Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống
1
/ 22 trang
THÔNG TIN TÀI LIỆU
Thông tin cơ bản
Định dạng
Số trang
22
Dung lượng
471,68 KB
Nội dung
I HC QUC GIA TP HCM TRNG I HC KHOA HC T NHIấN V BCH NGC TểM TT TI: IU TR THC NGHIM BNH TC NGHN MCH MU CHI BNG LIU PHP T BO GC Chuyờn ngnh: Sinh lý hc ngi v ng vt Mó s chuyờn ngnh: 62423001 Ngi hng dn khoa hc: GS.TS T Thnh Vn TểM TT LUN N TIN S SINH Lí HC NGI V NG VT Tp H Chớ Minh nm 2014 I HC QUC GIA TP.HCM TRNG H KHOA HC T NHIấN V BCH NGC TểM TT LUN N TIN S XC NHN CA CBHD: (CBHD ký tờn v ghi h tờn) MC LC Mc lc Tớnh cp thit, ý ngha khoa hc v thc tin ca ti 2.Tng quan v cỏc kt qu nghiờn cu v ngoi nc ó cú n v khoa hc m ti cp n 2.1 Ngun t bo 2.2 Liu phỏp t bo tc nghn mch mỏuchi Mc ớch nghiờn cu Ni dung v phm vi ca s i sõu nghiờn cu i tng, phng phỏp nghiờn cu 5.1 Cỏch tip cn 5.2 i tng thớ nghim v c mu cho nghiờn cu 5.3 Cỏc phng phỏp nghiờn cu 10 Ni thc hin ti nghiờn cu ca lun 15 Ti liu tham kho 15 1 Tớnh cp thit, ý ngha khoa hc v thc tin ca ti Thiu mỏu cc b cp tớnh (TMCBCT) l mt biu hin ca bnh ng mch ngoi biờn (BMNB) Bnh nhõn cú tn thng da, loột hay hoi t mụ thiu mỏu cc b Mc tiờu chớnh iu tr bnh nhõn TMCBCT l gim au thiu mỏu cc b, cha lnh vt loột, ngn nga mt chi, ci thin chc nng v cht lng cuc sng ca bnh nhõn v kộo di s sng T bo gc hoc t bo tin thõn c xỏc nh l ngun t bo cú tim nng iu tr mi cú tỏc dng kớch thớch s to mch mỏu Liu phỏp cy ghộp t thõn t bo gc hoc t bo tin thõn cho cỏc bnh thiu mỏu cc b ngoi vi dng nh tr thnh mt cụng c mi cho iu tr chng thiu mỏu cc b chi nghiờm trng Cỏc bng chng s b ó cho thy tớnh kh thi, an ton v hiu qu mt s im mu cht quan trng nhm phc hi tn thng thiu mỏu cc b Ti Vit Nam, tc nghn ng mch ngoi vi cũn l cn bnh khú iu tr, khụng ch nh hng ti cht lng cuc sng ca ngi bnh v gia ỡnh m cũn nh hng n ton xó hi, chi phớ iu tr tn kộm cng l mt gỏnh nng ln cho nhng ngi liờn quan Cỏc ng dng dựng t bo gc mi ch tin hnh iu tr bnh lý v mỏu Mt s khỏc ang c tin hnh cho cỏc bnh nhõn tn thng da, bng mt, bnh lý v xng Tuy nhiờn, cỏc ng dng ny cũn hn ch quy mụ nh i vi iu tr tc nghn mch mỏu bng liu phỏp t bo gc, cha cú c s no nc cú cụng trỡnh cụng b v hiu qu iu tr Nghiờn cu ny tin hnh cy ghộp ng loi t bo gc nhm ỏnh giỏ kh nng tỏc ng ca t bo ghộp lờn s phc hi cỏc mụ tn thng nh mụ mch mỏu, mụ c ti vựng tc nghn mch mỏu Kt qu nghiờn cu cú ý ngha quan trng vic ci thin cỏc liu phỏp iu tr bnh, t ú tỡm nhng phỏc tr liu tin lõm sng, l tin cho cỏc nghiờn cu sõu hn iu tr cn bnh ny v l c s m rng phm vi th nghim mc lõm sng Nghiờn cu cng to mt s mụ hỡnh v phng phỏp cy ghộp cú tỏc ng phc hi cỏc mụ tn thng 2 Tng quan v cỏc kt qu nghiờn cu v ngoi nc ó cú n v khoa hc m ti cp n 2.1 Ngun t bo TBTT