Ứng dụng kỹ thuật multiplex – pcr để phát hiện các gen độc lực của vi khuẩn escherichia coli phân lập từ phân bò, phân heo tiêu chảy và thịt bò

coli mang nhiều gen độc lực như gen eae chịu trách nhiệm sản sinh intimin giúp vi khuẩn bám dính vào niêm mạc ruột; gen hly sản sinh độc tố gây dung giải hồng cầu; gen stx1, stx2 sản sin

Phần 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Escherichia coli (E coli) là vi khuẩn sống cộng sinh chiếm ưu thế trong

hệ vi sinh vật đường ruột của người và động vật Tuy nhiên, khi có điều kiện

thích hợp, một số nhóm E coli gây độc tăng sinh mạnh, trở thành nguyên nhân gây tiêu chảy nghiêm trọng trên người và gia súc, đặc biệt là gia súc non E coli

được xem là vi khuẩn chỉ danh ô nhiễm thực phẩm và nước dựa vào số lượng

của chúng E coli thải qua phân ra môi trường bên ngoài Nếu quá trình vệ sinh kém thì E coli dễ vấy nhiễm vào thịt tươi, nhất là trong quá trình giết mổ Từ đó

nếu việc bảo quản và chế biến thực phẩm không thích hợp thì ngộ độc thực

phẩm do E coli hoàn toàn có thể xảy ra.

E coli được chia thành nhiều nhóm như STEC, EPEC, ETEC, EAEC Trong đó, nhóm STEC (Shiga Toxin Producing E coli) mang nhiều gen độc lực như gen eae chịu trách nhiệm sản sinh intimin giúp vi khuẩn bám dính

vào niêm mạc ruột; gen hly sản sinh độc tố gây dung giải hồng cầu; gen stx1, stx2 sản sinh các độc tố shiga gây hội chứng viêm kết tràng xuất huyết (HC =

hemorrhagic colitis) và hội chứng huyết niệu (HUS = hemolytic uraemic

syndrome) ở người, gen stx2e sản sinh độc tố vero gây bệnh phùng thủng và tiêu chảy ở heo cai sữa Trong khi đó, nhóm ETEC (Enterotoxigenic E coli )

mang gen lt sản sinh độc tố ruột kém chịu nhiệt (heat labile toxin = LT) và gen

st sản sinh độc tố ruột chịu nhiệt (heat stable toxin = ST) gây tiêu chảy trên người và vật nuôi Nhóm EPEC (Enteropathogenic E coli) mang gen eae sản

sinh protein intimin, …

Trước đây, để phát hiện E coli, người ta sử dụng phương pháp nuôi cấy

truyền thống Phương pháp này gặp khó khăn là tốn thời gian, dịch bệnh đã lây

lan rồi thì mới có kết quả Hơn nữa, E coli là vi khuẩn bình thường ở đường ruột và cũng thường có mặt trong thực phẩm nên việc phân lập được vi khuẩn E coli trong phân để tìm nguyên nhân gây bệnh hay xác định số lượng vi khuẩn

trong thực phẩm hoàn toàn không phản ánh được khả năng gây độc của chúng.

Do vậy, việc phát hiện các gen gây độc của E coli bằng kỹ thuật PCR là bước

cần thiết góp phần đánh giá nguy cơ gây bệnh trên vật nuôi và con người PCR

là phương pháp nhanh, đặc hiệu, cho kết quả trong thời gian ngắn, kịp thời pháthiện mầm bệnh để góp phần ngăn chặn tác hại của dịch bệnh

Do đó, được sự đồng ý của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, trường đại họcNông Lâm TP HCM, dưới sự hướng dẫn của PGS TS Nguyễn Ngọc Tuân,BSTY Bùi Thị Thu Trang, chúng tôi đã thực hiện đề tài:

“Ứng dụng kỹ thuật multiplex – PCR để phát hiện các gen độc lực

của vi khuẩn Escherichia coli phân lập từ phân bò, phân heo tiêu chảy và

thịt bò”

1.2 Mục tiêu

- Phát hiện một số gen độc lực của E coli bằng kỹ thuật multiplex – PCR

từ mẫu phân tiêu chảy của bò, bê, heo và mẫu bề mặt thịt bò

1.3 Mục đích

- Góp phần chẩn đoán và kiểm soát bệnh do E coli gây ra cho động vật và

người

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Vi khuẩn E coli

2.1.1 Định nghĩa

- Vi khuẩn Escherichia coli là tên được đặt theo tên của nhà bác sĩ nhi

khoa người Đức Theodor Escherich (1857-1911), ông là người đầu tiên phân lập

và mô tả vi khuẩn này vào năm 1885

- Vi khuẩn E coli thuộc họ Enterobacteriaceae, giống Escherichia (Theo

hệ thống phân loại của Bergey)

- E coli là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí tùy nghi, di động, kích thước

khoảng 1,5 m x 0,5m, không hình thành bào tử và có giáp mô (Trần Thanh

Phong, 1996) E coli có mặt thường xuyên và chiếm ưu thế trong ruột của người

và động vật máu nóng, ở phần cuối của ruột non và ruột già Nó vừa là vi khuẩncộng sinh thường trực ở đường tiêu hóa, vừa là vi khuẩn gây ra rất nhiều bệnhđường ruột và ở các cơ quan khác

2.1.2 Nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa

- Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 35 -37oC, pH thích hợp 6,4 – 7,5 (tối ưu

là 7,2 – 7,4)

- E coli có thể được phục hồi dễ dàng từ những mẫu có nguồn gốc khác

nhau trên môi trường chọn lọc ở 37oC trong điều kiện hiếu khí E coli thường

được phân lập bằng môi trường Mac Conkey (MAC) hoặc eosin methylene blue

agar (EMB) Trên môi trường thạch EMB, E coli cho khuẩn lạc tím ánh kim; trên môi trường thạch Mac Conkey, E coli cho khuẩn lạc đỏ hồng Ngoài ra, ta

có thể sử dụng môi trường SMAC (Sorbitol Mac Conkey) để phân biệt nhómSTEC không lên men đường sorbitol Trên môi trường SMAC, nhóm STEC cho

khuẩn lạc điển hình màu trắng, hơi nhầy, còn các nhóm E coli lên men sorbitol

cho khuẩn lạc màu hồng (FDA, 2002)

- E coli mọc tốt trên môi trường thạch dinh dưỡng (NA: nutrient agar),

sau 24 giờ hình thành những khuẩn lạc dạng S (smooth) màu xám trắng, tròn,ướt, bề mặt bóng, kích thước khoảng 2 – 3mm

