Nghiên cứu điều trị bệnh thiếu máu chi cấp tính trên chuột nhắt trắng bằng ghép đồng loài tế bào gốc trung mô (tóm tắt)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ BÍCH NGỌC NGHIÊN CỨU ĐIỀU TRỊ BỆNH THIẾU MÁU CHI CẤP TÍNH TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG BẰNG GHÉP ĐỒNG LOÀI TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ Chuyên ngành: Sinh lý học Người Động vật Mã số chuyên ngành: 62 42 30 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Tp Hồ Chí Minh - Năm 2017 Công trình hoàn thành tại: PTN Nghiên cứu Ứng dụng tế bào gốc, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP.HCM Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Tạ Thành Văn Phản biện 1: PGS.TS Trương Quang Bình Phản biện 2: PGS.TS Nguyễn Văn Thuận Phản biện 3: TS Trần Hoàng Ngọc Ái Phản biện độc lập 1: PGS.TS Lê Văn Đông Phản biện độc lập 2: TS Trần Hoàng Ngọc Ái Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án họp Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia TP.HCM vào lúc 09 00 ngày 31 tháng 05 năm 2017 Có thể tìm hiểu luận án thư viện: - Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM - Thư viện Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên TÍNH CẦN THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Thiếu máu cục chi coi giai đoạn cuối bệnh lý động mạch ngoại biên, ảnh hưởng nghiêm trọng đến chất lượng sống Thiếu máu cục cấp tính chi xác định 12% dân số trưởng thành Mỹ Một năm sau chẩn đoán, 25% bệnh nhân tử vong, 30% phải cắt cụt chi, 45% lại sống mà giữ chi Năm năm sau đó, 60% bệnh nhân tử vong thiếu máu cục cấp tính chi Thống kê Viện Tim mạch Việt Nam cho thấy tỷ lệ bệnh nhân BĐMCD điều trị nội trú Viện tăng từ 1,7% (2003) lên tới 2,5% (2006) 3,4% (2007) Đến nay, hầu hết liệu pháp điều trị cho bệnh dựa nguyên tắc phá bỏ huyết khối thuốc, sóng siêu âm phương pháp can thiệp nội mạch nhằm tái thiết lập dòng máu Và phương pháp can thiệp nội mạch hiệu quả, phương pháp phẫu thuật bắc cầu động mạch thực Tuy nhiên, tất phương pháp truyền thống thất bại, bệnh nhân phải đối mặt với nguy cắt cụt chi tử vong Liệu pháp tế bào gốc trở thành phương pháp điều trị đầy hứa hẹn cho việc tái tạo mạch máu Các nghiên cứu gần cho thấy tế bào gốc trung mô tuỷ xương (BM-MSC) cảm ứng tạo mạch máu mô hình chuột thiếu máu chi cấp tính người trưởng thành Ngoài BM-MSC, tế bào gốc trung mô từ mô mỡ (AD-MSC) có đặc tính tương tự AD-MSC biệt hoá thành tế bào nội mô tế bào có nguồn gốc trung mô khác mô Ghép AD-MSC nhiều báo cáo cho thấy tính hiệu chúng việc tái tạo mô tổn thương giúp tái tạo mạch máu Mặc dù số nghiên cứu cho thấy việc cấy ghép AD-MSC BMMSC cho hiệu điều trị bệnh thiếu máu chi cấp tính mô hình chuột, đến thông tin chứng khoa học so sánh hiệu điều trị hai loại tế bào chế hoạt động tế bào việc giảm thiểu tổn thương mô Tại Việt Nam, nghiên cứu phân lập tế bào gốc điều trị thực nghiệm mô hình động vật bệnh lý sử dụng tế bào gốc tiến hành Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu thực bệnh lý thiếu máu chi cấp tính Do đó, nghiên cứu này, thực đề tài “Nghiên cứu điều trị bệnh thiếu máu chi cấp tính chuột nhắt trắng ghép đồng loài tế bào gốc trung mô” nhằm thử nghiệm điều trị bệnh liệu pháp tế bào gốc với nguồn tế bào gốc trung mô từ tuỷ xương từ mô mỡ Đề tài thực với mục tiêu sau: Mục tiêu tổng quát: Đánh giá