ni mụ, TBG to mỏu v TBG trung mụ c c trng bi kh nng s to mch mỏu mi v sa cha mụ C ba loi t bo ny u c phõn lp t ty xng Ngoi TBTT ni mụ cũn cú th c thu nhn t mỏu ngoi vi cng nh lỏch, TBG trung mụ cú th c phõn lp t mụ m ngoi vi (Pittenger 2004) v thnh mch (Abedin 2004) c tớnh kiu hỡnh ca c hai loi t bo ny u cú th c xỏc nh nh húa mụ dch v phõn tớch chn lc t bo biu hin phõn t b mt s dng phng phỏp phõn tỏch dũng chy (flowcytometry) Tuy nhiờn, s thiu cỏc marker c trng cho hai loi t bo ny khin chỳng tr nờn khú xỏc nh c tớnh Nhiu marker b mt ca TBTT ni mụ v TBG trung mụ u cú trờn TBG to mỏu TBTT ni mụ l mt nhúm t bo cú ngun gc t cỏc c cht a tim nng ty xng Khi bit húa, chỳng biu hin cỏc chc nng chuyờn bit khỏc h tun hon (Dzau V.J 2005, Urbich M.F, 2004) trng thỏi bit húa, TBTT ni mụ biu hin cỏc marker ca dũng ni mụ nh VE-cadherin, PECAM-1 (CD31) v eNOS (Urbich M.F, 2004) ngi, s biu hin ca CD133 c tin l marker sm ca nguyờn bo to mch, vic mt marker ny cú s trựng khp vi s bit húa ca TBTT ni mụ thnh t bo chc nng cú c tớnh ca t bo ni mụ trng thnh (Dimmerler S 2005, Dzau V.J 2005) TBTT ni mụ c chng minh cú kh nng lm gim nhiu bin chng ca cỏc bnh tim mch (Dzau V.J 2005, Khakoo A.Y 2005) TBG trung mụ l mt qun th t bo ging nguyờn bo si, cú ngun gc t cht nn ty xng, chim khong 0,001%-0,01% tng s t bo cú nhõn ty xng TBG trung mụ trng thỏi cha bit húa biu hin CD29, CD44, CD73, CD90, CD105, CD106 v Sca-1, khụng biu hin cỏc marker thụng thng cho t bo to mỏu v t bo ni mụ nh CD14, CD31, CD34 v CD45 (Pittenger M.F 2004, Sally A Boxall v Elena Jones 2012) S tỏi sinh mụ nh t bo gc hoc TBTT c coi nh l s trỡ hay hi phc li h thng ca nhiu c quan c th trng thnh Vi nhng nghiờn cu v thnh tu thu nhn c v tim nng tỏi sinh mụ, cỏc TBG hoc TBTT ny c coi l mt ngun quan trng cỏc ng dng iu tr mụ tn thng (Hideki Iwaguro v Takayuki Asahara) Cy ghộp t bo tr thnh mt phng phỏp iu tr mi vi vic s dng t bo tin thõn ni mụ b sung cho t bo ni mụ ni ti cỏc mch mỏu ngi trng thnh Cỏc mch mỏu b tn thng cỏc trng thỏi bnh lý nh tiu ng, tng cholesterol mỏu, hyperhomocysteinemia hay tui tỏc cú th c sa cha nh chc nng ca TBTT ni mụ Cỏc t bo ny cú th c huy ng t ty xng, a vo trung tõm ca mch tham gia quỏ trỡnh hn gn tn thng S to mch c hỡnh thnh bi s hot húa ca cỏc t bo ni mụ ti ch v cỏc t bo tin thõn ni mụ in situ hay TBTT ni mụ c huy ng t ty xng Vi nhng c im nh ó cp, TBTT ni mụ v TBG trung mụ hn mt tim nng kh quan cho liu phỏp iu tr bnh tc nghn ng mch ngoi vi núi riờng v cỏc bnh lý tn thng mụ núi chung 2.2 Liu phỏp t bo tc nghn mch mỏuchi Nhiu thớ nghim trờn ng vt nh chut nht v chut cng cng nh cỏc ng vt ln khỏc c chng minh l mụ hỡnh hiu qu v kh thi cho liu phỏp t bo nhm phc hi li lu lng mỏu chi