- Trong môi trường lỏng, sau 4 – 5 giờ, E coli làm đục nhẹ môi trường,

càng để lâu càng đục, có mùi hôi thối; sau vài ngày có thể có ván mỏng trên mặtmôi trường

- Để phân biệt E coli và các vi khuẩn đường ruột khác, người ta dùng phản ứng IMViC (Indol, Methyl Red, Voges Proskauer, Citrate) E coli cho kết

quả là + + - - (biotype 1) hoặc - + - - (biotype 2) (FAO, 1992)

tồn tại khoảng 30 type kháng nguyên H

2.1.4 Cơ chế chung về khả năng gây tiêu chảy của E coli

Có ba cơ chế chung về khả năng gây tiêu chảy của E coli:

- Sản xuất độc tố: Gồm các nhóm như ETEC, EAEC, STEC

- Tấn công – xâm lấn: Gồm nhóm EIEC

- Bám dính, truyền tín hiệu qua màng: Gồm các nhóm như EPEC, EHECTuy nhiên, tác động qua lại giữa cơ thể vật chủ và màng nhầy ruột thì đặchiệu cho mỗi loại (Nataro và Kaper, 1998)

2.1.5 Phân loại E coli

Dựa trên đặc điểm gây bệnh (đặc tính độc lực, sự tác động khác nhau lênmàng nhày của ruột, hội chứng lâm sàng của bệnh và sự khác nhau về mặt dịch

tễ của bệnh), E coli được chia thành 5 nhóm sau:

 STEC (Shiga toxin – producing E coli) hoặc VTEC (Vero

toxingenic E coli) và EHEC (Enterohaemorrhagic E coli)

 EPEC (Enteropathogenic E coli)

 EAEC (Enteroaggregative E coli)

 ETEC (Enterotoxigenic E coli)

 Những nhóm khác gây bệnh tiêu chảy:

- EIEC (Enteroinvasive E coli)

- DAEC (Diffusely adherent E coli)

2.1.5.1 Nhóm STEC/ VTEC/ EHEC

a Danh pháp

Những hướng khác nhau trong nghiên cứu đã đưa ra những danh pháp

khác nhau để đặt tên cho nhóm E coli này:

- Tên gọi Verotoxigenic E coli hoặc Vero cytotoxin producing E coli

(VTEC) được Konowalchuk và cộng sự đặt cho nhóm này khi phát hiện nhómnày sản xuất độc tố gây độc cho dòng tế bào vero vào năm 1997 Tên gọi VTECđược sử dụng rộng rãi ở Anh và nhiều tổ chức khoa học ở Châu Âu

- Tên gọi Enterohaemorrhagic E coli (EHEC) được đặt là do dòng

này gây viêm kết tràng xuất huyết (HC: haemorrhagic colitis) và hội chứnghuyết niệu (HUS: haemolytic uraemic syndrome) (Nataro và Kaper, 1998)

- Tên Shiga toxin - producing E coli (STEC) (trước đây gọi là Shiga like toxin - producing E coli - SLTEC) chỉ rõ khả năng sinh độc tố gây độc tế

bào giống như độc tố Shiga (Calderwood và ctv, 1997) Tên gọi STEC được sửdụng nhiều trong các tạp chí khoa học ở Mỹ

STEC và VTEC là hai thuật ngữ tương đương nhau và cả hai đều chỉ ra

rằng nhóm E coli sản sinh ra một hay nhiều loại độc tố gây độc tế bào Mặc dù

vậy, không phải có gen sản sinh độc tố là có thể gây bệnh nếu không có các yếu

tố độc lực khác Những dòng E coli mang gen sản sinh độc tố cũng hiện diện

trong ruột gia súc khỏe mạnh với một số lượng rất ít, nhưng những dòng nàythiếu một vài hay tất cả những yếu tố độc lực khác nhau của STEC (Beutin vàctv, 1995) Do đó, không phải tất cả STEC đều có khả năng gây bệnh (Nataro vàKaper, 1998)

b Shiga toxin và những yếu tố khác ảnh hưởng đến đặc tính gây bệnh của STEC

* Shiga toxin

Những dòng STEC sản sinh độc tố Shiga toxin (Stx), hay còn được gọi làVerotoxins (VT) hoặc Shiga – like toxins (Slt)

Họ độc tố Stx gồm hai nhóm chính không phản ứng chéo với nhau là Stx1

và Stx2, được mã hóa bởi gen stx1 và stx2 Cả hai độc tố này được cấu tạo từ 5 tiểu đơn vị B (được mã hóa bởi stxB) và 1 tiểu đơn vị A (được mã hóa bởi stxA).

Cả hai gen stxA và stxB được định vị trên bacteriophage ôn hòa được chèn vào

trong nhiễm sắc thể (NST) của STEC Một dòng STEC chỉ sản xuất độc tố Stx1,hoặc Stx2, hoặc cả hai, hoặc thậm chí nhiều dạng Stx2 Ba dạng Stx2 được xácđịnh: Stx2, Stx2c, và Stx2e (Pierard và ctv, 1998) Subtype Stx2e gây bệnh phùthủng ở heo hơn là gây bệnh ở người Nhưng thỉnh thoảng những dòng này cũng

có thể được phân lập từ bệnh nhân HUS (Thomas và ctv, 1994) Nhiều khingười ta có thể thay thế giữa thuật ngữ Stx và VT (ví dụ: Stx1 = VT1 = Slt1,Stx2e = VT2e = Slt2e v.v…) (Caldervood và ctv, 1997) Hầu hết những phươngpháp chẩn đoán phân tử đều có mục tiêu phát hiện gen mã hóa Stx của nhómSTEC (Cocolin và ctv, 2000)

* Những yếu tố độc lực khác ảnh hưởng đến đặc tính gây bệnh của STEC

Những yếu tố độc lực khác của STEC là enterohaemolysin (Ehly) và cóthể là heat – stable enterotoxin (EAST1) Gen mã hóa Ehly nằm trên plasmid 60– MDa mà plasmid này được tìm thấy ở nhiều dòng O157:H7 và cũng hiện diện

ở các dòng STEC không phải O157 Ở Đức, gần 90% dòng STEC được phân lập

từ bệnh nhân có gen mã hóa Ehly (Beutin và ctv, 1994) Tuy nhiên, việc sảnsinh Ehly như là một yếu tố độc lực thì khó đánh giá, vì trong các nghiên cứu

của tác giả này, E coli có Stx âm tính và Ehly dương tính là nguyên nhân làm

hư hại tế bào vero, Hep-2 hoặc Hela in vitro (Beutin và ctv, 1989) EAST1 đầutiên được mô tả trong EAEC cũng được tìm thấy trong nhiều dòng STEC.EAST1 trong mầm bệnh của STEC thì không được biết, nhưng nó có thể liênquan đến một số bệnh tiêu chảy không có máu thường xuyên được tìm thấy ởnhững người bị nhiễm STEC (Nataro và Kaper, 1998)

Yếu tố bám dính của STEC đóng vai trò quan trọng cho vi khuẩn định vị

ở tế bào ruột Đó là intimin - một loại protein có trọng lượng phân tử 94 – 97

kDa Protein intimin được mã hóa bởi gen eae (E coli attaching và effacing).

