Báo cáo tiểu luận cao học các phương pháp phân tích protein từ rong bún nước lợ

Phương pháp SDS- PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate- Polyacrylamide Gel Electrophoresis) còn được gọi là phương pháp điện di trên gel acrylamide không liên tục và mẫu protein được gây biến tính (discontinuous and denaturing). SDS là một tác nhân làm biết tính và âm tính hóa các phân tử protein. Trong kĩ thuật này protein được xử lý với chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là 2- mercaptoethanol hoặc dithiotheitol (DTT). Khi xử lý protein với 2- mercaptoethanol hay dithiotheitol thì các tác nhân này sẽ cắt đứt các cầu nối disulfite (S – S) của protein, vì vậy protein từ cấu trúc bậc 2, 3, 4 được biến đổi thành chuỗi polypeptide bậc một và nhờ sự có mặt của SDS tất cả các protein đều được tích điện âm. Nhờ đó, dưới tác động của điện trường sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thước, những phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thước nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thước nhất định. Dưới tác dụng của điện trường các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực dương. Để đưa các protein trong mẫu về cùng một vạch xuất phát đồng thời tạo ra sự phân tách tốt hơn, người ta thường sử dụng phương pháp điện di trên gel không liên tục (discontinuous gel). Trong phương pháp này gel gồm 2 lớp: Lớp gel gom (stacking gel): Thông thường lớp gel này có nồng độ gel thấp vào khoảng 4 – 5%, và nằm phía trên nơi tạo giếng bơm mẫu. Khi có tác động của điện trường các protein có trong mẫu sẽ bắt đầu di chuyển từ những giếng mẫu qua lớp gel này. Nhờ đó, các protein trong mẫu được dồn lại và tạo một lớp băng mỏng nằm ngay phía trên lớp gel phân tách, tạo điều kiện thuận lợi hơn trong việc phân tách protein. Lớp gel phân tách (separating gel) (lớp dưới): Lớp gel này có nồng độ gel cao hơn so với lớp gel gom, và nằm phía dưới. Có tác dụng chính trong việc tạo ra các băng protein có trọng lượng phân tử, kích thước khác nhau từ một hỗn hợp protein xuất phát ban đầu. Kĩ thuật SDS- PAGE có thể xác định được những phân tử protein có trọng lượng phân tử từ 10.000 – 200.000 Daltons. Những phân tử protein có trọng lượng lớn hơn 200.000 Daltons thường được xác định trên gel có nồng độ acrylamide ít hơn 2,5%.

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP HỒ CHÍ MINH

KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

MÔN HỌC: MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HOÁ LÝ

TRONG NGHIÊN CỨU THỰC PHẨM

ĐỀ TÀI:

THU NHẬN CÁC NHÓM PROTEIN TỪ RONG BÚN NƯỚC LỢ Enteromorpha sp

VÀ XÁC ĐỊNH CÁC TÍNH CHẤT

CHỨC NĂNG CỦA CHÚNG

GVHD: TS Phan Ngọc Hoà LỚP: Cao học 2015.1 HVTH:

TP Hồ Chí Minh, tháng 03 năm 2016

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH

DANH MỤC BẢNG

Chương 1.Tổng quan

1 Rong (Algae)

Rong (tảo) là nguồn sinh chất vô tận đối với con người qua chuỗi thực phẩm,

là thức ăn trực tiếp của nhiều vùng trên thế giới Hầu hết các loại rong có môi trường sống là nước và 70% bề mặt trái đất là lãnh địa của rong tảo nên đây có thể xem là nguồn tài nguyên vô tận Với sự phát triển của khoa học, kiến thức khoa học về rong ngày càng mở rộng Các ứng dụng của rong ngày một phổ biến hơn trong các lĩnh vực trồng trọt, chăn nuôi, y dược Các sản phẩm thu nhận từ rong như agar, alginate, β-carotene, các acid béo không bão hòa đều có giá trị kinh tế cao Rong cũng đã góp phần không nhỏ vào việc giải quyết nạn đói protein ở các nước chậm phát triển nhờ hàm lượng protein khá cao của chúng

Việc phân loại rong là khá khó khan, tuy nhiên theo quan điểm hiện đại, rong tảo thuộc phân giới thực vật bậc thấp bao gồm có các ngành như sau:

- Ngành Chrysophyta- Kim tảo

- Ngành Xanthophyta- Hoàng tảo

- Ngành Pyrrophyta- Giáp tảo

- Ngành Bacillariophyta- Khuê tảo

trường nước mặn thường có các giống Enteromorpha, Ulva, Ulothrix, Cladophora,

Valonia, Boergessenia, Caulerpa, Bryopsis, Codium Đặc điểm khác biệt chủ yếu

của rong lục là chúng có màu xanh lục và chất dự trữ là tinh bột

Theo Phạm Hoàng Hộ (1972),ngành Tảo lục được chia làm 3 lớp:

- Lớp Rong lục (Chlorophyceae)

- Lớp Rong tiếp hợp (Zygophyceae)

- Lớp Rong vòng (Charophyceae)

Enteromorpha là một giống rong thuộc lớp Rong lục Chlorophyceae và có vị

trí phân loại như sau:

- Lớp phụ Septophycidae

- Bộ Ulothricales

- Họ Ulvacea

Rong Enteromorphacó dạng hình ống, đặc, rỗng hoặc hình túi Nhìn từ bề mặt

tế bào, thành hình chữ nhật hay hình vuông, sắp xếp thành hàng dọc hay không có qui luật, tế bào có một nhân, một lạp hình bản mang một hoặc nhiều hạch lạp Sinh sản vô tính bằng động bào tử hoặcsinh sản hữu tính theo lối đồng giao hay dị giao

Loài thường gặp là Enteromorpha intestinalis.

2 Ứng dụng của rong trong ngành thực phẩm

2.1 Các ứng dụng truyền thống

Rong, đặc biệt các tảo lớn từ lâu đã là thực phẩm truyền thống của nhiều dân tộc châu Á như Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc Đã có khoảng 100 nhóm rong biển được nuôi trồng để cung cấp cho thị trường từ thập kỷ 1950 Khoảng 88% rong được sử dụng như rau cải, 11% dùng để sản xuất ra keo nhưagar, carrageenan, alginate, còn lại 1% dùng làm chất bổ sung

Các hydrocolloid (agar, alginate, carrageenan) của rong từ lâu lâu đã được chiết xuất thương mại để làm chất ổn định, chất tạo đặc cho thực phẩm Các hợp chất chống oxi hóa giúp rong được dùng để kéo dài thời gian bảo quản của thực phẩm.Carbohydrate chiết từ rong được dùng làm vật liệu để tạo ra các loại bao bì

có thể ăn được

2.2 Ứng dụng hiện đại và xu hướng

Các ứng dụng hiện đại ngày càng được mở rộng nhờ vào thành tựu của ngành công nghệ di truyền Ngoài ra, ngày nay người ta thường quan tâm tới nguồn cung cấp các thành phần có hoạt tính sinh học có trong rong để sử dụng trong thực phẩm chức năng, một xu hướng sử dụng thực phẩm hiện đại.Xu hướng hiện đại đang hướng tới các chất trao đổi thứ cấp có giá trị thương mại rất cao từ tảo vì chúng tạo hiệu quả cao