tc nghn mch Cỏc thớ nghim ny ó cho thy TBTT ni mụ tun hon tng cao ỏp ng vi chng thiu mỏu cc b (Shintani 2001, Takahashi 1999) Cỏc t bo ny di c, nh v cỏc mao mch v ng mch k mụ hỡnh thiu mỏu cp tớnh chi (Takahashi 1999, Asahara 1999) Chỳng cng cú th tỏc ng theo ng cn tit nh s tit cỏc nhõn t to mch v cytokine (Kamihata 2001) Nhng kt qu thu c t liu phỏp ny cho thy cỏc TBTT ni mụ phỏt trin ex vivo c cy ghộp vo chut (b phỏ tuyn c) thiu mỏu chi cc b cú kh nng khụi phc li lu lng mỏu v lm tng mt mch nhỏnh Hiu qu cy ghộp cho thy cú khong 60% chi c cu sng, ú cỏc lụ thớ nghim ch cú 7% (Kalka 2000) Mt s nghiờn cu trờn ng vt thớ nghiờm c tng hp Bng 1: Bng 1: Tng hp cỏc thớ nhim trờn mụ hỡnh ng vt thiu mỏu cc b s dng liu phỏp t bo Nm Tỏc gi Loi t bo i tng 1997 Asahara TBTT ni mụ Chut nht Kt qu Ci thin lu lng mỏu, ngi 2002 Iba tng mt mao mch T bo cú nhõn Chut cng To mch ph mỏu ngoi vi 2004 Ziegelhoeffer T bo ty Chut nht Phỏt trin mch ph xng 2004 Kinnaird TBG trung mụ Chut nht Tng dũng mỏu qua mch ph, ci thin chc nng chi, gim teo c 2004 Niagara 2005 Napoli Nguyờn bo c Chut nht To t bo bao quanh mch, xng tng mc b-FGF, VEGF T bo ty Chut nht xng 2005 Takagi T bo Ci thin dũng mỏu, tng mt mao mch ty Chut cng To mch mỏu mi xng 2005 Iwase TBG trung mụ, Chut cng Ci thin dũng mỏu t bo cú nhõn 2006 Awad TBTT ni mụ Chut nht Hn gn v tng trng mch mỏu 2006 Li T bo cú nhõn Chut Tng mt mao mch, mỏu ngoi vi gim hoi t chi, cú s to (nude) t bo bao quanh mch 2007 Jeon T bo ty Chut nht xng 2008 Zhang T bo xng Tng mt vi mch, mc b-FGF v VEGF ty Chut nht Tng lu lng mỏu, tng mt mao mch Tuy nhiờn, mt hn ch chớnh cỏc nghiờn cu iu tr thiu mỏu cc b chi l mi ch thc hin c trờn mụ hỡnh thiu mỏu cp tớnh nh tht mch mỏu hoc lm ụng mỏu ng mch ựi, cha thc hin c trờn mụ hỡnh thiu mỏu tớnh Mt ũi hi cp thit cho ti l phi tỡm c mt mụ hỡnh ng vt c trng, thc s mc chng x va ng mch, cú nh vy mi tip cn nhanh c phng cỏch iu tr trờn cỏc bnh ng mch ngoi vi ngi Cỏc nghiờn cu ngu nhiờn vi c mu ln, cỏc kim soỏt gi dc l cn thit v hin ang c tin hnh Cỏc nghiờn cu khỏc liờn quan ti nhiu loi t bo khỏc nhau, liu lng ti u, phng phỏp phõn lp t bo, vai trũ ca cỏc yu t kớch khớch to cm t bo (colony stimulating factor), hng hot ng v s h tr ca cỏc t bo lm gim s tin trin ca bnh ng mch ngoi biờn ang c tin hnh Ti Vit Nam, nm 1995, bnh vin Truyn mỏu - Huyt hc thnh ph H Chớ Minh ó bt u tin hnh ghộp ca ghộp TBG t ty xng u tiờn iu tr cho bnh nhõn b bnh v mỏu Nm 2002, bnh vin tin hnh ghộp TBG to mỏu cú ngun gc t mỏu dõy rn n nay, riờng bnh vin ó tin hnh ghộp c trờn 80 ca TBG cỏc loi Trờn c nc ó cú nhiu c s y t trin khai nghiờn cu ng dng ghộp TBG tr liu nh bnh vin trung ng Hu, Bnh vin nhi Trung ng, Bnh vin Quõn i