Intimin gây tổn thương dạng bám dính và phá hủy (attaching - and – effacing,A/E) ở ruột già do vi khuẩn bám chặt vào tế bào biểu mô (Donnerberg và ctv,

1993) Gen eae này cũng được tìm thấy ở nhóm EPEC Gen eae là một trong số

các gen nằm trong vùng gây bệnh 35,5 kb (gọi là vùng gây hư hại tế bào ruột locus of enterocyte effacement, LEE) Vùng LEE của STEC chứa những gen mãhóa intimin, gen mã hóa thụ thể để vận chuyển intimin là Tir (translocatedintimin receptor) và một số gen khác Vùng LEE không chỉ là điều kiện cần mà

-là điều kiện đủ cho việc hình thành tổn thương A/E Tuy nhiên, không phải tất

cả STEC đều có gen eae, nhưng tất cả EHEC đều có gen eae (Nataro và Kaper,

1998) Bệnh tích A/E phụ thuộc vào tương tác giữa protein màng ngoài vi khuẩn(protein intimin) và protein Tir Protein Tir được tiết ra khỏi vi khuẩn, chuyển vịvào màng của tế bào vật chủ (Kenny và ctv, 1997)

Hầu hết các ổ dịch do STEC gây ra bởi những dòng O157:H7, nên người

ta cho rằng có thể serotype này độc hơn và dễ lây truyền hơn những serotypekhác Dấu hiệu sinh hóa duy nhất cho những dòng STEC O157:H7 là không thểlên men sorbitol hoặc không tạo ra - glucuronidase Vì thế, ở nhiều quốc gia,

chẩn đoán STEC chỉ dựa vào việc phát hiện E coli không lên men sorbitol.

O157:H7 và các serotype không phải O157 liên quan đến việc gây bệnh ở ngườigồm O26:H11, O103:H2, O111:HNM và O113:H21 (WHO, 1994).

c Nguồn lây nhiễm

STEC có thể được tìm thấy trong phân nhiều loài động vật như trâu, bò,cừu, dê, heo, chó, mèo (Beutin và ctv, 1993; Chapman và ctv, 1997) và ngựa(Chalmers và ctv, 1997) và ngay cả chim hải âu (Makino và ctv, 2000) Loàiđộng vật quan trọng nhất trong việc lây nhiễm cho người là bò Đường lâynhiễm chủ yếu của STEC vào chuỗi thực phẩm là việc vấy nhiễm những thànhphần trong ruột và phân trong quá trình giết mổ (Butler, 1996)

STEC thường lây truyền sang người qua thực phẩm, nước và từ người nàysang người khác Hầu hết các trường hợp bệnh là do ăn thực phẩm đã bị nhiễm,đặc biệt là thực phẩm có nguồn gốc động vật Trong đó thịt bò là nguyên nhânchủ yếu (Keskimaki, 2001)

2.1.5.2 Nhóm EPEC

Thuật ngữ enteropathogenic E coli được gọi tên đầu tiên bởi Neter và ctv (1955) để chỉ những dòng E coli gây tiêu chảy ở trẻ em.

a Đặc điểm

Cũng như STEC, EPEC có mang gen eae mã hóa protein intimin giúp vi

khuẩn bám dính vào niêm mạc ruột và gây hư hại (A/E); nhưng EPEC khôngsản xuất độc tố Shiga

b Sự bám dính và phá hủy (AE) của những dòng EPEC

Dấu hiệu của sự nhiễm bệnh do EPEC là hình thành bệnh tích kiểu A/E,

có thể quan sát được trên mẫu sinh thiết ruột từ những bệnh nhân hay thú bịnhiễm và trong nuôi cấy tế bào (Nataro và Kaper, 1998) Dạng tổn thương nàyđược đặc trưng bởi sự hư hại của các vi nhung mao và sự kết dính chặt giữa vikhuẩn và màng tế bào biểu mô Tổn thương này khác với dạng tổn thương do

ETEC và Vibrio cholerae (ETEC và V cholerae bám theo kiểu không chặt,

không gây bào mòn vi nhung mao) Gen cần thiết cho việc tạo tổn thương A/E là

gen eae mã hóa intimin Protein này là yếu tố độc lực cần thiết của EPEC

(Donnerberg và ctv,1993) Theo Nataro và Kaper (1998), gen eae hiện diện ở tất

cả các chủng EPEC, EHEC, Clostridium rodentium và Hafnia alvei, nhưng không hiện diện ở những dòng E coli thuộc hệ vi khuẩn đường ruột thông

thường

c Dịch tễ của sự nhiễm EPEC

Cũng như những E coli gây bệnh khác, sự truyền lây của EPEC qua

đường miệng, với sự vấy nhiễm qua tay, qua thực phẩm

Điểm đáng chú ý nhất về mặt dịch tễ của bệnh do EPEC là sự phân bố lứatuổi Bệnh thường biểu hiện cấp tính với tiêu chảy nghiêm trọng ở trẻ em Ngườitrưởng thành và trẻ em lớn có phần đề kháng hơn với bệnh mà nguyên nhân cóthể là do mất các thụ thể đặc hiệu Tuy nhiên, EPEC cũng có thể gây tiêu chảy ởngười lớn nếu số lượng vi khuẩn đủ cao

2.1.5.3 Nhóm ETEC

a Các yếu tố độc lực: ETEC có hai nhóm quyết định độc lực là độc tố ruột

(enterotoxin) và yếu tố định vị (colonization factor – CF)

 Độc tố ruột enterotoxin

Nhóm ETEC sản sinh độc tố ruột Có hai loại: độc tố ruột chịu nhiệt (ST)

và độc tố ruột kém chịu nhiệt (LT)

(1) Độc tố kém chịu nhiệt (heat – labile toxin – LT):