ở nồng độ rất thấp khi ứng dụng cho ngành thực phẩm

Rong là nguồn thực phẩm năng lượng thấp do ít chất béo, tuy nhiên chất béo trong rong lại có giá trị cao vì giàu các PUFA (các acid béo không bão hòa nhiều nối đôi), giá trị có thể cao hơn cả dầu cá, có thể có tác dụng chữa gan nhiễm mỡ nếu được

sử dụng thường xuyên Các loại rong như Enteromorpha sp., U pinnatifida, H

elongate, P Umblicalis, S thubergii đã được dưa vào nhiều loại thực phẩm như snack,

pasta, bánh nướng, bánh bao patty, xúc xích frankfurter ít béo, sản phẩm thịt, patty hamburger

Các loài rong lớn (macroalgae) thường sống trong điều kiện môi trường khác nghiệt Đấu tranh sinh tồn đã làm chúng có những con đường chuyển hóa đặc biệt nên chúng có nhiều các protein, đặc biệt là các peptide có 3-16 acid amin có chức năng sinh học như khả năng chống oxi hóa, chống tăng huyết áp, có tác dụng lên hệ miễn

dịch Lectin từ một số loài rong lục như Ulva pertusa, Bryopsis plumose, Codium

barbatum được đưa vào các sản phẩm hỗ trợ điều trị ung thư, tăng sức đề kháng,

kháng viêm, thậm chí kháng virus Phytochelatin là một oligopeptide giàu sulfur có thể giúp giải độc kim loại cho tế bào, peptide này thường ở dạng phức với kim loại và có thể thấy trong rong nâu, rong đỏ, đặc biệt là rong lục Trong rong có sự hiện diện của

rất nhiều acid amin đặc biệt ngoài 20 loại acid amin tự nhiên tham gia cấu tạo nên protein Rất nhiều trong số các acid amin này thể hiện hoạt tính sinh học và được ứng dụng vào thực phẩm chức năng như kainoid Kanoid có cấu trúc tương tự cysteine có trong rong nâu, dùng làm thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị các bệnh rối loạn thần kinh như Alzheimer, động kinh, Parkinson Còn rất nhiều các hợp chất có cấu tạo protein từ rong đang được nghiên cứu và đưa vào ứng dụng thực tế

3 Lý do chọn đề tài

Ngành nuôi tôm hiện nay đã phát triển rộng rãi ở vùng đồng bằng sông Cửu Long và nhiều tỉnh trên cả nước Điều này đã tạo nên các vùng nước mặn nhân tạo bên trong vùng châu thổ và từ đó làm gia tăng sinh khối của các quần thể rong nước lợ Do

sự giao thoa giữa hai vùng nước nên rong sống trong khu vực này có những đặc điểm khác biệt với các loại rong sống trong hai vùng nước riêng biệt Các loại rong nước lợ phần lớn di chuyển từ biển vào và thích nghi dần với độ mặn thấp hơn của vùng nước này

Rong bún Enteromorphaintetinalis là một trong số các loại rong nước lợ được

tìm thấy ở các đầm nuôi tôm quảng canh Các nghiên cứu hướng tới sử dụng nguồn nguyên liệu này là thực sự cần thiết bởi vì:

- Đây là nguồn nguyên liệu rẻ tiền dễ tìm và chưa được sử dụng đúng mức

- Rong bún có thành phần dinh dưỡng cao, đặc biệt là protein vì có chứa các acid amin thiết yếu, một đặc điểm mà protein thực vật không có được Điều này hứa hẹn việc tạo

ra nhiều sản phẩm mới, có giá trị cao từ nguồn protein phi động vật

- Các tính chất chức năng có được từ protein của rong bún như khả năng tạo bọt, tạo nhũ cho thực phẩm có thể được ứng dụng trong việc tạo ra nhiều loại phụ gia thực phẩm vừa có hiệu quả cao vừa an toàn cho người sử dụng với một giá thành phù hợp

so với các loại phụ gia nhập khẩu do tận dụng nguồn nguyên liệu dồi dào rẻ tiềnvà sẵn

có trong nước

- Những sản phẩm sẽ ra đời từ nghiên cứu việc sử dụng rong bún và protein rong bún sẽ giúp cải thiện đáng kể thu nhập của người nông dân vì tận dụng hiệu quả nguồn lợi có sẵn trong đầm nuôi tôm

- Các hiệu quả về mặt kinh tế sẽ kích thích người dân quan tâm nhiều hơn tới nguồn lợi

từ các loại rong này và mở rộng việc nuôi trồng, phát triển các loại rong lục vốn có tác động tích cực với môi trường Đây thực sự là một hoạt động hiệu quả trong việc ứng phó với biến đổi khí hậu đang ảnh hưởng sâu sắc tới một đất nước có đường bờ biển dài như Việt Nam

Protein hiện nay được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau và không chỉ đơn giản là làm thực phẩm như trước đây Nguồn protein từ rong bún hứa hẹn việc tạo ra nhiều sản phẩm có giá trị sinh học do có chứa các loại peptide có hoạt tính sinh học như các peptide có khả năng kiểm soát huyết áp, giảm cholesterol máu và có khả năng chống oxi hóa

4 Tính mới của đề tài

Đối tượng nghiên cứu là rong Bún nước lợ Enteromorpha intestinalis thu nhận

tại các tỉnh có diện tích nuôi tôm nước lợ của vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long Vùng sinh thái nước lợ do nuôi tôm này chỉ mới được hình thành khoảng hơn 15 năm nay tại một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long nên đối tượng nghiên cứu chưa được quan tâm nhiều Mặc dù đã có nghiên cứu thu nhận protein từ rong mền nước lợ

Chaetomorpha sp nhưngrong Bún nước lợ Enteromorpha intestinalis có đặc điểm

hình thái, cấu tạo tế bào, vị trí tầng nước sinh sống và mùa vụ rất khác rong mền nên kết quả thu nhận protein, đặc biệt là việc sử dụng protein này sẽ có những giá trị rất mới

- Đề tài nghiên cứu sẽ được thực hiện ở cả lĩnh vực nghiên cứu cơ bản lẫn nghiên cứu ứng dụng Tìm hiểu thành phần sinh hóa, thu nhận từng phân đoạn protein

và xác định các tính chất dinh dưỡng, tính chất chức năng của từng phân đoạn này sẽ giúp có được những thông tin cần thiết về một loại protein thu nhận từ nguồn nguyên

liệu rất mới là Enteromorpha intestinalis Kết hợp giữa việc sử dụng các kỹ thuật hiện

và những phương pháp thu nhận protein truyền thống, đề tài sẽ tiến hành nghiên cứu các giai đoạn cần thiết có sựđể có một qui trình hiệu quả cao, có thể đưa vào sử dụng thực tế Các kỹ thuật, phương pháp phân tích hiện đại sẽ được áp dụng triệt để có thể đánh giá tường tận các tính chất của chế phẩm protein thu được nhằm tìm ra các khả năng ứng dụng mới của protein thu được trong ngành thực phẩm

- Mục tiêu chính của đề tài là tìm kiếm giải pháp công nghệ mới cho việc chuyển hóa nguồn sinh khối rong nước lợ mọc tự nhiên gây ô nhiễm môi trường thành những sản phẩm có giá trị gia tăng để ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm

5 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định các giá trị dinh dưỡng và tính chất chức năng của các phân đoạn protein thu được từ nguồn nguyên liệu dồi dào ở vùng Đồng Bằng Sông Cử Long

Đưa ra được một qui trình thu nhận protein hoàn chỉnh, hiệu quả nhưng kinh tế, có thể ứng dụng vào thực tế sản xuất

Xác định được hết các tính chất và tính chất chức năng mà protein sản phẩm có đươc để từ đó đề xuất các ứng dụng được trong lĩnh vực thực phẩm

