Phụ lục 1: Các đặc tính lí hóa của AFT.Phụ lục 2: Bảng xếp loại các độc chất dựa vào liều LD50 trên động vật (Lu, 1996)AflatoxinCông thức nguyênTrọng lượng phân tửĐiểm nóng chảyHuỳnh quang dưới tia UVBước sóng huỳnh quang khi kích thích bằng tia 365 nm λEx’ (nm) trongMetanol ACN Chloroform AcetonNhóm difurocoumacyclopentenoneAFL B1 C17H12O6312 267 Xanh lam430 416 415 422AFL B2 C17H14O6314 303-306Xanh lam430 419 415 420AFL B2a C17H14O7320 240 Xanh lamAFL M1 C17H12O7328 299 Xanh lam428AFL M2 C17H14O7330 293 Xanh lam430AFLM2a C17H14O8346 248 LụcNhóm difurocoumarolactoneAFL G1 C17H12O7328 257-259Xanh lục450 440 435 448AFL G2 C17H14O7330 237-240Xanh lục450 437 435 448AFL G2a C17H14O8346 190 Xanh lục
c tớnh LD50Cc c (Super toxic) 5 mg/kgRt c (Extremely toxic) 5 -50 mg/kgc tớnh cao (Highly toxic) 50 500 mg/kgc tớnh khỏ cao (Moderately toxic) 0.5 5 g/kgc tớnh nh (Slightly toxic) 5 15 g/kgKhụng c (Practically nontoxic) > 15 g/kgPh lc 3: S lc cỏch ch to ct IAC (Vin Pasteur Tp. HCM, 2002)1. Gõy min dchTh gõy min dch phi hon ton khe mnh, 2-3 thỏng tui, trng lng trờn 2 kg. Ly 1 ml mỏu tai trc khi tiờm mi mn cm lm chng. Khỏng nguyờn dựng tiờm l cng hp AFB1 BSA ca hóng Sigma Chemical. Khỏng nguyờn c trn vi NaCl 0,9% v tỏ cht (lc 30 phỳt) thu c huyn dch AFB1 BSA. Mi mn cm: tiờm 2 ml huyn dch/th, liu tiờm c chia thnh nhiu mi trờn lng, 100 àl huyn dch cũn li tiờm mt bờn ựi. ựi cũn li tiờm 100 àl vaccine ho g. Mi nhc li 1, 2, 3, 4, 5 tiờm trong 5 thỏng (mi thỏng 1 ln), quy trỡnh tiờm tng t nh trờn nhng lng khỏng nguyờn AFB1 BSA gim dn v khụng cú vaccine ho g.2. Tinh ch IgG14 ngy sau ln tiờm th 5, ly ton b mỏu t ng mch ựi. Ly tõm thu huyt thanh v tỏch b hng cu, sau pha loóng huyt thanh gp ụi bng nc mui sinh lớ. Ta IgG bng (NH4)2SO4 45% bóo hũa. Tip theo cho huyt thanh phn ng vi BSA loi cỏc thnh phn IgG khỏng BSA.3. To cng hp sepharose IgG khỏng AFB1 IgG thu c sau khi tinh ch c gn ng tr lờn sepharose ó c hot húa bi CNBr theo quy trỡnh ca nh sn xut Amersham Biotech. Quỏ trỡnh gn c thc hin mt trong hai ch : (1) 22oC 25oC trong 2 gi hoc (2) 4oC trong 24 gi. Trong thi gian to cng hp, hn hp c trn liờn tc bng mỏy lc nh. Khi cng hp kt thỳc, cn kim tra li IgG cũn d trong hn dch ỏnh giỏ hiu sut gn. Hiu sut gn cng cao thỡ cht lng ct cng cao. Cng hp sepharose IgG l gel cú thm cao khi cho cht lng chy qua. Sau khi x lớ loi b cỏc IgG cũn bỏm c hc trong gel, gel c úng vo ct nha
kích thước 0.4 cm x 10 cm với lượng 0.1 ml – 0.15 ml/cột. Cột được bảo quản ở nhiệt độ 4oC – 8oC. Giá ái lực miễn dịch giữ hoạt tính ổn định ít nhất 1 năm (Nguyễn Lê Trang, 2003) Phụ lục 4: Máy quang phổ (U – 3310 Spectrophotometer – Hitachi) Máy đo huỳnh quang (Vicam – Series – 4 Fluorometer, USA).