Độc tố LT của E coli là oligopeptide có liên hệ gần gũi về mặt cấu trúc

và chức năng với độc tố gây bệnh tả trên người (cholera toxin – CT) do Vibrio cholerae tiết ra LT và CT giống nhau nhiều đặc tính như cấu trúc, trình tự acid

amin (giống nhau khoảng 80%), tương đồng về thụ thể, hoạt tính enzyme, vàkiểu tác động của nó trên động vật hay trong nuôi cấy tế bào LT có haiserogroup chính là LT-I và LT-II LT-I và LT-II không có phản ứng chéo về mặtmiễn dịch

- LT-I: Được tiết bởi những dòng E coli gây bệnh trên người và thú LT-I

là một oligopeptide khoảng 86 kDa, được cấu tạo bởi 1 tiểu đơn vị A 28 kDa và

5 tiểu đơn vị B 11,5 kDa Tiểu đơn vị A chịu trách nhiệm như một enzym, gồm

peptide A1 và peptide A2 liên kết nhau bởi cầu nối disulfur Những tiểu đơn vị Bsắp xếp thành vòng nhẫn, liên kết chắc chắn với ganglioside GM1 và liên kếtlỏng lẻo với GD1b và vài glycoprotein ruột (các thụ thể của LT) Hai loại LT-I

có liên hệ gần nhau và phản ứng chéo một phần với nhau là LTp (LTp-I) đầutiên được phân lập từ heo và LTh (LTh- I) được phân lập từ người Gen mã hóa

cho LT là elt hay lt-I nằm trên plasmid mà plasmid này có thể chứa cả gen mã

hóa ST và / hoặc gen mã hóa những kháng nguyên của yếu tố định vị(colonization factor antigen – CFA)

Sau khi bám vào màng tế bào niêm mạc ruột của vật chủ, độc tố LT-Ithâm nhập qua màng trong tế bào, kích thích adenylate cyclase hoạt động dẫnđến làm tăng mức AMP vòng (cAMP) trong tế bào cAMP hoạt hóa proteinkinase (A kinase) từ dạng không hoạt động thành dạng hoạt động Điều này dẫnđến sự phosphoryl những kênh chloride hoạt động trên mức bình thường ở màng

tế bào biểu mô Kết quả là kích thích những tế bào mào ruột tiết ra Cl- một cáchtích cực, đồng thời ức chế sự hấp thu NaCl bởi những tế bào nhung mao (villus).Đây chính là nguyên nhân dẫn đến tiêu chảy dữ dội (Nataro và Kaper, 1998)

- LT – II: LT-II có cấu trúc giống với LT – I và CT khoảng 55 – 57% ởtiểu đơn vị A, nhưng không giống với LT-I và CT ở tiểu đơn vị B LT-II cũnglàm gia tăng cAMP trong tế bào qua cơ chế tương tự như LT-I, nhưng LT-IIkhông liên quan đến bệnh trên người và thú

(2) Độc tố chịu nhiệt (heat – stable toxin – ST)

Ngược với LT, ST có trọng lượng phân tử nhỏ và những cầu nối disulfurcủa nó giải thích cho khả năng chịu nhiệt của độc tố này ST được chia thành hainhóm là STa và STb Hai nhóm này khác nhau về cấu trúc và cơ chế hoạt động.Gen mã hóa cho cả hai nhóm được tìm thấy chủ yếu trên plasmid và vài gen mãhóa ST cũng được tìm thấy trên transposon Độc tố STa (hay còn gọi là ST-I) do

ETEC sản sinh và một vài vi khuẩn Gram âm khác gồm Yersinia enterocolitica

và V cholerae không phải O1 ST giống 50% trình tự acid amin với độc tố chịu

nhiệt EAST1 của EAEC Một số báo cáo gần đây cho rằng một vài dòng thuộc

nhóm ETEC ngoài việc sản sinh ra STa, còn có thể sản sinh độc tố EAST1.Trong khi đó, STb chỉ được tìm thấy ở ETEC.

- STa: STa là một peptide gồm 18 – 19 acid amin với trọng lượng phân tửkhoảng 2 kDa STa được chia thành hai loại là STp (ST porcine hoặc STIa) từ

E coli phân lập được trên heo và STh (ST human hoặc STIb) của E coli phân

lập trên người Cả hai độc tố có thể được tìm thấy ở các dòng ETEC trên người

Thụ thể chính của STa là enzyme xuyên màng guanylate cyclase C C) STa kết hợp với thụ thể GC-C gây hoạt hóa GC, dẫn đến việc gia tăng lượngcGMP nội bào Hoạt động này cuối cùng dẫn đến sự gia tăng tiết Cl- và / hoặcngăn cản sự hấp thu NaCl, dẫn đến tăng lượng tiết chất lỏng trong ruột, gây tiêuchảy

(GC STb: STb chủ yếu được tạo ra bởi những dòng ETEC được phân lập từheo, vài chủng ETEC được phân lập từ người cũng sản sinh STb Không nhưSTa, STb gây ra những tổn thương về mặt mô học trên lớp biểu mô ruột như mất

tế bào nhung mao của lớp biểu mô ruột và teo nhung mao một phần Thụ thể củaSTb chưa được biết rõ mặc dù gần đây người ta cho rằng độc tố kết hợp khôngđặc hiệu với màng tế bào chất trước khi vào bên trong tế bào Không gây ra sựtiết Cl- nhưng STb kích thích tế bào ruột tiết bicarbonat (HCO3-) STb không làmtăng cAMP hay cGMP nội bào mặc dù nó kích thích tăng lượng calci nội bào từngoại bào STb còn kích thích phóng thích PGE2 và serotonin, từ đó người tacho rằng hệ thần kinh ruột cũng có thể liên quan đến đáp ứng tiết dịch gây ra bởiđộc tố này (Hitotsubashi và ctv, 1992)

 Yếu tố định vị (colonization factor – CF)

Cơ chế mà ETEC kết dính và cư trú trên lớp màng nhầy ruột đã đượcnghiên cứu kỹ Để gây tiêu chảy, ETEC đầu tiên phải kết dính vào tế bào ruộtnon nhờ vào lông trên bề mặt của vi khuẩn, gọi là yếu tố định vị (CF hay CFA -Colonization factor antigens)

CFA có thể được phân loại dựa trên đặc tính hình thái Có 3 loại chínhgồm loại lông hình que cứng, lông hình que mềm dạng bó, lông có cấu trúc

mảnh mềm Có ít nhất 20 loại CF trong ETEC ở người Hầu hết, chúng được mãhóa bởi gen nằm trên plasmid, cũng là nơi mã hóa độc tố ST và/hoặc LT(Gaastra và Svennerholm, 1996) Tiểu đơn vị cấu trúc lông thường tạo miễndịch vượt trội do đó tiểu đơn vị có tính kháng nguyên rất mạnh

em trong vùng này sẽ đương đầu với ETEC trong thời kì thôi bú Trẻ em đã ởtuổi đến trường và người lớn có nguy cơ tiêu chảy do ETEC rất thấp DòngETEC sản sinh ST là nguyên nhân của hầu hết các trường hợp bệnh