Chương 2.Các phương pháp phân tích sử dụng trong đề tài

1 Các phương pháp xác định thành phần sinh hoá của rong

1.1 Định lượng Nitơ tổng bằng phương pháp KJELDAHL

1.1.1 Định nghĩa

Tất cả các dạng nitơ có trong cơ thể hay trong các mô được gọi là nitơ tổng số Nitơ có trong các thành phần amino acid của protein là nitơ protein Nitơ không có trong thành phần protein như của các muối NH4+, các amino acid tự do, các peptide, urea và các dẫn xuất của urea, các alkaloid, các base purin và pyrimidine,… là nitơ phi protein

Nitơ tổng số = Nitơ protein + Nitơ phi protein

Đạm tổng số hay protein tổng số là nitơ tổng số nhân với hệ số chuyển đổi Hệ

số này phụ thuộc vào hàm lượng nito trong protein Thông thường nito chiếm 16% protein nên hệ số chuyển đổi thường sử dụng là 100/16 = 6.25

Đạm tổng số = Nitơ tổng số x Hệ số chuyển đổi

Bảng 2 – Hệ số chuyển đổi cụ thể cho các đối tượng mẫu khác nhau

Nguồn gốc động vật 6.25Hạt bông 5.30Đậu phộng 5.46Đậu nành 5.71Hạt hướng dương 5.3Cơm dừa 5.3Hạt mè 5.3Bắp 6.25Gạo 5.95Lúa mì 5.83

1.1.2 Nguyên tắc

a Vô cơ hóa mẫu:

Trước tiên mẫu được vô cơ hóa bằng H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao và có chất xúc tác Các phản ứng của quá trình vô cơ hóa xảy ra như sau:

2H2SO4 → 2H20 + 2SO2 + O2

Oxi tạo thành trong phản ứng lại oxi hóa các nguyên tố khác Các phân tử chứa nito dưới tác dụng của H2SO4 tạo thành NH3 Ví dụ các protein bị thủy phân thành amini acid, cacbon và hidro của acid amine tạo thành CO2 và H2O, còn nito được giải phóng dưới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 dư tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch.

+ m: số gam mẫu hay ml mẫu sau khi chuẩn độ lại

+ n: hệ số pha loãng mẫu khi vô cơ hóa mẫu để đưa vào chưng cất

1.1.3 Những yếu tố có thể ảnh hưởng đến kết quả phân tích

Nồng độ HCl 0,25N không đảm bảo chính xác

Lấy mẫu không đại diện

Cân mẫu không chính xác

Nguồn nước bị nhiễm N

1.1.4 Khả năng ứng dụng của phương pháp Kjeldahl

Phương pháp này có khả năng ứng dụng cho hầu hết các loại mẫu:

+ Mẫu thực phẩm: thuỷ hải sản, nước mắm, các loại đậu, thức ăn nuôi tôm cá, rau quả…

+ Đất, nước thải…

+ Bã men bia, bánh dầu đậu nành, bánh dầu cao su…

1.1.5 Nguyên tắc hoạt động của máy Kjeldahl

Mẫu được đưa vào bồn đốt (hệ thống vô cơ hoá mẫu) thông qua các ống Kjeldahl

Sau khi vô cơ hoá mẫu xong, toàn bộ mẫu + ống Kjeldahl được đưa qua hệ thống chưng cất NH3 và toàn bộ sản phẩm được đưa qua thiết bị chuẩn độ

1.2 Định lương protein bằng phương pháp BRADFORD

1.2.1 Định nghĩa

Protein được định lượng bằng phương pháp Bradford là protein tan trong dung dịch Vì vậy, muốn xác định hàm lượng protein một mẫu ta phải trích ly protein Hàm lượng protein xác định sẽ phụ thuộc vào hiệu quả trích ly (khả năng hòa tan của protein trong dung môi trích ly)

1.2.2 Nguyên tắc

Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein Trong dung dịch mang tính acid, khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm có bước sóng hấp thu cực đại

465 nm; khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu cực đại ở bước sóng 595 nm

Độ hấp thụ ở bước sóng 595 nm có liên hệ một cách trực tiếp tới nồng độ protein

Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với dung dịch protein chuẩn đã biết trước nồng độ Dung dịch protein chuẩn thường là bovine serum albumin (BSA) Sau khi cho dung dịch protein vào dung dịch thuốc nhuộm, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1 giờ Tiến hành đo dung dịch bằng máy quang phổ kế ta được OD

x, độ hấp thụ sẽ tỷ lệ với lượng trong mẫu Thực hiện một đối chứng với nước cất (OD

0) Lấy giá trị OD = ODx - OD0 Lượng protein mẫu trong dung dịch đo được xác định bằng cách chấm trên đường chuẩn theo OD, lấy giá trị của điểm đó trên trục hoành Đó chính là lượng protein mẫu trong dung dịch

Công thức phân tử của Coomasie Brilliant Blue G-250:

Hình 2 – Công thức phân tử của Coomasie Brilliant Blue

1.2.3 Tính kết quả

Vẽ đường tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với mật độ quang OD

595.Dựa vào phương trình đường tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với mật

m = khối lượng mẫu, g

1.3 Xác định nồng độ protein hoà tan theo LOWRY

1.3.1 Nguyên tắc

Phương pháp này dựa trên cơ sở phức chất đồng protein khử hỗn hợp photphomolipden – photphovonphramat (thuốc thử Folin – ciocalteu) tạo phức chất mầu xanh da trời có độ hấp thụ cực đại ở bước song 660nm

Cường độ mầu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong một phạm vi nhất định Dựa vào mức độ hấp thụ quang học của protein chuẩn, ta có thể xác định được hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu

- Thuốc thử folin, trước khi dùng pha loãng hai lần sao cho độ axit bằng 1N

- Albumin huyết thanh bò 1mg/ml

1.3.3 Cách tiến hành

- Mẫu thí nghiệm: lấy chính xác 0,5ml dịch chứa protein với hàm lượng thích hợp cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2ml dung dịch C, lắc đều để yên trong 10 phút Sau đó thêm vào hỗn hợp trong ống nghiệm 0,25ml folin đã pha loãng 2 lần, lắc đều

và để yên trong 30 phút, mầu vàng của hỗn hợp chuyển sang mầu xanh da trời và đạt đến cường độ mầu cực đại Đem so mầu của hỗn hợp trên máy so mầu quang điện ở bước sóng 660nm Xác định được trị số mật độ quang học của dung dịch nghiên cứu

Đo trên máy 3 lần lặp lại và lấy trị số trung bình

- Mẫu đối chứng: 0,5ml đệm cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2ml dung dịch

C và bước tiếp theo được tiến hành như mẫu thí nghiệm

1.3.4 Xây dựng đường đồ thị chuẩn

- Hàm lượng protein tan trong dung dịch được xác định theo phương pháp Lowry, dùng albumin huyết thanh bò (BSA) làm chất chuẩn

- Cân 0,01g (10mg – albumin huyết thanh bò) hoà tan trong 10ml nước, ta được dung dịch gốc có nồng độ là 1mg/ml Sau đó pha loãng dung dịch gốc bằng nước cất với các nồng độ 20, 40, 60, 80, 100, 120 µ

g/ml để tiến hành xây dựng đồ thị chuẩn

- Mẫu thí nghiệm: lấy chính xác 0,5ml dung dịch BSA ở nồng độ pha loãng như trên cho vào ống nghiệm, thêm vào mỗi ống 2ml dung dịch C để ở nhiệt độ phòng 10 phút, sau đó cho 0,25ml thuốc thử folin (1N) đem so mầu với bước sóng 660nm

- Mẫu đối chứng: lấy 0,5 ml nước cất cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2ml dung dịch C và các bước tiếp theo được tiến hành như mẫu thí nghiệm