Trung ng Tuy nhiờn, i vi iu tr bnh tc nghn mch mỏu ngoi vi s dng t bo gc cho ti nay, ti Vit Nam cũn l mt mi Mc ớch nghiờn cu - Xõy dng v ỏnh giỏ mụ hỡnh chut tc nghn mch mỏu chi - Phõn lp v nh danh t bo tin thõn ni mụ, t bo gc trung mụ ty xng chut cho ng ghộp - ỏnh gia hiu qu iu tr chut tc nghn mch mỏu chi bng liu phỏp ghộp t bo gc t tu xng Ni dung v phm vi ca s i sõu nghiờn cu Ni dung 1: Nghiờn cu xõy dng v ỏnh giỏ mụ hỡnh chut tc nghn mch mỏu chi Xõy dng mụ hỡnh chut tc nghn mch mỏu chi Mụ hỡnh chut thiu mỏu chi c xõy dng theo quy trỡnh c bin i t quy trỡnh ca Robert S Crawford v cng s (2007) Chut tc nghn mch mỏu c to bng cỏch tht ng mch cung cp mỏu nuụi chi, s dng k thut tht dõy thun ỏnh giỏ hiu qu xõy dng mụ hỡnh chut bnh thiu mỏu chi cc b Chut sau gõy mụ hỡnh c ỏnh giỏ da trờn cỏc tiờu c xut bi Robert S Crawford v cng s (2007) ỏnh giỏ cỏc ch tiờu sinh lớ o o lu lng mỏu bng phng phỏp chp Doppler o ỏnh giỏ s thay i hỡnh thỏi, mu sc chi o ỏnh giỏ s phự n chi bng cỏch o t l lng mụ khụ/t o Mc sng sút ca mụ bng phng phỏp MTT ỏnh giỏ s thay i mụ v t bo o Nhum mụ mụ bng Masson trichrome nhm ỏnh giỏ mc tn thng si c da trờn kiu hỡnh ca tng si c Kt qu: Mụ hỡnh thiu mỏu chi sau tht ng mch ựi trờn chut nht trng t yờu cu cho nghiờn cu Ni dung 2: Thu nhn, tng sinh v ỏnh giỏ ngun t bo : t bo gc trung mụ v t bo tin thõn ni mụ t ty xng chut Ty xng cha nhiu loi t bo gc hoc t bo tin thõn gm TBG to mỏu ([...]... 1,5 -2,1 mg/kg ng mch chi c tht v ct hai v trớ: phớa trờn ngó ba ng mch chi (tht sỏt bng) v nỳt tht phớa di cú th trờn hoc di ngó ba ng mch kheo Vic kim tra hiu qu tht mch mỏu c ỏnh giỏ thụng qua s bt mu dung dch trypan blue phớa sau vựng tht Nu vic tht chi thnh cụng, dung dch mu xanh s khụng lu thụng qua c phn mch mỏu phớa sau vựng tht, do ú chi sau khụng bt mu xanh Ngc li, chi sau s bt mu xanh... mỏu chi bng liu phỏp t bo gc ỏnh du t bo ghộp bng chuyn gfp Quy trỡnh chuyn nhim virus mang gen gfp vo t bo c thc hin theo quy trỡnh c xut bi Burnt v cng s (2011) S biu hin ca GFP trong t bo EPC c kim nh bng flowcytometry Ghộp t bo vo chi tc nghn mch mỏu chut - ỏnh giỏ hiu qu iu tr tc nghn mch mỏu chi, cỏc thớ nghim c tin hnh nh sau: o Thớ nghim 1: Cy ghộp t bo tin thõn ni mụ ty xng chut vo chi tc... do ú chi sau khụng bt mu xanh Ngc li, chi sau s bt mu xanh Phng phỏp 2 : ỏnh giỏ s phự n chi bng cỏch o t l khi lng mụ khụ/t 10 T l khi lng mụ t/khụ th hin mc phự n chi c xut bi Takako Goto (2006) tr thnh mt trong nhng ch tiờu ỏnh giỏ mc phự n chut thiu mỏu chi cp tớnh Quy trỡnh tin hnh: Chut c ỏnh giỏ s phự n chi ti thi im 3 ngy sau khi tht ng mch Mụ c ựi vi khi lng khong 0,1 0,5 mg c thu nm bờn... ghộp t bo tin thõn ni mụ ty xng chut vo chi tc nghn