Các nghiên cứu dịch tễ học cho thấy rằng, thức ăn và nước bị ô nhiễm lànhững phương tiện chủ yếu gây nhiễm ETEC (Black và ctv, 1981) Sự nhiễmETEC, ở những vùng dịch thường tập trung chủ yếu vào những tháng nóng vàẩm; khi đó, sự nhân lên mạnh mẽ của ETEC trong thực phẩm và nước

Mặc dù sự nhiễm ETEC xảy ra chủ yếu trên trẻ em, nhưng những ngườitrưởng thành chưa có miễn dịch cũng dễ bị nhiễm Thật vậy, ETEC là nguyênnhân chính gây tiêu chảy trên du khách trưởng thành từ những nước đã pháttriển đến thăm những vùng có dịch ETEC Nhiều nghiên cứu cho rằng 20 - 60%

số du khách này có triệu chứng tiêu chảy và 20 - 40% các trường hợp là doETEC Tiêu chảy trên du khách thường xảy ra ở những du khách lần đầu tiênđến thăm những nước đang phát triển Tiêu chảy trên du khách thường là dothức ăn và nước uống bị ô nhiễm

c Khía cạnh lâm sàng

Triệu chứng bệnh thường xảy ra đột ngột với thời gian nung bệnh ngắn(14 – 50 giờ) Bệnh nhân tiêu chảy toàn nước, thường không có máu; một vàibệnh nhân có hiện tượng sốt và ói mửa Tiêu chảy do ETEC có thể nhẹ, ngắn và

tự bớt dần nhưng cũng có thể gây ra tiêu chảy nghiêm trọng giống như nhiễm

Vibrio cholerae.

Hầu hết các trường hợp nhiễm ETEC nguy hiểm đến tính mạng xảy ratrên trẻ em thôi bú ở những nước đang phát triển Mặc dù việc sử dụng khángsinh nhạy cảm cũng làm giảm mức độ tiêu chảy, nhưng những thuốc trị có hiệuquả thì không sẵn có ở những vùng nguy cơ cao; ngoài ra sự đề kháng khángsinh của dòng ETEC cũng là vấn đề đáng quan tâm Do đó cần phải lưu ý rằng

cơ sở của việc chăm sóc bệnh nhân nhiễm ETEC là duy trì đủ lượng nước trong

cơ thể nếu có triệu chứng tiêu chảy

d Phát hiện và chẩn đoán

Việc phát hiện nhóm ETEC dựa vào sự phát hiện độc tố LT và/hoặc ST

Có nhiều phương pháp phát hiện ETEC như: radioimmunoassay, enzyme linkedimmunosorbent assay (ELISA), DNA-probe, PCR…

2.2 Kỹ thuật PCR

2.2.1 Nguyên tắc

PCR (polymerase chain reaction - phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờpolymerase) do Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 PCR là kỹ thuật invitro cho phép nhân nhanh một gen mong muốn lên hàng triệu lần trong mộtthời gian ngắn (tạo dòng in vitro, không cần sự hiện diện của tế bào)

Sự khuếch đại những primer oligonucleotide Primer là những phân tửDNA đơn, ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn(trình tự DNA mẫu xét nghiệm) nhờ DNA polymerase, và dNTP(deoxyribonucleotide triphosphate) trong điều kiện phản ứng thích hợp Cácprimer này gồm có primer “xuôi” (forward primer) và primer “ngược” (reverseprimer) Kết quả là sẽ có những chuỗi DNA mới bổ sung với sợi DNA mẫu

Những chuỗi này sẽ tồn tại dưới dạng DNA chuỗi đôi Sự tổng hợp này sẽ đượclặp lại theo một số chu kỳ nhất định đã được thiết lập.

Multiplex – PCR là một cải tiến của kỹ thuật PCR mà trong đó có thểnhân lên đồng thời nhiều đoạn DNA mong muốn bằng cách sử dụng nhiều cặpprimer trong một phản ứng Multiplex – PCR đầu tiên được mô tả bởiChamberlain năm 1988 và kể từ đó multiplex – PCR được ứng dụng rất nhiềutrong các lĩnh vực kiểm tra DNA (Protocol online)

2.2.2 Các giai đoạn của phản ứng PCR

Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau Mỗi chu kỳgồm ba giai đoạn:

 Giai đoạn 1: Giai đoạn biến tính (denaturation)

Hai mạch của phân tử DNA tách rời nhau thành hai mạch đơn Phân tửDNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử,thường là ở 94 -950C trong vòng 30 giây đến 1 phút

 Giai đoạn 2: Giai đoạn ủ bắt cặp (anealing)

Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các primer) cho phép các primerbắt cặp với khuôn, trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động khoảng 40 – 600Ctuỳ thuộc Tm của các primer sử dụng và kéo dài từ 30 giây dến 1 phút

 Giai đoạn 3: Giai đoạn kéo dài (elongation hay extension)

Nhiệt độ giai đoạn này được tăng lên 720C giúp DNA polymerase hoạtđộng tổng hợp DNA tốt nhất với sự hiện diện của 4 deoxyribonucleotidetriphosphate Đoạn DNA nằm giữa hai primer được tổng hợp tạo thành chuỗiDNA

* Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn trên sẽ được lặp lại nhiều lần và mỗi lầnlàm tăng đôi lượng DNA mẫu của lần trước Tổng DNA khuếch đại được tínhtheo công thức:

Tổng DNA khuếch đại = m*2nVới n: Số chu kỳ; m: Số bản sao của chuỗi mã hóa

* Sản phẩm kéo dài ở chu kỳ đầu tiên có chiều dài không xác định vìDNA polymerase sẽ tiếp tục tổng hợp DNA mới đến khi nó dừng lại hoặc bị pháhủy bởi chu kỳ tiếp theo.Sản phẩm kéo dài ở chu kỳ thứ hai cũng không xácđịnh Tuy nhiên, ở chu kỳ thứ 3, đoạn DNA mong muốn (DNA đích) được tổnghợp có chiều dài xác định Từ chu kỳ thứ 4 trở đi, trình tự đoạn DNA đích đượckhuếch đại Vì thế số copy cuối cùng của trình tự đích được tính theo công thức:

Số copy cuối cùng của trình tự đích = (2n – 2n) * x

n : Số chu kỳ

2n: Sản phẩm có chiều dài không xác định sau chu kỳ 1 và 2

x : Số bản sao của chuỗi mã hóa

+ Giai đoạn sau đó, hiệu quả khuếch đại giảm hẳn do:

 Phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng

 Xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế lại phản ứng

 Các bản sao vừa tổng hợp không kết hợp với primer mà lạibắt cặp với nhau

Số chu kỳ của phản ứng tùy thuộc số lượng mẫu ban đầu DNA mẫu banđầu là 105 thì cần khoảng 25 – 30 chu kỳ, còn DNA mẫu là 102 – 103 thì số chu

kỳ phải là 35 – 40

Giai đoạn biến tính (denaturation)

Giai đoạn ủ bắt cặp (anealing)

Giai đoạn kéo dài (elongation hay extension)

Hình 2.1 Nguyên lý của phản ứng PCR

Hình 2.2 Chu kỳ nhiệt độ của phản ứng PCR 2.2.3 Các thành phần của một phản ứng PCR

- DNA mẫu: là thành phần cần khuếch đại

- Primer: Primer là những đoạn oligonucleotide mạch đơn, cĩ trình tự bổsung với trình thự base của hai đầu mạch khuơn để khởi đầu quá trình tổng hợpDNA Việc chọn primer là giai đoạn quyết định của phản ứng PCR Các primerđược chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, khơng trùng với cáctrình tự lặp lại trên gen, khơng cĩ sự bắt cặp bổ sung giữa primer xuơi và primerngược và cũng khơng cĩ những cấu trúc kẹp tĩc do sự bắt cặp bổ sung trongcùng một primer Chiều dài các primer tối thiểu cho hầu hết các ứng dụng PCR

là 18 nucleotide (thường là 18 – 24 nucleotide) Trình tự nằm giữa hai primerxuơi và ngược khơng quá lớn, phản ứng PCR sẽ tối ưu trên những trình tự nhỏhơn 1kb

Biến tính 94-95 0 C

Ủ bắt cặp

40-70 0 C

Kéo dài

72 0 C

Lặp lại n lần

Thời gian (phút)

- Taq polymerase: Taq polymerase là một DNA polymerase chịu nhiệt, được chiết tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus ở suối nước nóng Taq DNA

polymerase không bị phá hủy ở nhiệt độ cao và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đếncuối quá trình phản ứng dưới sự hiện diện của Mg2+ Taq DNA polymerase tổng

hợp DNA theo hướng 5’3’ và hoạt động tốt nhất ở 70-720C

- Các nucleotide (dNTP – deoxyribonucleotide triphosphate): là hỗn hợp

4 loại: dATP, dTTP, dCTP, dGTP làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợpDNA

- Dung dịch đệm: thành phần dung dịch đệm có thể thay đổi tùy loạienzyme được sử dụng, quan trọng nhất là ion Mg2+ Nó hình thành một phức hợphòa tan với dNTP, rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzymepolymerase, làm tăng nhiệt độ nóng chảy (Tm) của DNA mạch đôi Nồng độ

Mg2+ (thường được sử dụng ở dạng MgCl2) là một yếu tố ảnh hưởng mạnh đếnhiệu quả và tính đặc hiệu của phản ứng PCR Ngoài ra nồng độ MgCl2 có thểảnh hưởng đến quá trình bắt cặp của primer, nhiệt độ để biến tính DNA thànhdây đơn, hoạt động của enzyme và sự trung thực của kết quả Nồng độ Mg2+phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm Nồng độ MgCl2trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng thường biến thiên từ 0,5 – 5mM (Hồ HuỳnhThùy Dương, 1998)

Điện di được thực hiện theo phương nằm ngang hoặc đứng Các DNAtrong gel agarose được hiện ra dưới tia tử ngoại (UV) nhờ ethidium bromide.Chất này có khả năng gắn xen giữa các base của acid nucleic và phát huỳnhquang dưới tác dụng của tia UV (bước sóng =300 nm) thành vạch màu đỏ dacam.

Để ước lượng kích thước DNA bằng gel agarose, người ta sử dụng mộtyếu tố đánh dấu “trọng lượng phân tử” (molecular weight make – MWM) là mộttập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước đã biết (DNA ladder)

2.2.5 Những ứng dụng của PCR

2.2.5.1 PCR được sử dụng để nghiên cứu lượng DNA nhỏ

PCR có khả năng sử dụng một phân tử DNA đơn như là khuôn mẫu chophản ứng khuếch đại Việc khuếch đại thành công DNA được ly trích từ tế bàogốc chỉ chứa một copy đơn của bộ gen ở người đã chứng minh được điều này

Khía cạnh này của PCR đã được chứng minh là rất quan trọng trong cácphân tích pháp lý, cho phép kỹ thuật genetic fingeprinting được sử dụng chỉ vớimột sợi tóc và thậm chí với những vết máu, khiến cho những tên tội phạm khó

có thể lọt lưới pháp luật PCR cũng được sử dụng để khuếch đại DNA từ xươngcủa những nạn nhân bị giết (trong một vài trường hợp xác định danh tánh củahọ) trong khi các phần thân xác còn lại đã bị phân rã, do đó không thể sử dụngcác phương pháp phân tích thông thường

Tính nhạy cảm của PCR mở ra những khả năng mới trong khảo cổ và cổsinh vật học, bằng cách làm cho các trình tự nucleotide được thu nhận từ các dấuvết DNA hiện diện trong các nguyên liệu được bảo tồn hay nguyên liệu hóathạch Phương pháp PCR cũng được sử dụng để nghiên cứu mối quan hệ ditruyền của người cổ xưa thông qua khuếch đại và phân tích các trình tự di truyền

từ các dấu vết DNA được giữ trong xương hay được bảo tồn trong các xác ướp

2.2.5.2 PCR được sử dụng trong chẩn đoán lâm sàng

Phương pháp PCR cho phép các thông tin giải trình tự được thu nhận mộtcách nhanh chóng, thông qua việc khuếch đại vùng liên quan trên genome dựa

trên các kết quả phân tích trực tiếp từ các sản phẩm của PCR Khả năng nhậnbiết đột biến một cách nhanh chóng không chỉ quan trọng trong chẩn đoán lâmsàng mà nó cũng làm gia tăng các nghiên cứu các bệnh di truyền.