- Qua 3 lần lặp lại thí nghiệm có thể xây dựng đường hồi quy Kết quả được xử

lý theo phương pháp thống kê thông thường

- Ta có phương pháp hồi quy

Hình 2 – Đồ thị xác định nồng độ protein theo phương pháp Lowry

Dựa vào đồ thị chuẩn, có thể xác định được hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu

1.4 Định lượng đường khử bằng phương pháp ACID DINITRO -

SALICYLIC (DNS)

1.4.1 Định nghĩa

Đường khử là các đường chứa nhóm aldehyde (-CHO) hoặc ketone (-CO) như glucose, fructose, arabinose, maltose, lactose; trong khi đó saccharose, trehalose không phải đường khử

1.4.2 Nguyên tắc

Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử acid dinitrosalicylic (DNS) Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định So màu tiến hành ở bước sóng 540nm Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu

Hình 2 – Phương trình phản ứng tạo màu giữa đường khử và DNS

1.4.3 Xử lý mẫu

Tùy vào đối tượng nghiên cứu (hạt, quả, ) mà cách chuẩn bị dung dịch nghiên cứu dùng để định lượng đường có khác nhau đôi chút, nhưng nguyên tắc chung như sau:

+ Trường hợp nguyên liệu thí nghiệm không chứa quá nhiều tinh bột hoặc inulin, có thể chiết đường từ nguyên liệu bằng nước Cân và cho vào cối sứ 1 g nguyên liệu hạt hay các mẫu thí nghiệm thực vật khô như cây, lá hoặc quả khô, đã được nghiền nhỏ (và sấy khô đến khối lượng không đổi) Nếu là nguyên liệu tươi (như hoa, quả tươi) thì cân 5 – 10 g Nghiền cẩn thận với bột thủy tinh hay cát sạch và

30 ml nước cất nóng 70 – 80oC Chuyển toàn bộ hỗn hợp vào bình định mức dung tích

1000 ml Đun cách thủy 70 – 80oC trong 35 – 40 phút, kết tủa protein và các tạp chất bằng dung dịch chì acetate [Pb(C

2H2O2)2.3H2O] hoặc chì nitrate [Pb(NO3)2] 10% Tránh dùng quá dư chì acetate (dùng 2 – 5 ml chì acetate) Sau đó loại bỏ lượng chì acetate dư bằng dung dịch Na

2SO4 bão hòa, để yên hỗn hợp 10 phút Tiếp đó thêm nước cất tới vạch mức và đem lọc qua giấy lọc vào cốc hay bình khô Nước lọc dùng làm dung dịch thí nghiệm

+ Trường hợp nguyên liệu chứa quá nhiều tinh bột hoặc inulin như khoai lang, sắn, khoai tây, cần chiết đường bằng rượu 70 – 80oC, đun hỗn hợp cách thủy trong bình cách thủy có lắp ống làm lạnh không khí Trong trường hợp này không cần kết tủa protein bằng chì acetate vì lượng protein chuyển vào dung dịch không nhiều

+ Trường hợp các nguyên liệu chứa nhiều acid hữu cơ như cà chua, dứa, chanh, khế, cần chú ý là trong quá tình đun khi chiết, đường saccharose có thể bị thủy phân một phần Do đó cần xác định riêng đường khử và riêng saccharose Trước khi đun cách thủy hỗn hợp phải trung hòa acid bằng dung dịch Na

2CO3 bão hòa tới pH 6,4 – 7,0

Tính hàm lượng đường trong nguyên liệu (mg/g) =

V = thể tích dịch đường gốc (ml)

m = khối lượng mẫu cân (g)

1.5 Xác định hàm lượng chất béo tự do theo phương pháp Soxhllet

1.5.1 Nguyên tắc

Dùng dung môi nóng để hòa tan tất cả chất béo tự do có trong thực phẩm Sau khi đuổi hết dung môi, cân chất béo còn lại và tính ra hàm lượng lipid có trong 100g thực phẩm

1.5.2 Tiến hành

Cân chính xác 5g mẫu để nghiền nhỏ và đồng đều, sấy đến khối lượng không đổi Cho mẫu vào túi bằng giấy lọc (đã sấy đến khối lượng không đổi và cân), dùng một miếng bông hút ẩm có thấm ete để lau sạch cốc rồi cho cả miếng bông vào túi cùng với mẫu Sau đó, cho túi mẫu vào ống chiết Soxhlet

Cho ete vào 2/3 bình cầu Cho nước lạnh chảy qua ống sinh hàn

Đun sôi cách thủy đến khi chất béo được chiết hết Thời gian khoảng 8 ÷ 12 giờ (trong một giờ dung môi tràn từ ống chiết về bình chứa không ít hơn 5 ÷ 6 lần và không nhiều hơn 8 ÷ 10 lần) Thử xem đã hết dung môi chưa bằng cách lấy vài giọt dung môi trong ống nhỏ lên trên mặt kính đồng hồ, để bay hơi nếu trên bề mặt mặt kính đồng hồ không có vết loang coi như đã chiết xong

Khi ete chảy hết xuống bình, nhấc ống giấy ra khỏi ống chiết và cất lấy bớt ete lên ống chiết của máy cất

1.5.3 Tính kết quả

(P – P0) * 100Lượng lipid trong 100g thực phẩm (%) =

mPhương pháp trực tiếp: Rút bình ra để bay hơi hết ete ở nhiệt độ thường rồi cho vào tủ sấy 100oC ÷ 105oC trong 1 giờ 30 phút để đuổi hết ete Để nguội trong bình hút ẩm 30 phút và cân

Phương pháp gián tiếp: Lấy túi mẫu ra khỏi bình chiết, cho bay hơi hết dung môi, sấy khô đến trọng lượng không đổi và cân

(G – G0) * 100

Lượng lipid trong 100g thực phẩm (%) =

Chuẩn bị dịch thử: Cân 1 lượng mẫu cần phân tích (tính toán sao cho phần lọc

để chuẩn độ sẽ có nồng độ đường biểu thị bằng glucoza vào khoảng 4-10%) cho vào bình định mức 500ml, tráng lại dụng cụ đã đựng mẫu vài lần với nước cất và cho vào bình (không quá 250ml)

Trung hòa acid hữu cơ có trong mẫu bằng dung dịch NaOH 10% đến pH = 7:+ Nếu định lượng các loại đường hòa tan (glucose hoặc các loại đường hòa tan khác) thì chiết xuất đường bằng nước cất như sau: đun cách thủy ở 80oC trong 15 phút, thỉnh thoảng lắc đều trong khi đun Để nguội đến nhiệt độ phòng, khử tạp chất chất bằng dung dịch chì acetate 30% Để yên 5 phút đến khi thấy xuất hiện 1 lớp chất lỏng trong suốt bên trên lớp cặn Khử lượng Pb(CH

3COO)2 dư bằng dung dịch Na

2SO4 Cuối cùng cho thêm nước cất vừa đủ 500ml Lọc lấy phần dịch trong để xác định hàm lượng đường

+ Nếu là đường saccharose: tiến hành thủy phân bằng cách lấy 50ml dịch lọc trên cho vào bình định mức dung tích 100ml, với 5ml HCl

đđ Đun bình trong nồi cách thủy, sau 2 phút dung dịch thủy phân trong bình phải đạt 68oC, giữ dung dịch ở nhiệt độ 68oC -70oC Làm nguội nhanh dưới vòi nước chảy Trung hoà dung dịch bằng NaOH 20% rồi NaOH 1% với chỉ thị màu là phenolphtalein Thêm nước cất vừa đủ 100ml và dùng dung dịch này để chuẩn độ

+ Nếu chất thử là tinh bột hoặc dextrin không hòa tan trong nước thì phải tiến hành thủy phân trước và khử tạp chất sau Sau khi trung hòa, tất cả khoảng 250ml, cho thêm 25ml HCl

đđ, chuyển tất cả vào bình cầu có lắp ống sinh hàn hồi lưu và đặt trực tiếp trên ngọn lửa đun sôi trong 3 giờ Làm lạnh nhanh dưới vòi nước chảy Chuyển sang bình định mức, với nước tráng bình cầu, khử tạp chất, cuối cùng thêm nước cất vừa đủ 500ml Lọc lấy phần dịch trong để xác định hàm lượng đường

Chú ý: sau khi đun sôi, dung dịch vẫn phải có màu xanh biếc đặc trưng Nếu dung dịch có màu lục, vàng hoặc nâu, nghĩa là không đủ lượng đồng cần thiết, phải làm lại với lượng dung dịch thí nghiệm ít hơn hoặc lượng thuốc thử Felinh nhiều hơn.