hiệu điều trị thực nghiệm bệnh thiếu máu chi cấp tính mô hình chuột sử dụng BM-MSC AD-MSC đồng loài Mục tiêu cụ thể Phân lập tế bào gốc trung mô từ tuỷ xương mô mỡ - đánh giá số đặc tính an toàn loại tế bào Xây dựng chuẩn hoá thành công mô hình chuột thiếu máu chi cấp tính Đánh giá so sánh hiệu điều trị AD-MSC BM-MSC chuột thiếu máu chi cấp tính Phân tích đánh giá vai trò tế bào ghép chuột thiếu máu chi cấp tính Đối tượng phạm vi nghiên cứu - Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu can thiệp đối chứng ngẫu nhiên - Nghiên cứu sử dụng chuột nhắt trắng chuột thiếu máu chi cấp tính cắt cắt mạch máu đùi - Nguồn tế bào cho điều trị: tế bào ghép đồng loài sử dụng ADMSC BM-MSC CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Bệnh tắc nghẽn mạch máu chi Tắc nghẽn mạch máu chi thuộc nhóm bệnh lý động mạch ngoại biên (BĐMNB) BĐMNB xảy mạch máu thể, đại đa số xảy chi Thiếu máu cục chi cấp tính kết tiến triển dày lên thành động mạch tích tụ mảng bám Sự tích tụ mảng bám gọi xơ vưa động mạch, làm hẹp gây tắc dòng máu Bệnh làm giảm đáng kể lưu lượng máu tới chi tay, chân, bàn chân, cuối tiến triển tới mức đau nặng nghỉ ngơi chí gây loét da, loét hoại tử chân bàn chân Thiếu máu cục cấp tính chi xác định 12% dân số trưởng thành Mỹ Một năm sau chẩn đoán, 25% bệnh nhân tử vong, 30% phải cắt cụt chi, 45% lại sống mà giữ chi Năm năm sau đó, 60% bệnh nhân tử vong thiếu máu cục cấp tính chi Tại Việt Nam, với bệnh động mạch xơ vữa nhồi máu tim, đột quỵ… tỷ lệ bệnh nhân nhập viện BĐMCD ngày gia tăng Thống kê Viện Tim mạch Việt Nam cho thấy tỷ lệ bệnh nhân BĐMCD điều trị nội trú Viện tăng từ 1,7% (2003) lên tới 2,5% (2006) 3,4% (2007) Theo báo cáo từ tác giả Đoàn Quốc Hưng cs, thời gian từ 3/1999 đến 5/2005, nghiên cứu 113 bệnh nhân tắc nghẽn mạch máu chi mạn tính xơ vữa động mạch điều trị phẫu thuật cho thấy tỷ lệ tử vong chung sau năm 15,1% Các nghiên cứu gần cho thấy tế bào gốc trung mô tuỷ xương (BM-MSC) cảm ứng tạo mạch máu mô hình chuột thiếu máu chi cấp tính người trưởng thành Ngoài BM-MSC, tế bào gốc trung mô có nguồn gốc từ mô mỡ (AD-MSC) có đặc tính tương tự với tế bào BM-MSC AD-MSC biệt hoá thành tế bào nội mô tế bào có nguồn gốc trung mô khác mô Ghép AD-MSC nhiều báo cáo cho thấy tính hiệu chúng việc tái tạo mô tổn thương giúp tái tạo mạch máu Tế bào gốc trung mô MSC nguồn TBG nghiên cứu từ lâu sở hữu nhiều đặc tính ưu việt Uỷ ban MSC Hiệp hội quốc tế liệu pháp tế bào (International Society of Cellular Therapy-ISCT) đề xuất tiêu chuẩn tối thiểu để xác định đặc tính miễn dịch MSC người cho các nhà khoa học nghiên cứu phòng thí nghiệm lẫn nhà nghiên cứu tiền lâm sàng vào năm 2006 cập nhật năm 2013 Đầu tiên, MSC phải có tính bám dính trì điều kiện nuôi cấy tiêu chuẩn sử dụng bình nuôi cấy mô Thứ hai, tế bào phải biểu dương tính với phân tử protein bề mặt (marker) CD105, CD73, CD90 không biểu marker CD45, CD34, CD14 CD11b, CD79a CD19 HLA-DR Thứ ba, tế bào phải có khả biệt hoá thành nguyên bào tạo xương, tế bào mỡ nguyên bào sụn điều kiện nuôi cấy biệt hoá in vitro tiêu chuẩn Cơ chế sửa chữa tổn thương tế bào gốc trung mô MSC tham gia tích cực vào việc sửa chữa tái tạo mô Đầu tiên MSC phân phối vào vùng tổn thương mô bệnh tiết cytokine nhân tố tăng trưởng để kích thích tái tạo theo hướng cận tiết MSC điều chỉnh ổ tế bào gốc thể chủ cách kích thích huy