Điều trị thực nghiệm bệnh tim thiếu máu cục bộ bằng liệu pháp tế bào gốc trên chuột

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN PHẠM LÊ BỬU TRÚC NGHIÊN CỨU ĐIỀU TRỊ THỰC NGHIỆM BỆNH TIM THIẾU MÁU CỤC BỘ BẰNG LIỆU PHÁP TẾ BÀO GỐC TRÊN CHUỘT Chuyên ngành: Sinh lí học Người Động vật Mã số chuyên ngành: 62 42 30 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC   Tp Hồ Chí Minh – 2015 Công trình hoàn thành tại: TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN (ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM) Địa chỉ: 227 Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, TP HCM Người hướng dẫn khoa học: PGS TS PHẠM THÀNH HỔ Phản biện 1: PGS.TS Trương Quang Bình Phản biện 2: GS.TS Nguyễn Văn Thuận Phản biện 3: PGS.TS Lê Văn Đông Phản biện độc lập 1: TS.BS Hoàng Văn Sỹ Phản biện độc lập 2: TS Nguyễn Lê Xuân Trường Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án họp Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM Vào lúc ………giờ…… ngày……tháng…….năm…… Có thể tìm hiểu luận án thư viện: -   Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM -   Thư viện Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên         Tính cần thiết đề tài Từ thuở ban sơ đến nay, loài người tiến hành chiến không ngừng nghỉ chống lại bệnh tật để kéo dài tuổi thọ Mặc dù bùng nổ hàng loạt công nghệ đại làm cho đời sống văn minh nhân loại thay đổi ngày, người phải đối mặt với thách thức then chốt lớn suy giảm chất lượng sức khỏe bệnh tật đe dọa mạng sống Trong bệnh nguy hiểm gây chết người, bệnh tim mạch xếp vị trí hàng đầu, cao bệnh ung thư AIDS Theo Tổ chức Y tế Thế giới, năm có khoảng 17,5 triệu người hành tinh chết bệnh tim mạch, số dự đoán tăng lên 25 triệu vào năm 2020 Tại Việt Nam, theo thống kê Viện Tim mạch Việt Nam, hàng năm có đến hàng triệu người bị bệnh mạch vành khoảng 10% số bệnh nhân tử vong nhồi máu tim Bệnh tim mạch, đặc biệt bệnh tim thiếu máu cục loại bệnh tim thường gặp (chiếm tỉ lệ 42,3%) Nguyên nhân động mạch vành xơ vữa làm giảm lưu lượng máu đến nuôi tim, lâu dài dẫn đến suy tim Do lượng máu giảm nên tế bào bị thiếu oxy dinh dưỡng, tình trạng kéo dài phần tế bào bị chết Các biện pháp điều trị thường quy sử dụng điều chỉnh lối sống, dùng thuốc, can thiệp động mạch vành qua da hay mổ bắc cầu nối động mạch vành Tuy nhiên, nay, y học chưa có biện pháp giúp hồi phục phần tế bào chết vấn đề mà nhà y học tái tạo quan tâm Phương pháp trị liệu cấy ghép tế bào gốc bệnh nhân bệnh tim thiếu máu cục nhằm cải thiện sức khoẻ nhiều quốc gia giới Mỹ, Pháp, Áo, Đức, Hàn Quốc, Trung Quốc… tiến hành nghiên cứu Những kết ban đầu cho thấy nhiều triển vọng phương pháp chữa bệnh tim thiếu máu cục Lần Việt Nam, trường Đại học Y Hà Nội phối hợp Viện Tim mạch Quốc gia Việt Nam tiến     hành nghiên cứu triển khai ứng dụng điều trị cấy ghép tế bào gốc để điều trị cho bệnh nhân suy tim sau nhồi máu Để việc điều trị tế bào gốc tiến hành có hệ thống cơ, nghiên cứu cần phải tiến hành từ bước