PCR cũng được ứng dụng trong chẩn đoán các tác nhân gây bệnh Ví dụ:Khuếch đại DNA của các vi khuẩn, virus trong các mẫu bệnh phẩm trước khicác triệu chứng bệnh bắt đầu xuất hiện nhiều ngày, nhiều tuần, thậm chí nhiềutháng Từ đó ta có thể đề ra cách chữa trị thích hợp và ngăn chặn được thiệt hại

2.2.5.3 PCR được dùng để khuếch đại RNA

PCR không chỉ khuếch đại các khuôn mẫu DNA, các khuôn mẫu RNAcũng được khuếch đại nếu ban đầu chúng được biến đổi thành DNA tái tổ hợp(cDNA) nhờ enzyme reverse transcriptase

Một ứng dụng có ích của RT – PCR là xác định số lượng tương đối củamột mRNA trong các mô khác nhau hay trong cùng một mô nhưng tại các thờiđiểm khác nhau Số lượng của một mRNA trong tế bào chính là sự phản ảnh vềkhả năng hoạt động của gen cha mẹ Vì thế, sự xác định số lượng của mRNA tạo

ra những thay đổi trong sự biểu hiện gen để chúng có thể được kiểm soát

2.2.5.4 PCR được sử dụng để so sánh các genome khác nhau

Sự khuếch đại ngẫu nhiên (random amplification) với các primer ngắn là

kỹ thuật hữu dụng trong phát sinh chủng loại, khu vùng nghiên cứu liên quanđến sự tiến hóa và suy vong của các loài hay các nhóm sinh vật khác Hai sinhvật có quan hệ thân tộc sẽ có nhiều band giống nhau hơn hai sinh vật có quan hệthân tộc kém (Brown, 1994)

2.2.6.1 Trong thực nghiệm, kích thước các đoạn cần khuếch đại là giới hạn đầu tiên

Trừ vài trường hợp rất cá biệt, phương pháp PCR không hoạt động đượcvới những đoạn DNA lớn hơn 3 kb Việc sử dụng PCR đối với các DNA có độdài dưới 1,5 kb cho kết quả tốt Với những độ dài lớn hơn, điều kiện tối ưu chophản ứng phải được xác định qua thực nghiệm

2.2.6.2 Sự ngoại nhiễm là vấn đề lớn nhất đặt ra đối với PCR, gắn liền với khả năng khuếch đại bản sao đối với phương pháp này

Vấn đề đặc biệt cấp thiết trong những ứng dụng về chẩn đoán vì hậu quảrất nghiêm trọng Nguồn ngoại nhiễm lớn nhất thường là các sản phẩm khuếchđại của những lần thao tác trước Người ta đã chứng minh được rằng việc mởnắp các ống nghiệm sau những lần khuếch đại trong một khoảng không gian kíntrong phòng thí nghiệm sẽ khiến cho các phân tử đã được khuếch đại thoát rakhỏi ống nghiệm bay lơ lửng trong không khí và bám vào tường, cửa, thiết bịdung cụ…rồi nhiễm vào các phản ứng tiến hành sau đó Có thể khắc phục mộtphần vấn đề này bằng một số biện pháp sau:

- Các công đoạn thao tác khác nhau như thiết lập phản ứng PCR vàphân tích các sản phẩm khuếch đại phải được tiến hành ở những địa điểm cách

xa nhau

- Dụng cụ dùng để thiết lập phản ứng (micropipette) không sử dụngcho các thao tác khác Đầu tip sử dụng với micropipette phải có lớp lọc tránh sựnhiễm vào đầu micropipette bởi các phân tử khuếch đại khi hút dung dịch phảnứng

- Dùng tia tử ngoại để loại bỏ các phân tử còn lại từ các lần khuếchđại trước

- Tất cả các thành phần phản ứng đều được chia thành những lượngnhỏ, tính toán sao cho 1, 2 lần thao tác

2.2.6.3 Các sai sót gây ra do Taq polymerase

Sự sao chép bởi Taq polymerase cho tỉ lệ sai khá cao (10-4, nghĩa là

cứ 10000 nucleotide thì enzyme gắn sai 1 nucleotide) Đặc tính này khôngnghiêm trọng nếu ta chỉ cần xem xét kích thước hay sự có mặt của một sảnphẩm khuếch đại, nhưng có ý nghĩa lớn nếu cần xác định chính xác trình tựnucleotide của DNA Ta không thể loại bỏ hoàn toàn các sai khác này mà chỉ cóthể giảm bớt; ví dụ như đảm bảo sự cân bằng nồng độ các nucleotide trong phảnứng, xác định trình tự của nhiều sản phẩm khuếch đại từ nhiều thao tác riêngbiệt, so sánh trước khi đi đến trình tự chính thức,…

Phần 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện

- Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn được thực hiện tại phòng thực hành Kiểmnghiệm Thú sản và Môi trường, khoa Chăn nuôi – Thú y, Trường Đại học NôngLâm Thành Phố Hồ Chí Minh.

- Xác định các gen độc lực được thực hiện tại Trung Tâm Phân Tích ThíNghiệm Hóa sinh Trường Đại học Nông Lâm TP HCM

3.2 Nội dung

- Thu thập mẫu phân tiêu chảy của bò, bê, heo và mẫu bề mặt thịt bò

- Nuôi cấy, phân lập E coli trên môi trường MAC, SMAC, CT-SMAC.

- Chọn khuẩn lạc điển hình của E coli / nhóm E coli.

- Giữ gốc khuẩn lạc riêng lẻ trên ống thạch NA

- Ly trích DNA của E coli phân lập được.

- Thực hiện phản ứng multiplex – PCR để phát hiện gen gây độc của E coli.

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Lấy mẫu

- Mẫu phân tiêu chảy

Được lấy từ trực tràng bằng tăm bông rồi cho vào môi trường vận chuyểnCarry Blair Bảo quản ở 4 – 80C cho đến khi tiến hành xét nghiệm (mẫu đượcgiữ tối đa 24 giờ)

- Mẫu bề mặt thịt

Dùng gạc y tế tẩm nước muối sinh lý quét đều lên bề mặt thịt, cho vàochai có sẵn 50 ml nước peptone đệm Sau đó đậy chặt chai, cho vào túi ny lôngbuộc kỹ Bảo quản 4 - 80C, chuyển về phòng thí nghiệm

- Số lượng mẫu: Số lượng mẫu khảo sát được tính là số mẫu đã phân lập

được vi khuẩn E coli từ các mẫu đã lấy.