Bảng giá tiêm phòng vacxin viện Pasteur Giá tiêm ngừa dịch vụ viện Pasteur TP HCM năm 2016 cập nhật: ngừa viêm não mô cầu, viêm gan siêu vi B, uốn ván, cúm, quai bị, thương hàn, viêm não Nhật Bản, viêm màng não & nhiều bệnh nguy hiểm trẻ sơ sinh & trẻ nhỏ cụ thể bên VnDoc - Tải tài liệu, văn pháp luật, biểu mẫu miễn phí VnDoc - Tải tài liệu, văn pháp luật, biểu mẫu miễn phí Những mũi tiêm phòng cần thiết cho trẻ sơ sinh đến tuổi 1/Sau sinh Trong vòng 24 sau sinh, trẻ sơ sinh tiêm phòng viêm gan siêu vi B 2/ Dưới tháng tuổi Tiêm phòng BCG, ngừa bệnh lao phổi 3/2- tháng tuổi - Tiêm phòng Bạch hầu, Ho gà, Uốn ván, Bại liệt mũi 1,2,3 - Viêm gan siêu vi B mũi 2,3,4 VnDoc - Tải tài liệu, văn pháp luật, biểu mẫu miễn phí - Tiêm phòng Hib mũi 1,2,3 - Vắc-xin Rotavirut: ngăn ngừa Rota virut gây bệnh tiêu chảy 4/ 6-11 tháng tuổi - Tiêm phòng cúm 5/12-15 tháng tuổi - Viêm não Nhật Bản B - Thủy đậu - Sởi, quai bị, Rubella - Viêm gan A mũi 6/ 16-23 tháng tuổi - Bạch hầu, Ho gà, Uốn ván, Bại liệt mũi - Hib mũi - Viêm gan B mũi - Viêm gan A mũi 7/ Trên 24 tháng tuổi - Phòng Viêm màng não mô cầu A+C - Viêm não Nhật Bản mũi - Phòng bệnh viêm mũi họng, viêm màng não vi khuẩn phế cầu - Tiêm phòng thương hàn, tã 8/Trên tuổi - Chủng ngừa HPV: ngăn ngừa ung thư cổ tử cung bệnh sùi mào gà phận sinh dục VnDoc - Tải tài liệu, văn pháp luật, biểu mẫu miễn phí Lịch khám & tiêm phòng Pasteur Khám bệnh + tiêm ngừa: Thứ – thứ 6: – Sáng 7h – 11h; – Chiều 13h – 18h (siêu âm đo điện tim làm việc đến 16h) Thứ 7: – Sáng 7h – 11h; – Chiều 13h – 16h (siêu âm đo điện tim làm việc đến 11h) Chủ nhật: – Sáng 7h30 – 10h30 (chỉ tiêm ngừa) – Chiều nghỉ Xét nghiệm: Thứ – thứ 6: – Sáng 7h – 11h ; – Chiều 13h – 17h (xét nghiệm nước, thực phẩm, lấy máu làm việc tới 16h) Thứ 7: – Sáng 7h – 11h; – Chiều 13h -16h (buổi chiều thứ trả kết quả, không nhận xét nghiệm) Chủ nhật: nghỉ Lưu ý: Đối với người dân có nhu cầu tiêm chủng, nên đến trước 9:30 sáng, đến sau thường bị bảo vệ từ chối cho vào đông hẹn buổi chiều quay lại Kinh nghiệm khám & tiêm ngừa vacxin Pasteur lần đầu VnDoc - Tải tài liệu, văn pháp luật, biểu mẫu miễn phí Một số mẹ sau đưa khám tiêm phòng viện Pasteur TP Hồ Chí Minh nhiều lần rút vài kinh nghiệm chia sẻ sau, bạn tham khảo nhé, nhiên không số trường hợp nhé: Viện Pasteur thường đông, nên mẹ nên cố gắng đến sớm trước làm việc để tiện cho việc giữ xe bốc số thứ tự nhé, tốt nên vào buổi sáng sớm thời tiết mát mẻ bệnh nhân nên đỡ phải chờ lâu, tốt nên tránh vào thứ 2, thứ 6, theo kinh nghiệm số mẹ ngày lượng bệnh nhân đến khám tiêm phòng đông Sau giữ xe xong, mẹ vào phòng khám bệnh, gặp quầy tư vấn nói loại vắc xin muốn tiêm phòng cho con, trình cho bác sĩ tư vấn lịch tiêm phòng cho trước Nếu lần sử dụng dịch vụ đây, bạn bác sĩ phát cho lịch tiêm phòng điền thông tin bé vào Sau đó, bạn đưa lại cho bác sĩ lấy số tứ tự Sau lấy số thứ tự xong, bạn ngồi chờ phía trước phòng khám để bác sĩ tư vấn nhé, Tuy theo lượng bệnh nhân đông hay mà thời gian chờ đợi lâu hay mau, trung bình mẹ phài chờ khoảng từ 20 đến 40 phút Sau bảng số thứ tự đến số bạn (hoặc kêu đến số bạn), bạn đưa bé vào phòng khám bác sĩ tư vấn định nên tiêm phòng vắc xin gì, bác sĩ điền lịch tiêm phòng vào “Phiếu tiêm phòng” cho bé yêu nhà bạn Đối với số vacxin cần xét nghiệm máu trước, bác sĩ định xét nghiệm, sau có kết xét nghiệm bạn quay lại để bác sĩ tư vấn tiếp Sau đó, bạn đưa bé