mô hình chuột Do đó, đề tài “Nghiên cứu điều trị thực nghiệm bệnh tim thiếu máu cục liệu pháp tế bào gốc chuột” đặt   Mục đích nghiên cứu Thử nghiệm ghép tế bào gốc mô hình chuột tổn thương tim thiếu máu cục nhằm bước đầu đánh giá độ an toàn hiệu liệu pháp làm tiền đề cho nghiên cứu NỘI DUNG CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1 Bệnh tim thiếu máu cục Bệnh tim thiếu máu cục trạng thái bệnh lý tim không cung cấp đủ oxy chất dinh dưỡng so với nhu cầu bình thường dẫn đến tổn thương tim làm giảm hoạt động co bóp tim, loạn nhịp tim dẫn đến tử vong Mô hình chuột tổn thương tim thiếu máu cục Để hiểu sâu chế sinh bệnh phát triển liệu pháp hiệu chữa trị, mô hình động vật thiếu máu tim cục nghiên cứu Phần lớn mô hình thiếu máu tim cục tạo dựa nguyên tắc: gây tắc hoàn toàn gây hẹp phần động mạch vành quy trình phẫu thuật thuốc can thiệp, mô tiến trình bệnh người cách cảm ứng xơ vữa động mạch Cho đến số phương pháp tạo mô hình chuột bệnh tim mạch nghiên cứu sử dụng hóa chất gây suy tim, đóng dòng chảy co khít mạch máu thắt mạch vành 1.3 Nguồn tế bào gốc/ tế bào tiền thân thử nghiệm biệt hoá thành tế bào tim     Hiện có số nguồn tế bào gốc thử nghiệm biệt hóa thành tế bào tim tế bào gốc trung mô thu từ tủy xương, tế bào gốc trung mô từ mô mỡ, tế bào gốc thu từ dịch màng ối, tế bào gốc phôi (ESCs) hay tế bào cảm ứng đa tiềm (iPSCs) Tế bào gốc có nguồn gốc từ máu cuống rốn (UCB-MSCs) với đặc tính trẻ, khỏe, dễ thu nhận, có khả điều biến miễn dịch cho nguồn tế bào tiềm để biệt hóa thành tế bào tim hướng đến ứng dụng điều trị bệnh tim mạch 1.4 Tình hình nghiên cứu liệu pháp tế bào chữa trị bệnh tim thiếu máu cục giới Đã 20 năm kể từ ngày công trình cấy ghép tế bào điều trị tổn thương tim công bố, đến liệu pháp tế bào điều trị bệnh tim có bước tiến đáng kể Đầu tiên công trình tập trung vào việc sử dụng tế bào xương tế bào vệ tinh khả thu nhận từ nguồn tự thân cao, khả tăng sinh mạnh khả chịu thiếu máu cục tốt Tuy nhiên, nguồn tế bào sau chứng minh không chuyển biệt hóa thành tế bào tim khả kết nối với tế bào tim thể chủ sau cấy ghép thấp Các nghiên cứu sau tiếp tục tìm kiếm nguồn tế bào thích hợp tế bào gốc trung mô tủy xương số ESCs biệt hóa thành loại tế bào trưởng thành chứng minh có khả tái tạo tế bào mô tim mô hình động vật Tuy nhiên, vấn đề đạo đức sinh học, pháp lý miễn dịch cản trở việc sử dụng chúng thử nghiệm người ESCs thay tế bào gốc đa tiềm cảm ứng tái lập trình từ tế bào soma hay tế bào tim cảm ứng Hiện nay, tế bào tim có nguồn gốc từ tế bào gốc trưởng thành, bao gồm tế bào đơn nhân từ tủy xương, tế bào gốc trung mô, tế bào gốc mô mỡ, tế bào gốc có nguồn gốc từ tim ưu tiên thử nghiệm đánh giá lâm sàng Kết thử nghiệm lâm sàng gần ủng hộ quan điểm cho liệu pháp tế bào gốc an toàn có khả sửa chữa cấu trúc tim     giúp phục hồi chức tim Các thử nghiệm lâm sàng sử dụng tế bào gốc đồng loại quan tâm Emerson C Perin 2015 công bố kết thử nghiệm ghép tế bào MSCs đồng loại 45 bệnh nhân suy tim