mch mỏu o Thớ nghim 2: Cy ghộp t bo gc trung mụ t mụ m chut vo chi tc nghn mch mỏu o Thớ nghim 3: Cy ghộp kt hp hai loi t bo : t bo gc trung mụ t mụ m v t bo gc ty xng chut vo chi tc nghn mch mỏu o Thớ nghim 4 (nghim thc i chng): tiờm PBS vo chi tc nghn mch mỏu ca chut - V trớ cy ghộp: tiờm trc tip vo mụ - Mt t bo ghộp: 105 -106 t bo/ con - V trớ cy... Chut bnh tc nghn mch mỏu chi C mu + S lng ng vt cho 1 ln kho sỏt ti thiu l 15 con, s ln lp li ti thiu l 3 ln + Tt c cỏc s liu thu nhn c c x lớ loi b giỏ tr bt thng v x lớ thng kờ vi tin cy trờn 95% 9 5.3 Cỏc phng phỏp nghiờn cu S b trớ thớ nghim: Hỡnh 1: S b trớ thớ nghim chung Cỏc phng phỏp thc hin chớnh: Phng phỏp 1: To mụ hỡnh chut thiu mỏu chi Mụ hỡnh chut thiu mỏu chi c to theo quy trỡnh c... mch mỏu khu vc phớa sau v trớ tc nghn S dng h thng chp mch mỏu cú th xỏc nh c cu trỳc mch chut mụ hỡnh bnh lý so vi chut bỡnh thng Phng phỏp 4 : Thu nhn t bo cú nhõn t ty xng chut Thu nhn xng chi trờn v xng chi di ca chut nht trng Chut c git bng cỏch kộo dón t sng c v t lờn khay nhụm, lt ht da ph hai chõn chut, ct v thu nhn ựi chut, t vo cc cha PBS Ton b phn c, gõn, m ựi chut c loi b, thu nhn xng...T bo gc trung mụ t ty xng chut c tin hnh thu nhn theo cỏc phng phỏp c bin i t phng phỏp ca Gnecchi v Mel (2007) Cỏc TBG trung mụ ng viờn c cy chuyn 3-5 ln c khng nh c tớnh thụng qua cỏc ch tiờu: - Kh nng bỏm dớnh vo b mt a nuụi - Kh nng bit húa ca t bo: cỏc TBG trung mụ c xỏc nhn da trờn kh nng... con - V trớ cy ghộp: tiờm trc tip vo v trớ tht mch mỏu 8 - C mu cho mi lụ thớ nghim ớt nht l 15 con, lp li 3 ln S liu c x lý bng phn mm thng kờ vi tin cy trờn 95% ỏnh giỏ s tỏc ng ca t bo lờn s phc hi chi tc nghn mch mỏu Cỏc ch tiờu ỏnh giỏ bao gm: o ỏnh giỏ s lu thụng v lu lng mỏu bng chp Doppler o ỏnh giỏ s hỡnh thnh mch mỏu mi o ỏnh giỏ s thay i cu trỳc mụ bng phng phỏp nhum húa mụ v húa mụ min dch... gi, hiu qu chuyn nhim virus c kim tra di kớnh hin vi hunh quang v phõn tớch flow cytometry Phng phỏp 12: Ghộp t bo T bo mang gen gpf c tỏch khi b mt a nuụi s dng trypsin/EDTA Lụ thớ nghim chut thiu mỏu chi c iu tr bng ghộp 106 t bo gc trung mụ trn vi 106 t bo tin thõn ni mụ trong 100àl PBS cho mi con, ghộp ti vựng c võn quanh v trớ mch mỏu b tht, ti thi im trc 6 gi tớnh t khi tht v ct mch mỏu ựi nghim... Tn, Phm Minh Thụng, Phm Thng, Cao Vn Thnh, Lờ N Hũa Hip, on Quc Hng, Nguyn Vn Móo; Dng c Hựng (2010), chuyờn o to liờn tc: khuyn Cỏo 2010 Ca Hi Tim Mch Hc Quc Gia Vit Nam V Chn oỏn V iu Tr Bnh ng Mch Chi Di (phn I), tp chớ sinh hc, s 58: 74-85 Phan Kim Ngc, Phm Vn Phỳc v CS, (2008) Thu nhn t bo gc trung mụ a nng t mỏu cung rn ngi, Tp chớ Y dc hc quõn s, 2:119-124 Phan Kim Ngc, Phm Vn Phỳc, Trng nh