ngoài, nộp “ Phiếu tiêm phòng” vào quầy thu tiền gần phòng tiêm phòng cho bé Bạn ngồi chờ bé khoảng 15 đến 30 phút để đến lượt đóng tiền lấy biên lai Sau đó, bạn bé xếp hàng để đến lượt tiêm cho bé Bạn nhớ giữ bé thật chặc để bác sĩ tiêm dễ dàng, tránh đau cho bé Nếu bé khó tính, bạn VnDoc - Tải tài liệu, văn pháp luật, biểu mẫu miễn phí nên chung với người thân Sau tiêm xong, bạn không nên đưa bé liền mà nên đưa bé phòng ngồi chờ khoảng 15 phút để theo dõi tình trạng bé Lưu ý: bạn lần tái tiêm phòng bé, bạn ngày hẹn bạn cần đưa “Phiếu tiêm phòng” cho bác sĩ quầy tư vấn thẳng vào quầy nộp phiếu đóng tiền Địa Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh Địa chỉ: 167 Pasteur, Phường 8, Quận 3, TP Hồ Chí Minh Điện thoại: (84-8) 38230352 Fax: (84-8) 38231419 Email: nhantin@pasteurhcm.gov.vn Website: www pasteurhcm.gov.vn VnDoc - Tải tài liệu, văn pháp luật, biểu mẫu miễn phí CÁC CHỮ VIẾT TẮTAFB1 aflatoxin B1AFB2 aflatoxin B2AFB1 – BSA aflatoxin B1 – bovine serum albuminCộng hợp aflatoxin B1 vào abumin huyết thanh bò.AFG1 aflatoxin G1AFG2 aflatoxin G2AFM1 aflatoxin M1AFM2 aflatoxin M2AFT aflatoxinAOAC Association of Official Analytical Chemists.Hiệp hội các nhà phân tích hóa học.Ctv cộng tác viênCV coefficient of variation, hệ số biến thiênELISA Enzyme Linked Immunosorbent AssayλEm.Emission wave, bước sóng phát xạλEx.Excited wave, bước sóng kích thíchFAO Food and Agriculture Organisation of the United NationsTổ chức nông lương thế giớiHBV Hepatitis B virus, siêu vi viêm gan BHPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc kí lỏng cao ápIAC Immuno - affinity chromatography, sắc kí ái lực miễn dịch. hay Immuno - affinity column, cột ái lực miễn dịch. LD50Lethal Dose 50, liều gây chết 50%OD360 optical density 360 nm mật độ quang đo được ở bước sóng λ= 360nm.ppm part per million (μg/g)ppb part per billion (ng/g)RIA Radio Immuno Assay, Kĩ thuật miễn dịch phóng xạSD Standard deviation, độ lệch chuẩn.TFA Trifluoracetic acidTLC Thin Layer Chromatography, sắc kí lớp mỏngUV Ultra Violet, bức xạ tử ngoại.ix
1 Phần 1. MỞ ĐẦU1.1 Đặt vấn đềVi nấm (Fungi) và độc tố vi nấm (Mycotoxin) là vấn đề rất quan trọng trong công tác bảo quản nông sản, thực phẩm và trong y tế. Gần 400 độc tố vi nấm được phát hiện cho đến nay [18], trong đó, aflatoxin là độc tố được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất.Aflatoxin là tên gọi một nhóm chất độc, sản phẩm của quá trình trao đổi chất của một số loài nấm mà chủ yếu là loài Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus…. Trong đó, phổ biến nhất và độc nhất là aflatoxin B1, G1, B2 và G2, có thể gây bệnh ở mức vi lượng.Đối với động vật nuôi (gà, vịt, lợn…), aflatoxin gây bệnh nhiễm độc Aflatoxicosis, rất phổ biến, đặc biệt các nước nhiệt đới. Bệnh làm vật nuôi kém phát triển, sức sản xuất giảm, dễ mẫn cảm với các bệnh truyền nhiễm, bị ung thư và thậm chí bị chết. Do đó, hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi bị ảnh hưởng nghiêm trọng, chịu nhiều tổn thất lớn.