Lấy bình ra, để nghiêng cho cặn Cu

2O lắng xuống, gạn lấy phần nước bên trên

và lọc vào bình lọc chân không Buchner Rửa bình và phễu lọc bằng nước nóng 3 - 4 lần

Chú ý: tránh không để cho kết tủa rơi vào phẫu và luôn luôn giữ một lớp nước nóng trên mặt kết tủa trong bình nón và trong phễu.

Lần gạn lọc cuối cùng, gạn hết nước và cho vào bình nón 20ml dung dịch Fe

2(SO4)3 trong acid H2SO4 (gồm: 50g Fe2(SO4)3 + 20gH2SO4 đđ + nước cất đủ 1 lít) để hòa tan kết tủa Cu

2O Rút hết nước trên phễu, ngừng cho chảy tia nước ở ống hút chân không Thay bình hút lọc cũ bằng bình mới Đổ dung dịch Fe

2(SO4)3 đã hòa tan kết tủa Cu

2O lên trên lớp cặn còn lại trên phễu Tráng bình nón và rửa phễu bằng dung dịch Fe

2(SO4)3 cho đến khi không còn vết Cu2O trong bình nón và trong phễu Hút xuống bình lọc và tráng rửa lại bằng nước nóng, hút cả xuống bình lọc

b Tiến hành:

Nung chén sứ đã rửa sạch trong lò nung ở 6000C đến trọng lượng không đổi

Để nguội chén nung trong bình hút ẩm và cân trên cân phân tích (chính xác đến 0,001g)

Cân chính xác 1-3g mẫu cho vào chén nung (cho vào lo nung tăng nhiệt độ

từ từ cho đến 600ºC, giữ nhiệt độ này từ 3-6 giờ đến khi tro trắng Nếu lấy ra thấy cho còn đen, làm nguội cho thêm vài giọt HNO

3 nung đến trắng).

Lấy ra để nguội trong bình hút ẩm, cần tiếp tục nung khoảng 30 phút, lấy ra

để nguội và cân đến khối lượng không đổi

m0: khối lượng của chén nung (g)

m1: khối lượng của mẫu và chén trước khi nung (g)

m2: khối lượng của chén và tro sau khi nung (g)

Chú ý:

Khi xác định tro đối với các sản phẩm dễ bốc cháy (đường, mỡ…) phải đun nhẹ trên bếp điện trước khi cho đến khi thành than đen không bốc cháy nữa nới cho vào lò nung

Nếu là sản phẩm lỏng phải cô đặc đến khô mới cho vào lò nung

Khi chén nung còn nóng cho vào bình hút ẩm, phải hé nắp bình, để chén nung nguội bớt mới đóng kín nắp bình.

1.7.2 Hàm lượng tạp chất

Những chất bẩn, đất, cát lẫn vào trong thực phẩm là những chất có thành phần tro toàn phần của thực phẩm nhưng không tan trong HCl gọi là tạp chất hay tro không tan trong HCl

Đun cách thủy chén tro trong 30 phút

Lọc qua giấy lọc không tàn, rửa sạch cặn trên giấy lọc bằng nước cất đun sôi cho đến khi nước lọc không còn Cl- (kiểm tra bằng AgNO

m 0 : Khối lượng của chén nung

m 1 : Khối lượng của chén + mẫu trước khi nung (g)

m 2 : Khối lượng của chén + tạp chất sau khi nung (g)

2 Phương pháp điện di

2.1 Khái niệm

Điện di là sự di chuyển của các cấu tử mang điện trong dung dịch về các điện cực trái dấu dưới tác dụng của điện trường, Cation di chuyển về phía cực âm (cathode), anion di chuyển về phía cực dương (anode) Các phần tử không tích điện không bị hút

về phía hai điện cực

Quá trình tách bằng điện di có thể thực hiện theo nhiều phương pháp khác nhau:

- Điện di vùng (Zone electrophoresis – ZE)

- Điện di đẳng tốc (Isotachophoresis – ITP)

- Điện di đẳng điện (Isoelectric focusing – IEF)

- Điện di mao quản (Capillary electrophoresis – CE)

- Điện di trên gel

Hoặc: Điện di là một phương pháp được sử dụng chủ yếu trong nghiên cứu sinh

học phân tử Nó cho phép phân tách trọng lượng của các phân tử sinh học, từ đó ta có thể xác định được trọng lượng phân tử của chúng

Vào khoảng thập niên 1930 phương pháp điện di trên gel đầu tiên được biết đến Raymond và Winstraub (1959) lần đầu tiên giới thiệu về gel polyacrylamide Ornstein

và Davis (1964) thực hiện điện di trên gel polyacrylamide không liên tục Beber và Osborn (1969) đã giới thiệu về tác nhân gây biến tính protein và sodium dodecyl sulfate Laemmli (1970) phát triển phương pháp SDS– PAGE trong phân tách 28 thành phần của T4– phage

2.2 Các phương pháp điện di

2.2.1 Điện di mao quản (Capillary electrophoresis – CE)

Trong phương pháp điện di mao quản (CE) việc sử dụng mao quản để làm kênh di chuyển cho phép thực hiện quá trình tách điện di trên một thiết bị có thể so sánh với thiết bị của sắc ký lỏng hiệu năng cao Tuy nhiên, vẫn còn những khác biệt rõ rệt về cách vận hành, những điểm thuận lợi và không thuận lợi so với sắc ký lỏng hiệu năng cao Quá trình vận hành của CE điển hình với mao quản mà mặt trong thành mao quản không có lớp bao và mao quản chứa dung dịch ″đệm làm việc″, thì nhóm silanol hiện diện trên thành phía trong của mao quản thủy tinh sẽ giải phóng ion hydrogen vào dung dịch đệm và bề mặt thành mao quản sẽ tích điện âm ngay cả ở pH rất thấp Cation hay các chất hòa tan tích điện dương một phần trong môi trường bị hút tĩnh điện vào thành mao quản tích điện âm tạo nên một lớp điện tích kép

Quá trình điện di bắt đầu bằng cách đặt thế trên chiều dài cột mao quản làm cho phần dung dịch của lớp điện tích kép di chuyển về phía đầu catode của mao quản kéo theo khối dung dịch Sự chuyển động của khối dung dịch dưới tác dụng của lực điện trường được gọi là dòng điện thẩm (Electroosmotic flow - EOF) Mức độ ion hóa của nhóm silanol trên thành mao quản phụ thuộc chủ yếu vào pH của dung dịch đệm làm việc và các chất điều chỉnh được thêm vào chất điện giải Ở pH thấp, nhóm silanol nói chung có độ ion hóa thấp và dòng EOF nhỏ Ở pH cao hơn, nhóm silanol bị ion hóa nhiều hơn và dòng EOF tăng Trong một số trường hợp, các dung môi hữu cơ như methanol hay acetonitril được cho thêm vào dung dịch đệm để làm tăng độ tan của các chất hòa tan và các chất phụ gia hay để ảnh hưởng đến mức độ ion hóa của mẫu Nói chung, việc thêm các chất điều chỉnh hữu cơ sẽ làm giảm dòng EOF Detector được đặt

về phía đầu catode của mao quản Dòng EOF thường lớn hơn lynh độ điện di Do vậy, ngay cả anion cũng bị đẩy về phía catode và detector