mãn thiếu máu hay không thiếu máu Kết cho thấy triệu chứng đáp ứng miễn dịch lâm sàng xảy ra, cấu trúc chức tim cải thiện sau năm cấy ghép Piotr Musialek 2015 ghép tế bào MSCs đồng loại từ màng Wharton’s Jelly cho 10 bệnh nhân nhồi máu tim cấp tính Kết cho thấy bệnh nhân dấu hiệu thiếu máu tim đo ECG, tình trạng tim bị suy, lượng Troponin giảm sau 24 ghép, kiện bất lợi khác, có xảy loạn nhịp tim không đáng kể 1.5 Tình hình nghiên cứu liệu pháp tế bào chữa trị bệnh tim thiếu máu cục việt nam Riêng Việt Nam, từ năm 2010 đến nay, Phòng thí nghiệm Tế bào gốc, Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM triển khai hướng nghiên cứu sử dụng liệu pháp tế bào điều trị bệnh tim mạch Năm 2008, đề tài cấp nhà nước Ghép tế bào gốc tự thân điều trị suy tim GS TS Nguyễn Lân Việt chủ nhiệm sử dụng tế bào gốc tự thân tủy xương để ghép cho bệnh nhân nhồi máu tim cấp Cho đến nay, có 40 bệnh nhân thử nghiệm phương pháp với tỉ lệ an toàn, không biến chứng đạt 100% CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Chuột nhắt trắng Mus musculus Var Albino bệnh, giống đực, 12 tuần tuổi mua từ Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh 2.2 Phương pháp nghiên cứu: nghiên cứu dọc có can thiệp nhóm chứng - Phương pháp tạo mô hình chuột thiếu máu tim cục bộ: chuột gây mê, đặt nội khí quản trước sử dụng Prolene 7-0 để thắt động mạch vành trước trái vị trí 1/3 từ cuống tim nhằm gây tắc nghẽn mạch vành, dẫn đến tình trạng thiếu máu tim cục     - Phương pháp thu nhận tế bào tiền thân nội mô từ máu cuống rốn người: Tế bào đơn nhân huyền phù môi trường khảo sát: (1)-MT1 (M199 + 20% FBS, 1% antibiotic-mycobiotic, 0,4% ECGF/heparin 12 µg/ml BBE, 10 ng/ml hEGF, ng/ml bFGF, ng/ml VEGF, ng/ml hIGF); (2)-MT2 (MCDB131 + 20% FBS, 1% antibiotic-mycobiotic, 0,4% ECGF/heparin 12 µg/ml BBE, 10 ng/ml hEGF, ng/ml bFGF, ng/ml VEGF, ng/ml hIGF); (3)-MT3 (EGM + SingleQuots: 12 µg/ml BBE, 10 ng/ml hEGF, µg/ml hydrocortison antibiotics, 5% FBS (Sigma) + 50 ng/ml VEGF, 50 ng/ml hIGF, 50 ng/ml hEGF) với phương pháp: (1)-PP1 (Thay môi trường sau 72 nuôi cấy tế bào) (2)-PP2 (Chuyển dịch tế bào sau 24 nuôi cấy) Tế bào tiền thân nội mô ứng viên đánh giá dựa vào hình thái, bám dính tăng sinh thời gian khảo sát 7, 14, 21 28 ngày Bảng 2.1 Tóm tắt cách bố trí nghiệm thức thí nghiệm STT Tên nghiệm thức Nghiệm thức A Cách bố trí thí nghiệm MT1 + PP1 Nghiệm thức B MT1 + PP2 Nghiệm thức C MT2 + PP1 Nghiệm thức D MT2 + PP2 Nghiệm thức E MT3 + PP1 Nghiệm thức F MT3 + PP2 - Phương pháp biệt hoá tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn người (hUCBMSCs) thành tế bào tiền thân tim (CPs): hUBC-MSCs nuôi môi trường DMEM bổ sung 15% FBS 1% Penicillin/Streptomycin dùng làm mẫu đối chứng Xử lí với 5-AZC: Các tế bào cảm ứng môi trường DMEM bổ sung 10% FBS; 1% Penicillin/Streptomycin; 10 µM 5azacytidine; 50 ng/ml activin A; 0,1mM acid ascorbic 24 Sau đó, tế bào rửa qua PBS lần nuôi môi trường DMEM bổ sung 15% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin; bổ sung 50 ng/ml activin A; 0,1mM     acid ascorbic 5-AZC để tránh gây chết tế bào phơi nhiễm với 5AZC thời gian dài Môi trường thay ngày thí nghiệm kết thúc sau 36 ngày Xử lí 5-AZC + HE: tế bào cảm ứng tương tự phương pháp biệt hóa 5-AZC thông thường lượng 5-AZC giảm 5µM môi trường biệt hóa bổ sung thêm 36 µg/ml dịch chiết tim thai chuột E.18.5 - Phương pháp ghép tế bào: chuột chia làm nhóm Nhóm chuột bình thường, nhóm chuột mô hình tiêm giả dược, nhóm chuột mô hình ghép EPCs, nhóm chuột mô hình ghép CPs, nhóm chuột mô hình ghép EPCs + CPs Chuột gây mê, trợ thở, mở lồng ngực, thắt LAD tiến hành tiêm tế bào hay giả dược Sử dụng thiết bị vi tiêm Ugobasile, số lượng tế bào tiêm 106 tế bào/30µl/con Thể tích tiêm 30µl/con chia làm lần tiêm xung quanh vị trí nhồi máu (sau thắt mạch vành từ 3-5 phút dễ dàng quan sát vùng tim thiếu máu bị tái so với vùng tim xung quanh) Tốc độ tiêm tế bào 8,55ml/h Hiệu ghép đánh giá theo tiêu chí biến động huyết áp chuột, mức độ tổn thương tim qua lượng protein Troponin I máu, tồn tại, di cư biến đổi tế bào ghép ảnh hưởng đến mô tim ghép CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết nghiên cứu tạo mô hình chuột tổn thương tim thiếu máu cục 3.1.1 Tỷ lệ sống Ở lô đối chứng, chuột không thực thao tác thí nghiệm sống hoạt động sinh lý bình thường Tỉ lệ sống ghi nhận 100% (n=10) Trong tổng số chuột sống sót qua trình giải phẫu thắt LAD (n=22), có chuột chết ngày N3 N4, chuột yếu dần chết ngày N7 Tỷ lệ sống sau thắt mạch vành: 17/22 (77%) Tỷ lệ sống sau thắt mạch vành tuần: 17/17 (100%) 3.1.2 Sự thay đổi trọng lượng     Trọng lượng tăng nhóm đối chứng nhóm giả dược giảm theo thời gian nhóm thí nghiệm (hình 3.1) 3.1.3 Sự thay đổi huyết áp Huyết áp ổn định nhóm đối chứng nhóm giả dược giảm theo thời gian nhóm thí nghiệm (hình 3.2) Hình Biểu đồ thay đổi huyết áp chuột (p[...]... các tế bào cơ tim và hình thành mối nối điện giữa tế bào ghép với tế bào địa phương tương tự như nghiên cứu ghép tế bào cơ tim được biệt hoá từ tế bào gốc phôi người trên mô hình khỉ Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chứng minh rằng các tế bào CPs cấy ghép tồn tại trong mô ghép và các tế bào này đã không bị biến đổi thành các tế bào xơ mà vẫn giữ chức năng của tế bào tim giúp tim được ghép tế bào. .. hiệu quả cảm ứng biệt hóa tế bào cơ tim của GATA4, TBX5, MEF2C như MYOCD, SRF, Mesp1 và SMARCD3 3.4 Thử nghiệm cấy ghép tế bào lên mô hình chuột tổn thương cơ tim do thiếu máu cục bộ 3.4.1 Kết quả biệt hóa tế bào gốc trung mô thành tế bào tiền thân cơ tim Các tế bào gốc trung mô được biệt hóa trong môi trường có chứa 5AZC theo phương pháp biệt hóa đã đề cập ở chương 2 Các tế bào cảm ứng sau biệt hóa... Bửu Trúc, Nguyễn Thanh Tâm, Bùi Thị Vân Anh, Nguyễn Thị Thu Mỹ, Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc (2015), Đánh giá sơ bộ hiệu quả điều trị của tế bào tiền thân cơ tim được biệt hóa từ tế bào gốc trung mô máu cuống rốn trên mô hình chuột