Bảng 3.1 Số lượng mẫu

3.3.2 Nuôi

cấy, phân lập và ly trích DNA của vi khuẩn E coli

3.3.2.1 Môi trường nuôi cấy

- Môi trường nuôi cấy, phân lập vi khuẩn: Mac Conkey (MAC), SMAC, thạch dinh dưỡng (NA), peptone đệm, Cefixime-Tellurite-SMAC (CT-SMAC), hóa chất thử IMViC…

Sorbitol-3.3.2.2 Nuôi cấy và phân lập

(1) Mẫu phân tiêu chảy được cấy trực tiếp trên đĩa thạch MAC và SMAC

để có những khuẩn lạc rời rạc sau 24 giờ ở 37oC Mẫu bề mặt thịt được làmđồng đều trong 125 ml peptone đệm phosphate có bổ sung kháng sinh cefiximevới nồng độ 0,0125 mg/l, vancomycin với nồng độ 8 mg/l (FDA, 2002) Ủ 24giờ ở 37oC, cấy sang môi trường CT-SMAC Vi khuẩn E coli nhóm STEC phát triển tạo khuẩn lạc không màu hoặc xám với tâm đục, E coli khác cho khuẩn lạc

hồng giống như trên môi trường MAC

(2) Chọn khuẩn lạc điển hình của E coli

- Quan sát các loại khuẩn lạc hiện diện trên bề mặt thạch MAC, SMAC,CT-SMAC

- Mỗi nhóm khuẩn lạc chọn 6 – 10 khuẩn lạc rời rạc đại diện E coli của

mẫu khảo sát Các nhóm khuẩn lạc như sau:

 6 – 10 khuẩn lạc hồng MAC (Ký hiệu HM)

 6 – 10 khuẩn lạc trắng SMAC (Ký hiệu TS)

 6 – 10 khuẩn lạc đỏ hồng SMAC (Ký hiệu HS)

 6 – 10 khuẩn lạc trắng CT – SMAC (Ký hiệu TC).

(3) Tăng sinh, giữ gốc khuẩn lạc riêng lẻ trên môi trường thạch dinhdưỡng (NA)

- Mỗi khuẩn lạc được chọn cấy chuyển vào ống thạch NA Phần khuẩn lạccòn lại của mỗi nhóm được thu gom chung vào 1 eppendorf chứa sẵn 0,4 - 0,5mlnước cất khử ion vô trùng để ly trích DNA nhóm khuẩn lạc (DNA tổng)

Dựa theo Cebula và ctv (1995), kết hợp với phương pháp ly trích DNA từ

E coli của Cerna và ctv (2003) và Botteldoorn và ctv (2003) để tiến hành ly trích DNA từ vi khuẩn E coli phân lập được bằng phương pháp nhiệt như sau:

đun sôi 10 phút rồi chuyển vào tủ -70oC để trong 10 phút, rã đông rồi ly tâm

13000 vòng/phút trong 3 phút Thu phần nổi làm DNA khuôn mẫu (DNA xétnghiệm)

- Quy trình phân lập vi khuẩn E coli như sau:

Cạo tất cả những khuẩn lạc đã chạm theo từng nhóm riêng:

(1) 6 – 10 khuẩn lạc đỏ hồng SMAC (2) 6 – 10 khuẩn lạc hồng MAC (3) 6 – 10 khuẩn lạc trắng SMAC (4) 6 – 10 khuẩn lạc hồng CT – SMAC (5) 6 – 10 khuẩn lạc trắng CT - SMAC

CT - SMAC (37 o C/24h)

Thu tất cả phần còn lại của những khuẩn lạc đã chọn để cấy qua ống NA theo từng nhóm riêng, cho vào eppendorf chứa sẵn 0,4 - 0,5ml H2O cất

lạc đỏ hồng trắng và / hoặc đỏ hồngChọn 6-10 khuẩn lạc trắng và / hoặc đỏ hồngChọn 6-10 khuẩn lạc

Ly trích DNA (DNA nhóm khuẩn lạc)

Sơ đồ 3.1 Phân lập, xác định E coli và phát hiện gen độc lực

3.3.3 Xác định các gen stx1, stx2, eae, hly, stx2e, sta, stb, lt-I của E coli

phân lập được bằng multiplex - PCR

- Việc phát hiện các gen độc lực của E coli được thực hiện bằng 2 phản ứng

multiplex – PCR với máy luân nhiệt (thermal cycler):

 Multiplex – PCR1: Phát hiện các gen eae, hly, stx1, stx2.

 Multiplex – PCR2: Phát hiện các gen stx2e, sta, stb, lt-I.

- Trong quá trình thực hiện phản ứng multiplex – PCR, mẫu đối chứngdương (EDL933 hoặc H44) được thực hiện đồng thời với mẫu khảo sát

 EDL933 là đối chứng dương với các gen eae, hly, stx1, stx2.

 H44 là đối chứng dương với các gen stx2e, stb, lt-I.

Hai mẫu đối chứng dương này được cung cấp từ Trường đại học Thú yToulouse (Pháp)

(Dẫn liệu của Paton & Paton, 1998a)

* Các thành phần của phản ứng multiplex – PCR1:

PCR buffer 1X: Tris-HCl (pH 8,8 ở 25oC) 750 mM, (NH4)2SO4 200 mM,0,1 % Tween 20; MgCl2 2mM; dNTP 200M; mỗi loại primer 250 mM Taq –

polymerase AB gene 0.5UI; DNA khuôn mẫu 1l; nước cất 2 lần khử ion vừa

*Các thành phần của phản ứng multiplex – PCR2:

PCR buffer 1X: Tris-HCl (pH 8,8 ở 25oC) 750 mM, (NH4)2SO4 200 mM,0,1 % Tween 20; MgCl2 2mM; dNTP 200M; primer: LTa-F 150 ng, LTa-R

150 ng, STa-F 150 ng, STa-R 150ng, STb-F 45 ng, STb-R 45 ng, Vt2e-F 225

ng, Vt2e-R 225 ng; Taq - polymerase AB gen 0.5UI; DNA khuôn mẫu 3,5l;nước cất 2 lần khử ion vừa đủ 50l

* Chu trình nhiệt của phản ứng multiplex – PCR2 (Nguyen Ngoc Hai,2002):

3.3.4 Điện di trên gel aragose và đọc kết quả điện di

Sau phản ứng multiplex - PCR, 6 l sản phẩm PCR cùng với 1,2lloading dye được điện di trên gel agarose 1,4% trong TBE 0,5X Ladder cũngđược điện di đồng thời Thời gian điện di là 30 – 35 phút ở 100V, 250mA

Sau khi điện di, gel được ngâm trong 30 phút với dung dịch ethidiumbromide 1mg/ml TBE Sau đó rửa sạch bằng nước và chụp hình gel với tia UVbằng máy chụp gel với phần mềm Quality One 2000, Bio-Rad) Các band DNAđược xác định bằng cách so với các band của đối chứng dương và ladder

stx1(180bp)

eae (384bp)

1 2 EDL Lad 3 4 933