Khi sử dụng đệm phosphat pH = 7,0 ở mao quản không có lớp bao, thông thường trình tự xuất hiện các chất tan trong điện di đồ là các cation, các chất trung tính và các anion

Phương pháp điện di mao quản phổ biến biện nay là phương pháp điện di mao quản

vùng (capillary zone electrophoresis - CZE) Điện di mao quản vùng (capillary zone

electrophoresis - CZE) còn gọi là điện di dung dịch tự do hay điện di mao quản dòng

tự do

a Nguyên lý của điện di mao quản vùng:

Quá trình tách được kiểm soát bằng sự khác nhau về lynh độ tương đối của từng thành phần trong mẫu thử hoặc dung dịch thử Lynh độ là hàm số của điện tích chất phân tích và kích thước trong điều kiện nhất định của phương pháp Chúng được tối

ưu hóa bằng cách kiểm soát các thành phần của đệm, pH và lực ion

Điện di mao quản vùng sử dụng nguyên lý của điện di và điện thẩm để tách các tiểu phân tích điện Lynh độ điện di của ion (µEP), được biễu diễn bằng phương trình:

µEP=q /(6πηr)

Trong đó: q là điện tích của ion, η là độ nhớt dung dịch và r là bán kính của ion hydrat hóa Từ mối lyên hệ này suy ra, chất phân tích kích thước nhỏ, điện tích lớn có lynh độ lớn Chất phân tích kích thước lớn, điện tích nhỏ có lynh độ thấp

Tốc độ di chuyển (νEP), tính bằng cm/s, được biểu thị bằng phương trình:

N =(µEP+µEO)V / 2D 3

Trong đó: D là hệ số khuếch tán của chất hòa tan và các ký hiệu khác được định nghĩa như trên Độ phân giải (R) của hai chất hòa tan được rửa giải kế tiếp nhau, có thể xác định bằng phương trình:

R = 0,18(µEP1−µEP2).[V / D(µEP+µEO)]1/2

Trong đó µEP1 và µEP2 là lynh độ của hai chất hòa tan, là lynh độ trung bình của hai chất tan và các ký hiệu khác được định nghĩa như trên.

b Thiết bị điện di mao quản:

Hình 2 - Thiết bị điện di CE điển hình

Hệ thống CE điển hình (hình 1) bao gồm một mao quản bằng silyca nung chảy có đường kính trong từ 50 - 100 µm và chiều dài từ 20 - 100 cm Các đầu mao quản được nhúng vào các bình điện giải riêng biệt Nguồn cung cấp điện một chiều c ó khả năng tạo điện áp cao từ 0 - 30 kV Thêm vào đó một detector, bộ phận tiêm mẫu tự động và thiết bị ghi dữ lyệu là đủ một hệ thiết bị CE Hệ thống cung cấp dung dịch đệm tự động và hệ thống kiểm soát bằng máy vi tính, ghi nhận dữ lyệu hay kiểm soát nhiệt độ cho cả mao quản và bộ phận tiêm mẫu tự động có thể thấy ở các thiết bị có mặt trên thị trường Những điều cần quan tâm đầu tiên đối với thiết bị là kiểu mao quản, cấu hình, cách tiêm mẫu, nguồn cung cấp điện và kiểu detector

c Các loại mao quản và cấu hình thiết bị:

Mao quản dùng trong CZE thường được làm bằng silyca nung chảy và không có lớp bao mặt trong mao quản Một vài thiết bị có cấu hình với cột mao quản để tự do, nghĩa

là mao quản không đưa vào bên trong hộp chứa Trong hầu hết các thiết bị trên thị trường, mao quản được đặt vào trong một hộp chứa Cả hai cấu hình đều có những ưu

và nhược điểm riêng Điều quan trọng là khả năng của thiết bị có thể tương thích được các loại mao quản khác nhau với chiều dài và đường kính mao quản khác nhau Mao quản với chất bao mặt trong khác nhau hiện nay cũng có mặt trên thị trường Bởi vậy, khả năng tương thích với các loại cột khác nhau rất quan trọng Các chất bao mặt trong mao quản có thể được sử dụng để thay đổi cường độ hay hướng của dòng EOF hay làm giảm sự hấp phụ của mẫu Nếu sử dụng mao quản có chất bao mặt trong, phải có ghi các chi tiết về chất bao và nhà cung cấp trong phương pháp Mao quản từ nhà cung cấp khác cũng có thể được sử dụng nếu chúng thích hợp

d Kỹ thuật đưa mẫu và tiêm mẫu:

Cách đưa mẫu vào trong mao quản bao gồm tiêm kiểu di chuyển điện (kiểu điện động), và tiêm áp suất âm và tiêm áp suất dương (kiểu thủy tĩnh) Để tiêm kiểu di chuyển điện, dung dịch mẫu được đưa vào mao quản bằng cách nhúng mao quản và điện cực vào trong lọ mẫu và đặt lên đó một điện thế cao trong thời gian ngắn Mẫu đi vào mao quản bằng sự phối hợp của điện di và dòng EOF Bởi vậy, các chất phân tích

có lynh độ khác nhau đi vào trong mao quản ở mức độ khác nhau Độ dẫn của mẫu thử

và chất chuẩn cũng ảnh hưởng đến dòng EOF và thể tích tiêm Tiêm áp suất âm là đặt

áp suất âm ở đầu mao quản có detector và hút dung dịch mẫu vào đầu tiêm của mao quản Tiêm áp suất dương là tạo áp suất lên lọ chứa mẫu, đẩy mẫu vào trong mao quản Tiêm áp suất có thể đưa tất cả các thành phần của mẫu vào trong mao quản ở cùng một mức độ, nói chung là cho độ tái lặp tốt nhất và là cách tiêm thường được áp dụng nhất Thể tích mẫu phụ thuộc vào chiều dài và đường kính trong của mao quản

và điện thế hay áp suất áp đặt Thể tích mẫu đặc trưng được tiêm vào trong mao quản khoảng từ 1 - 20 nL Mỗi một phương pháp tiêm mẫu có những ưu và nhược điểm riêng , tùy thuộc vào thành phần của mẫu, kiểu tách và áp dụng phương pháp Không

có kiểu tiêm mẫu nào nói trên có độ tái lặp như bộ tiêm mẫu của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao hiện đang có mặt trên thị trường Tùy theo hoàn cảnh cụ thể, cần thiết phải sử dụng chất chuẩn nội cho các phương pháp cụ thể khi cần sự tiêm mẫu chính xác

e Cung cấp nguồn điện:

Hầu hết các thiết bị CE có mặt trên thị trường có nguồn điện một chiều, nó có khả năng tạo nguồn điện thay đổi từ từ hay từng nấc đảm bảo duy trì được điện thế mong muốn một cách ổn định Điều này sẽ đảm bảo có được đường nền tương đối phẳng Một đặc điểm thiết yếu khác của nguồn điện là khả năng sử dụng nguồn này để đưa mẫu vào đầu cathod hay anod của mao quản Bởi vì trên thực tế không thể thay đổi vị trí 6 detector từ đầu này đến đầu kia của thiết bị, mà chỉ có thể ấn định đầu tiêm mẫu ở phía cathod hay anode

f Các kiểu detector:

Nói chung hệ thống CE thường ghép với các detector UV-VIS và detector huỳnh quang cảm ứng laser Detector quét phổ UV hay detector dãy diod có thể thấy ở nhiều thiết bị CE hiện có mặt trên thị trường Sự ghép nối CE với phổ khối cho phép thu được thông tin về cấu trúc kết hợp các dữ lyệu điện di Phát hiện bằng detector huỳnh quang sẽ làm tăng độ nhạy phát hiện đối với mẫu chứa một lượng rất nhỏ chất cần phân tích có khả năng hấp thụ UV Việc ghép một nhóm huỳnh quang với những chất không hấp thụ UV có thể là có ích Các chất không hấp thụ UV hoặc không phát quang

có thể được phát hiện bằng cách thêm trực tiếp vào dung dịch đệm các chất mang màu hay chất có huỳnh quang: Các chất không hấp thụ được phát hiện nhờ sự mất tín hiệu

so với chất nền hấp thụ hay huỳnh quang Detector đo độ dẫn và đo amper có thể được

sử dụng, nhưng nói chung chúng không thông dụng ở các thiết bị có mặt trên thị trường

g Những điểm cần chú ý khi phân tích mẫu:

Một vài thông số như kích thước mao quản, điện thế, lực ion và pH được tối ưu hóa

để đạt độ phân giải và sự tách phù hợp Cần tránh sự thay đổi nhiệt độ vì sẽ ảnh hưởng đến độ nhớt của dung dịch đệm và ảnh hưởng cả đến dòng EOF và lynh độ của chất tan

h Kích thước mao quản:

Những thay đổi về đường kính và chiều dài mao quản có thể ảnh hưởng đến độ phân giải điện di Chiều dài mao quản tăng sẽ kéo dài thời gian di chuyển, thông thường sẽ tăng độ phân giải và làm giảm dòng điện Đường kính mao quản tăng thường làm tăng dòng điện và tạo ra gradient nhiệt độ bên trong cột, dẫn đến làm giảm

độ phân giải Ngược lại, giảm đường kính trong của mao quản sẽ làm giảm sinh nhiệt

và cho độ phân giải tốt hơn Tuy nhiên, ở mao quản có đường kính lớn hơn sẽ có thuận lợi là tiêm được lượng mẫu nhiều hơn và cải thiện được tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu

i Ảnh hưởng điện thế:

Khi đặt một điện thế cao hơn, xảy ra sự tăng sinh nhiệt của dung dịch đệm làm việc bên trong mao quản vì do có dòng điện đi qua dung dịch đệm Hiệu ứng nhiệt này còn gọi là nhiệt Jun cần phải được kiểm soát vì trở kháng, hằng số điện môi và độ nhớt phụ thuộc vào nhiệt độ và làm thay đổi tốc độ dòng EOF và lynh độ của chất tan Nói chung, sự tăng điện thế sẽ làm tăng hiệu lực tách và độ phân giải đến điểm mà nhiệt Jun không phát tán được Độ phân giải tối đa có thể đạt được bằng cá ch duy trì điện thế ở dưới mức xảy ra sự phát nhiệt Jun và sự khuếch tán trở thành yếu tố giới hạn

2.2.2 Điện di trên gel

Phương pháp điện di trong gel (keo) thường được sử dụng để phân ly (phân đoạn) ADN, ARN, olygonucleotide, protein sau đó có thể dùng để giám biệt (đồng định) và tinh chế các chất đó Việc phân ly các chất dựa trên độ lớn cũng như hình thái của các chất Thông thường sử dụng gel agarose và gel polyacrylamide nhưng gel agarose cho phép phân ly nucleic acid lớn hơn 1 kb, còn gel polyacrylamide thường dùng để phân

ly các đoạn acid nucleic nhỏ hơn 1 kb Nguyên lý của việc điện di ADN là khi ở trong điện trường, do tích điện âm nên các phân tử ADN dịch chuyển về phía anode và với tốc độ dịch chuyển của chúng khác nhau phụ thuộc vào khối lượng phân tử Các đoạn ADN càng lớn thì dịch chuyển càng chậm Kết quả là từ một điểm chung (lỗ hay

"giếng" tải mẫu) các đoạn ADN khác nhau dịch chuyển về một hướng tạo thành một làn (lane), và trên làn đó có các đoạn ADN khác nhau phân bố ở các vị trí (các băng - band) khác nhau tương ứng với độ lớn của chúng Trong khi đó, các phân tử protein do tích điện bề mặt khác nhau nếu điện di trong gel không gây biến tính thì dịch chuyển theo các hướng khác nhau với tốc độ khác nhau phụ thuộc cả khối lượng phân tử lẫn điện tích bề mặt, nhưng nếu điện di trong gel sau khi xử lý bằng SDS thì do bề mặt protein trở nên tích điện âm đồng nhất nên chúng dịch chuyển về anode với tốc độ khác nhau hầu như chỉ phụ thuộc khối lượng phân tử

a Điện di agarose:

 Chế tác gel agarose

Dưới đây giới thiệu phương pháp chế gel agarose điện di ADN

- Cho đủ lượng agarose (Seakem Agarose, Nusieve Agarose ) cần pha vào dung dịch TAE 1× trong một bình tam giác theo bảng dưới đây để có độ phân ly acid nucleic thích hợp Để có dung dịch TAE 1× cần cho thêm 19 lần nước khử ion vào dung dịch gốc TAE 20×

- Gia nhiệt bằng cách hấp 5 phút trong nồi hấp cao áp ở 115 °C hoặc bằng vi sóng Chú ý khi dùng lò vi sóng cần quan sát để tránh trào gel ra ngoài, nên chờ đến khi gel sôi thì cắt điện, lấy ra (coi chừng bỏng) lắc đều rồi cho vào làm sôi lần nữa Lặp lại ba lần cho agarose tan hoàn toàn

- Cho vào chậu bảo ôn ~50 °C cho đến khi dịch gel đạt đến khoảng 50 - 60 °C (tay chạm vào được) thì cho vào gel một lượng dung dịch ethidium bromide để có hàm lượng cuối cùng của chất màu này là 50 μg/ml (Nếu không cho ethidium bromide vào gel lỏng trước khi rót gel vào khuôn thì ngâm bản gel vào dung dịch này sau khi đã điện di)

Chú ý: Ethidium bromide là chất độc gây ung thư, vì vậy cần tránh tiếp xúc trực tiếp

vào cơ thể và phải có nơi đựng chất thải riêng sau khi sử dụng, không được thải ra ngoài môi trường khi chưa được xử lý thích hợp

- Rót gel vào khuôn đã được chắn hai đầu bằng băng dán hoặc bằng kẹp,

đã cài sẵn lược (comb) và đặt trên mặt phẳng (xác định bằng thủy bình kế, tức lygô)

- Chờ cho đến khi gel rắn hoàn toàn thì cẩn thận tháo lược ra khỏi gel

Bản gel agarose đã được bổ sung ethidium bromide, sau khi điện di có thể quan sát được các băng ADN nếu đặt chậu trên nguồn UV (chất lyệu chế đáy bể thấu qua đối với UV)

 Điện di agarose

Tháo bản gel ra khỏi kẹp hoặc băng chắn, đặt khuôn gel trong chậu điện

di ngang, rót dung dịch đệm vào cho ngập gel, chú ý đầu có lỗ lược nằm ởphía cathode

Pha acid nucleic cần điện di với dung dịch màu tải mẫu (điện di) 6× hoặc bằng hợp

chất màu tương tự Dịch màu có tỷ trọng cao này giúp acid nucleic không bị xáo động bởi dòng đối lưu của dung dịch nên khi tải vào lỗ răng lược thì nằm gọn trong đó và có màu rõ ràng Dung dịch màu tải mẫu 6× (dịch nạp mẫu) chứa 30% glycerol, 0,25% bromophenol blue (BPB) và 0,25% xylencyanol (XC)

Dùng micropipet hút mẫu ADN nhỏ vào lỗ răng lược

Bật điện một chiều để thực hiện điện di Cường độ dòng điện khoảng 50

- 150 V tùy loại thiết bị điện di Thời gian điện di thay đổi phụ thuộc vào

độ lớn của ADN, nồng độ agarose của gel và cường độ dòng điện

Chú ý lượng ADN có thể điện di trong mỗi lỗ răng lược nhiều ít tùy kích thước răng

lược, nếu quá nhiều sẽ xuất hiện hiện tượng "tailyng" (kéo đuôi) khó phân ly

 Kiểm tra bằng AND

1 Nếu điện di ADN trong gel có pha sẵn ethidium bromide thì chiếu tia tử ngoạiHai làn hai bên là dấu khối lượng phân tử (ADN molecular marker), mỗi băng (vệtsáng) của mỗi làn này cách nhau 100 base pair (bp), băng nhỏ nhất (dưới cùng)

"nặng" 100 bp, băng nặng nhất 2.000 bp (giữa 1.000 bp và 2.000 bp không có cácbăng trung gian) Để ước định khối lượng phân tử làn ADN nào đó thì có thể đặtmột thước thẳng lên nó và dóng ngang xem nó tương ứng với băng nào trong làndấu khối lượng phân tử, trường hợp không trùng khít thì có thể ước lượng.ngoại cũng có thể phát hiện được các băng ADN trong quá trình điện dicũng như sau khi điện di Kiểu dạng (pattern) các băng phụ thuộc vàothành phần ADN có trong mẫu cần điện di

2 Nếu không cho trước ethidium bromide thì sau khi điện di cần ngâm gel

30 - 60 phút trong dung dịch thuốc nhuộm này ở nồng độ 0,5 μg/ml

3 Nếu cần chụp ảnh lưu tư lyệu thì có thể dùng máy ảnh pollaroid với ốngkính có phin lọc ánh sáng thích hợp với film pollaroid 667, hoặc dùng thiết

bị phân tích gel số hóa (gel documentation system)

Chú ý: Đèn tử ngoại (UV) có hai loại bức xạ với bước sóng 254 nm

(UV sóng ngắn) và 366 nm (UV sóng dài) UV sóng ngắn giúp quan sát rõADN nhưng làm tổn hại cấu trúc chất này, cho nên nếu cần thu hồi ADN

từ gel thì không nên áp dụng

độ thấp Gel tập trung (stacking gel) có tác dụng làm nguyên lyệu tập trung

Trước khi đổ dịch tạo gel cần dán các mép bằng băng keo dán và kẹp chặt (hoặckẹp trong giá chuyên dụng) cho kín các mép hai bên và đáy.tạo nên một băng mẫu vật gọn, mảnh (các thành phần của mẫu nằm sátnhau nên có cùng điểm xuất phát), trước khi chúng đi vào lớp gel phântách Tuy nhiên, nhiều khi do lượng mẫu cần điện di rất nhỏ, không cầnlớp gel tập trung này Dưới đây cách chế bản gel chỉ gồm gelpolyacrylamide phân tách thường dùng trong điện di ADN.Khuôn gel thường làm từ hai tấm thủy tinh khác nhau: một tấmhình chữ nhật, tấm khác có kích thước hoàn toàn tương tự nhưng được cắtbớt một phần ở một cạnh trừ hai góc, hai phần chừa lại này làm thành hai

"tai" ("rabbit ear") Phần cắt bớt của tấm kính là nơi ráp "lược" tạo các lỗtải mẫu và sau đó, trong quá trình điện di, là nơi dung dịch đệm điện di kếtnối với gel duy trì dòng điện giữa hai đầu (đầu có tai và đầu đáy) của bảngel.

Để chế gel polyacrylamide phân tách ADN cần thực hiện các bước sau:

1 Rửa sạch các tấm thủy tinh kỹ bằng nước sạch, để khô rồi lau lại bằngethanol Ráp các tấm thủy tinh theo hướng dẫn của hãng sản xuất sao chotạo được khoảng hở giữa hai tấm thủy tinh được bịt kín ba phía để khônglàm chảy nguyên lyệu tạo gel khi rót vào Trước tiên đặt tấm thủy tinhnguyên, đặt các thanh cách dọc theo mép tấm thủy tinh đó, rồi đặt tấmthủy tinh có "tai" lên trên sao cho các cạnh của hai tấm thủy tinh trùng khítnhau Trong một số trường hợp, tùy thiết kế, có thể cần dán các mép bên

và khe hở đáy bản gel bằng băng keo rồi dùng kẹp để kẹp các tấm thủytinh (kẹp trước để các tấm thủy tinh ổn định, dán từng cạnh rồi thay kẹp).Tuy nhiên, cũng có thiết kế gài vào khuôn ngoài không cần kẹp

2 Chế gel theo nồng độ thích hợp cho việc phân tách ADN như trình bàytrong bảng sau (pha 100 ml):

Không hình thành bọt khí trong gel Thông thường, nên rót gel từ một méptrong khuôn Trong quá trình này, nếu bản gel không được cố định trước(như gel dùng cho việc giải trình ADN) thì cần nâng dần miệng bản khuôngel từ thế nằm ngang lên cao dần để gel không bị chảy ra ngoài còn bọt khí(nếu có) cũng từ từ thoát lên trên mà ra khỏi gel Bọt khí thường gây biếndạng các băng sản phẩm nhưng điều quan trọng là ôxy làm giảm khả năngpolymer hóa của acrylamide Khi gel lỏng đã đầy khuôn bản

gel, cắm lượcvào đầu khuôn gel (khoảng giữa hai tai) rồi kẹp chặt (chú ý chỉ nên

kẹplược với bản thủy tinh nguyên, không kẹp cả hai tấm thủy tinh để khôngtạo khe hở giữa gel và hai tấm thủy tinh sau khi bỏ kẹp khỏi khuôn bảngel, do có sự đàn hồi các tấm thủy tinh bị ép vào nhau thẳng trở lại sau khi

bỏ kẹp)

Trong trường hợp cần bổ sung lớp gel tập trung ở trên thì khuônbản gel phải cố định theo đúng phương thẳng đứng (kiểm tra bằng thủybình kế), sau khi rót đủ lượng gel phân tách (chừa lại một khoảng ở trên)cần bổ sung lớp nước cất ở phía trên mà không cần cài lược Chờ đến khigel phân tách hóa rắn thì rót bỏ lớp nước này, thay bằng gel tập trung (gelnồng độ thấp) rồi ráp lược lên trên để tạo các lỗ giếng tải mẫu điện di.Thông thường gel cứng trong vòng 30 phút Tuy nhiên, thời gian hóa rắncủa gel tăng khi nhiệt độ hạ cũng như khi nồng độ TEMED và ammoniumpersulfate tăng

 Điện di gel polyacrylamide

1 Sau khi gel cứng lấy lược ra khỏi khuôn bản gel, tháo khuôn bản gelkhỏi khuôn ngoài hoặc kẹp cũng như vật chắn khác sao cho gel có hai đầu(trên và dưới) thông với bên ngoài Gắn khuôn bản gel vào chậu điện di