tổn thương cơ tim do thiếu máu tim cục bộ, Hội nghị Tế bào gốc toàn quốc lần III ... con chuột mô hình thiếu máu tim cục bộ phục vụ cho nghiên cứu bằng phương pháp vi phẫu thuật sử dụng chỉ Prolene 7-0 thắt động mạch vành trước trái ở vị trí 1/3 từ cuống tim gây tắc nghẽn mạch vành, dẫn đến tình trạng thiếu máu tim cục bộ Tỷ lệ chuột sống sau khi vi phẫu thuật thắt mạch vành trước trái là 77% 2 Sau 19 ngày tính từ thời điểm ghép tế bào, tỷ lệ chuột sống ở các nhóm được ghép tế bào. .. là yếu tố giúp thúc đẩy sự biệt hóa của các tế bào cơ tim có nguồn gốc từ tế bào gốc phôi và tăng cường sự phát triển của các tế bào cơ tim tâm thất Việc thiếu hụt RA làm giảm tín hiệu Fgf cảm ứng sự biệt hóa tế bào thành tế bào cơ tim Trong một đường truyền tín hiệu khác, RA cảm ứng EPO gan kích hoạt tín hiệu IGF2 dẫn đến sự tăng sinh của các tế bào cơ tim Cuối cùng, một số yếu tố phiên mã đã được... (0,25%) Điều này chứng tỏ tính đồng nhất trong quần thể tế bào tiền thân nội mô là rất cao vì sau các lần cấy chuyền, quần thể các tế bào tạp nhiễm đã bị loại bỏ, đồng thời quần thể tế bào tiền thân nội mô tăng sinh và biểu hiện mạnh các marker của chúng 3.3 Kết quả biệt hóa tế bào gốc trung mô máu cuống rốn người thành các tế bào tiền thân cơ tim 3.3.1 Đặc tính của các tế bào hUCB-MSCs   11   Các tế bào. .. cũng chưa được thực hiện như khả năng hình thành mạch của EPCs, khả năng cận tiết của CPs,   22   hay khả năng huy động các tế bào gốc nội sinh tham gia vào quá sửa chữa tim bị tổn thương Tuy vẫn còn một số mặt hạn chế nhất định, nhưng nghiên cứu này đã bước đầu hình thành một nền tảng khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo trong việc điều trị bệnh tim thiếu máu cục bộ bằng liệu pháp tế bào KẾT LUẬN 1... tích hợp với mô tim ghép trong khi việc ghép CPs cho thấy các tế bào này tồn tại và có xu hướng tích hợp với các tế bào ở mô tim ghép Điều này có thể do nguồn gốc tế bào được biệt hóa khác nhau, thời gian theo dõi đánh giá khác nhau và quá trình biệt hóa tế bào khác nhau Qua đó có thể thấy các tế bào tiền thân cơ tim sau khi được ghép không những tác động tích cực đến hiệu quả điều trị thông qua việc... xơ hoá mô cơ tim ở 3 nhóm chuột EPCs, CPs và EPCs+CPs được ghép tế bào thấp hơn nhiều so với mô cơ tim nhóm giả dược lần lượt là 12,8%, 0%, và 5,1% so với 61,1% 7 Kết quả nhuộm IHC cho thấy các tế bào CPs biểu hiện các marker đặc trưng cho tế bào cơ tim người như human cTnT và human α-actin trong cơ tim chuột được cấy ghép Các kết quả đạt được bước đầu cho thấy liệu pháp cấy ghép tế bào gốc có độ an... tiền thân cơ tim được biệt hoá từ tế bào gốc trung mô máu cuống rốn người Trong nghiên cứu trước đây của Malliaras K và cộng sự cho thấy các tế bào tiền thân cơ tim không biểu hiện phân tử MHC II và phân tử B7, tương tự như profile miễn dịch thấp của MSCs Việc tế bào CPs được tìm thấy trong cơ tim chuột cấy ghép và chúng   21   biểu hiện các marker đặc trưng cho tế bào cơ tim cho thấy các tế bào CPs này