động tế bào nội sinh tới vùng tổn thương định hướng biệt hoá theo dòng tế bào cần thiết Một cách có liên quan, MSC cung cấp chất chống oxy hoá, dọn dẹp gốc tự protein sốc nhiệt/chaperone vùng thiếu máu Kết chất độc hại phóng thích vào môi trường loại bỏ, thúc đẩy phục hồi tế bào sống sót MSC cấy ghép cung cấp ty thể cho tế bào hư hại, phục hồi lại trình thoái hoá yếm khí Thứ hai, MSC biệt hóa trực tiếp thành tế bào có chức năng, thay cho tế bào hư hại Tế bào gốc tái tạo mạch máu Một đặc tính sinh học quan trọng TBG tác động cận tiết trình tân tạo mạch Đồng thời, TBG tham gia biệt hoá trự tiếp thành tế bào thành phần mạch máu tế bào nội mô, tế bào trơn thành mạch Sự tạo mạch máu giúp cung cấp oxy chất dinh dưỡng thiết yếu cho sống sót tăng trưởng mô thể Sự tân tạo hình thành theo chế: tạo mạch máu hoàn toàn (vasculorgenesis) tạo mạch cách phân nhánh kéo dài từ mạch tồn sẵn có (angiogenesis) Tế bào gốc trung mô việc sửa chữa tái tạo mô MSC biệt hoá thành sợi vân tham gia vào phục hồi ổ tế bào vệ tinh in vitro in vivo Do đó, MSC xem ứng viên cho điều trị bệnh Trong số nghiên cứu, MSC cấy ghép vào chuột đột biến thiếu gen dystrophin bệnh nhân teo Duchenne cho thấy dấu hiệu cải thiện đáng kể chức Goudenege cs (2009) chứng minh biểu MyoD ảnh hưởng AD-MSC người Kết thí nghiệm ông cho thấy tiềm tạo tế bào AD-MSC người tăng in vitro in vivo CHƯƠNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu • Chuột nhắt trắng dòng Swiss tháng tuổi sử dụng cho thí nghiệm • Tế bào gốc trung mô thu nhận từ mô mỡ (AD-MSC) tuỷ xương (BM-MSC) chuột đồng loại • Loại bệnh nghiên cứu: bệnh thiếu máu chi cấp tính bị thắt cắt mạch máu Sơ đồ bố trí thí nghiệm Phương pháp nghiên cứu: • Phương pháp thu nhận nuôi cấy tế bào ứng viên tế bào gốc trung mô từ mô mỡ tuỷ xương • Phương pháp đánh giá số đặc tính an toàn tế bào: tính vô khuẩn tế bào, khả tạo khối u tế bào khả gây chết tế bào động vật • Phương pháp tạo mô hình chuột thiếu máu chi cấp tính với kĩ thuật đánh giá lưu thông mạch máu chi, SPO2, phù nề chi, khả vận động, biến đổi cấu trúc mô nhuộm mô học, hình thành mạch máu • Phương pháp ghép tế bào gốc chuột tắc nghẽn mạch máu chi • Phương pháp chuyển gen phát huỳnh quang vào tế bào gốc • Phương pháp đánh giá tồn tế bào dựa tế bào đánh dấu huỳnh quang kĩ thuật chụp hình kính hiển vi huỳnh quang kĩ thuật phân tích dòng chảy (flow cytometry) • Phương pháp đánh giá thay đổi gen liên quan đến khả tạo mạch máu tế bào ghép kĩ thuật realtime RT-PCR • Phương pháp xử lý số liệu: số liệu sử lý phần mềm xử lý thống kê prism 6.0, Tukey's multiple comparisons test với độ tin cậy 95% CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Kết phân lập định danh tế bào gốc trung mô từ mô mỡ tuỷ xương 1.1 Hình thái khả tăng sinh tế bào gốc ứng viên 1.1.1 Tế bào gốc trung mô từ mô mỡ Hình Hình dạng tế bào AD-MSC ứng viên nuôi cấy in vitro Phân đoạn tế bào SVF bám trải sau nuôi cấy hai ngày, tế bào có dạng hình thoi, thuôn dài hai đầu, hình que dạng đa giác (Hình 1A) Sau năm ngày nuôi cấy, mật độ tế bào bao phủ khoảng 70-80% bề mặt đĩa nuôi Tế bào có dạng hình thoi, thuôn dài hai đầu hình que chiếm đa số (Hình 1B) Qua lần cấy chuyền thứ ba (Hình 1C), thứ năm (Hình 1D), thứ mười (Hình 1E), hình dạng tế bào trở nên đồng với hình dạng chủ yếu thuôn dài hai đầu Hình dạng giống với tế bào nguyên bào