiệm miễn dòch ghép giới [...]... HLA-B40 (14 %) HLA-B35 (8,6%)ø HLA-B54 (7,3%) Chiếm tỉ lệ thấp nhất là: HLA-B15 HLA-B07 HLA-B46 HLA-B58 (37,3%)ø (18 ,6%) (18 ,6%) (18 ,6%) HLA-B13 HLA-B 51 HLA-B58 HLA-B08 HLA-B78 (9,3%) (7,3%) (7,3%) (0,6%) (0,4%) KẾT QUẢ HLA-B Tổng %kiểu hình %kiểu gien 07 28 18 ,6 9,8 08 1 0,6 0,4 13 14 9,3 4,8 15 56 37,3 20,9 18 2 1, 3 0,7 27 10 6,6 3,4 35 13 8,6 4,4 37 3 2 1, 1 38 13 8,6 4,4 39 7 4,6 2,3 40 21 14 7,3 44 10 ... A 31 A33 A34 A68 A74 KẾT QUẢ HLA-A Tổng % kiểu hình % kiểu gien 01 8 5,3 2,7 02 63 42 23,9 03 5 3,3 1, 7 11 72 48 27,9 24 47 31 17 26 7 4,7 2,4 29 22 14 ,6 7,6 30 2 1, 3 0,7 31 2 1, 3 0,7 33 36 24 13 ,6 34 2 1, 3 0,7 68 3 2 1, 1 74 2 1, 3 0,7 Sự phân bổ kiểu hình HLA-A của 15 0 người tình nguyện KẾT QUẢ Chiếm tỉ lệ cao nhất là: HLA-A 11 (48%) HLA-A02 (42%) HLA-A24 (9) ( 31% ) Chiếm tỉ lệ trung bình: HLA-A33 (19 )... (19 ) (24%) HLA-A29 (19 ) (14 ,6%) Chiếm tỉ lệ thấp nhất: HLA-A 01 (5,3%) HLA-A 26 (10 ) (4,7%) HLA-A03 (3,3%) HLA-A68 (2%) HLA-A30 (19 ) (1, 3%) HLA-A 31 (19 ) (1, 3%) HLA-A34 (10 ) (1, 3%) HLA-A74 (19 ) (1, 3%) KẾT QUẢ Những kiểu hình HLA-A có tần suất cao của 15 0 người tình nguyện KẾT QUẢ Phân tử HLA-B gồm: 22 kiểu hình B07, B08, B13, B15, B18, B27, B35, B37, B38, B39, B40, B44, B46, B50, B 51, B52, B54, B55, B56,... HLA-B của 15 0 người tình nguyện KẾT QUẢ HLA-B Tổng %kiểu hình %kiểu gien 56 8 5,3 2,7 57 5 3,3 1, 7 58 28 18 ,6 9,8 78 1 0,6 0,4 46 28 18 ,6 9,8 50 2 1, 3 0,7 51 11 7,3 3,8 52 4 2,6 1, 4 54 11 7,3 3,8 55 4 2,6 1, 4 Sự phân bổ kiểu hình HLA-B của 15 0 người tình nguyện KẾT QUẢ Những kiểu hình HLA-B có tần suất cao của 15 0 người tình nguyện PANEL LYMPHO HLA – A*03&33 HLA – B*52&58 HLA – A*02&03 HLA – B *13 &55 HLA... nguyện PANEL LYMPHO HLA – A*03&33 HLA – B*52&58 HLA – A*02&03 HLA – B *13 &55 HLA – A*03&29 HLA – B*07&35 HLA – A* 01& 11 HLA – B *15 &57 HLA – A* 01& 33 HLA – B*40&57 HLA – A* 01& 29 HLA – B *15 &37 HLA – A*02 &11 HLA – B*40&46 HLA – A*24&26 HLA – B*07&35 HLA – A*26&33 HLA – B*27&58 HLA – A *11 &26 HLA – B *15 &46 ...ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Xây dựng dàn Panel: * Những người tình nguyện hiến mô được đăng ký và cấp thẻ do phòng TN Vật liệu sinh học bộ môn Mô Phôi TTĐTBDCBYT * CBCNV khoa xét nghiệm BV.NDGĐ và TTĐT, trong lứa tuổi từ 25-40 * Không phân biệt giới tính, có thể cho máu bất cứ lúc nào khi cần ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Chiết tách kháng huyết thanh: Số lượng mẫu huyết thanh lấy được,... trong 15 giây 60oC trong 45 giây 72oC trong 15 giây Phản ứng lai (Hybridisation reaction) Qui trình phát hiện KẾT QUẢ THỰC HIỆN TRÊN CÁC QUE CÁC BƯỚC TiẾN HÀNH KHAY TERASAKI SƠ ĐỒ: QUI TRÌNH KỸ THUẬT ĐỘC TẾ BÀO C ’ G A ÉN KT TB LY M PH O C ’ K H O ÂN G G A É N L E ÂN T B L PHẢN ỨNG ĐỘC TẾ BÀO DƯỚI KÍNH HiỂN VI SOI NGƯỢC ÂM TÍNH DƯƠNG TÍNH KẾT QUẢ - Về phân tử HLA-A: 13 kiểu hình HLA–A: A 01 A02 A03 A 11. .. Từ Dũ và BV Hùng Vương ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU - ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Tiêu chuẩn loại trừ: Số lần sanh dưới 3 lần - Cùng một hôn phối nhằm loại trừ huyết thanh có nhiều yếu tố kháng HLA Sản phụ có kèm bệnh truyền nhiễm theo đường máu: HIV, VGSVB, giang mai … (Dựa vào các kết quả xét nghiệm của bệnh viện) PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU NGHIÊN CỨU MƠ TẢ CẮT NGANG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Để xây dựng dàn Panel: ... thuộc vào số lượng xét nghiệm PCR – SSO, HLA lớp I do trường đại học Louvain tài trợ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Để phân lập huyết thanh, tạo mẫu huyết thanh đơn đặc hiệu - Quần thể đích, phụ thuộc số người đến sanh tại BV Từ Dũ và BV Hùng Vương - Trong khoảng thời gian 6 tháng từ tháng 9/2004 đến tháng 3 / 2005 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Cỡ mẫu: dựa vào tần suất của huyết thanh dương tính với HLA lớp I... 3 / 2005 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Cỡ mẫu: dựa vào tần suất của huyết thanh dương tính với HLA lớp I là 20.4% - Công thức: Ζ 12 − α / 2 × p × q N= 2 d - Với p = 0.20 và d =0.05 n = 246 - Chúng tôi chọn n =297 mẫu huyết thanh sử dụng để chiết tách kháng thể CÁC BƯỚC TiẾN HÀNH 1 Lấy máu tónh mạch 2 Chiết tách tế bào BC bằng kỹ thuật Buffy Coat 3 Bảo quản -80oC CÁC BƯỚC TiẾN HÀNH Tiến hành phân tích