sợi (Hình 1F) 1.1.2 Tế bào gốc trung mô từ tuỷ xương Đối với tế bào đơn nhân thu nhận từ tuỷ xương chuột, tế bào bám dính sau 24 nuôi cấy tăng sinh sau 48 (Hình 2A) Tế bào bao phủ 70-80% bề mặt đĩa nuôi sau 5-6 ngày (Hình 2B) Tế bào có dạng hình thoi, thuộn dài hai đầu, tế bào phân nhánh so với tế bào thu nhận từ mô mỡ Hình Hình dạng tế bào BM-MSC ứng viên nuôi cấy in vitro Sau lần cấy chuyền, hình dạng tế bào đồng với dạng hình thoi chiếm đa số (Hình 2C) Ở lần cấy chuyền thứ đến 10, hình dạng tế bào đồng (Hình 2D,E), tế bào tăng sinh với tốc độ ổn định, sau -3 ngày, mật độ tế bào bao phủ 70-80% bề mặt đĩa nuôi (Hình 2) 1.2 Khả biệt hoá thành tế bào mỡ, xương sụn Sau nuôi môi trường cảm ứng biệt hoá tạo mỡ, xương sụn, tế bào AD-MSC BM-MSC bắt màu với thuốc nhuộm oil red O, alizarin red S safranin O cho thấy có hình thành tích tụ giọt lipid, tích tụ ion canxi hình thành proteoglycan tế bào Như vậy, AD-MSC BM-MSC có khả biệt hoá thành tế bào mỡ, xương sụn (Hình 3) Hình Khả gây khối u tế bào động vật Để đánh giá tác động riêng lẻ tế bào AD-MSC BM-MSC lên sống sót chuột, tiến hành ghép AD-MSC BMMSC lên chuột vị trí đùi vú Kết cho thấy, 100% chuột ghép AD-MSC (n=15) BM-MSC (n=15) hình thành khối u tất chuột ghép tế bào sống khoẻ mạnh sau tháng ghép tế bào Kết xây dựng mô hình chuột thiếu máu chi cấp tính 3.1 Khả lưu thông máu sau tổn thương Một đến hai phút sau tiêm trypan blue, lô chuột tháng tuổi chuột tháng tuổi, chi không cắt mạch bắt màu xanh thuốc nhuộm Trong đó, chi cắt mạch không bắt màu (Hình 7A) Hiên tượng xảy tương tự ngày thứ sau cắt mạch (Hình 7B) Điều chứng tỏ lượng máu lưu thông đến phía sau vùng bị gây tắc nghẽn mạch bị gián đoạn Điều cho thấy việc gây tắc nghẽn mạch máu chi thành công 100% chuột thí nghiệm lô Hình Khả lưu thông máu sau tổn thương Sau ngày, chuột giữ đến bàn chân hai lô, bắt màu thuốc nhuộm quan sát chi bị cắt mạch chi bình thường (Hình 7C) Tuy nhiên, chi bị cắt mạch, bắt màu xanh diện vị trí so với chi bình thường Điều cho thấy, tổn thương sau gây tắc nghẽn mạch bị hạn chế, lưu thông mạch máu so với chi bình thường 11 3.2 Độ phù nề chi sau tổn thương Sau ngày gây thiếu máu, chi chuột có tượng phù nề (Hình 8A) Khi đánh giá mức độ phù nề phương pháp đánh giá tỉ lệ khối lượng mô ướt/mô khô chuột cho thấy, lô chuột bình thường 3,45 ± 0,09 (lần) Trong đó, tỷ lệ lô chuột tháng tuổi lô chuột tháng tuổi có khác biệt đáng kể so với lô bình thường (p< 0,05), 4,30 ± 0,09 (lần) 4,59 ± 0,18 (lần) (Hình 8B) Tuy nhiên, khác biệt mức độ phù chi bị gây tắc nghẽn mạch máu chuột tháng tuổi so với chuột tháng tuổi Mặt khác, sau ngày, độ phù nề chi tất chuột tắc nghẽn mạch máu không khác biệt so với chuột bình thường Điều cho thấy, phù nề chi chuột giảm đáng kể sau tuần sau bị tắc nghẽn cấp tính mạch máu chi Hình Sự phù nề chi sau gây tắc nghẽn mạch máu 3.4 Khả cử động chi Ở lô chuột, khả cử động nước chi cắt mạch có tương đồng (Biểu đồ 1) Chuột bị tổn thương cấp độ I, khả đạp nước chuột tuổi (35 ± lần) chuột tháng tuổi (36 ± lần) không khác không khác biệt so với khả hoạt động chuột bình thường (36 ± lần) Ở cấp độ tổn thương II III, tần số đạp nước chi khác biệt nhóm tuổi, dao động từ 23 ± lần đến 26± lần Tuy nhiên, so với cấp độ tổn thương I so với chuột 12 bình thường, hoạt động đạp nước chuột tổn thương cấp độ II III có khác biệt đáng kể (p