Đối với người, đáng chú ý là khả năng gây ung thư gan và dị tật thai do aflatoxin nhiễm từ sữa mẹ truyền cho con.Aflatoxin có ảnh hưởng nghiêm trọng như vậy nhưng lại rất khó để loại bỏ vì aflatoxin hiện diện ở khắp nơi trong môi trường lại khó bị phân huỷ bởi nhiệt. Do vậy, việc nghiên cứu tìm ra các phương pháp phân tích tối ưu nhằm phát hiện aflatoxin trong thực phẩm và nguyên liệu thực phẩm là điều cần thiết.Quy trình phân tích aflatoxin thường phải qua nhiều giai đoạn chiết xuất, làm sạch, cô đặc, cùng với việc định tính và định lượng aflatoxin bằng các phương pháp như: sắc kí cột, sắc kí lớp mỏng (TLC), sắc kí lỏng cao áp (HPLC) dễ bị sai số do phải qua nhiều thao tác, tăng thất thoát trong các công đoạn. Trước những khó khăn trên, sắc kí ái lực miễn dịch (immuno-affinity chromatography-IAC) ra đời, sử dụng trong công đoạn tinh sạch và cô đặc mẫu đồng thời, dựa trên nguyên lí gắn kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, tạo khả năng chọn lọc cao mà các phương pháp khác không có được; quy trình chiết và tinh chế aflatoxin của phương pháp IAC lại đơn giản đã đáp ứng được nhu cầu về độ tin cậy cao trong các kết quả phân tích. Trong số các aflatoxin, aflatoxin B1 được chú ý nhiều nhất do sự hiện diện rộng khắp nhất cũng như do tính độc ngắn hạn và dài hạn của aflatoxin B1 cao hơn nhiều so với các aflatoxin khác.
2 Từ những cơ sở trên, viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh đã tiến hành thực hiện đề tài Sản xuất giá ái lực miễn dịch bắt aflatoxin B1. Giá (cột) sắc kí ái lực tạo nên đã cho hiệu quả cao trong phân tích định lượng aflatoxin B1. Bên cạnh đó, aflatoxin G1 là độc tố vi nấm chỉ đứng sau aflatoxin B1 về độc tính, cũng có khả năng gây hại cao cho người và vật nuôi, hơn nữa cấu trúc hoá học lại khá tương đồng với aflatoxin B1 nên cũng là một đối tượng quan trọng cần tiến hành nghiên cứu.Được sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, sự hướng dẫn của PGS. TSKH Nguyễn Lê Trang - Viện Pasteur, Tp. Hồ Chí Minh và TS. Nguyễn Ngọc Hải, tôi tiến hành đề tài “Đánh giá khả năng bắt aflatoxin G1 của cột ái lực miễn dịch do Viện Pasteur Tp.HCM sản xuất”.1.2 Mục đíchKhảo sát khả năng bắt aflatoxin G1 của cột ái lực miễn dịch.1.3 Yêu cầuXác định các đặc tính của cột 1 Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Vi nấm (Fungi) và độc tố vi nấm (Mycotoxin) là vấn đề rất quan trọng trong công tác bảo quản nông sản, thực phẩm và trong y tế. Gần 400 độc tố vi nấm được phát hiện cho đến nay [18], trong đó, aflatoxin là độc tố được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất. Aflatoxin là tên gọi một nhóm chất độc, sản phẩm của quá trình trao đổi chất của một số loài nấm mà chủ yếu là loài Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus…. Trong đó, phổ biến nhất và độc nhất là aflatoxin B 1 , G 1 , B 2 và G 2 , có thể gây bệnh ở mức vi lượng. Đối với động vật nuôi (gà, vịt, lợn…), aflatoxin gây bệnh nhiễm độc Aflatoxicosis, rất phổ biến, đặc biệt các nước nhiệt đới. Bệnh làm vật nuôi kém phát triển, sức sản xuất giảm, dễ mẫn cảm với các bệnh truyền nhiễm, bị ung thư và thậm chí bị chết. Do đó, hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi bị ảnh hưởng nghiêm trọng, chịu nhiều tổn thất lớn. Đối với người, đáng chú ý là khả năng gây ung thư gan và dị tật thai do aflatoxin nhiễm từ sữa mẹ truyền cho con. Aflatoxin có ảnh hưởng nghiêm trọng như vậy nhưng lại rất khó để loại bỏ vì aflatoxin hiện diện ở khắp nơi trong môi trường lại khó bị phân huỷ bởi nhiệt. Do vậy, việc nghiên cứu tìm ra các phương pháp phân tích tối ưu nhằm phát hiện aflatoxin trong thực phẩm và nguyên liệu thực phẩm là điều cần thiết. Quy trình phân tích aflatoxin thường phải qua nhiều giai đoạn chiết xuất, làm sạch, cô đặc, cùng với việc định tính và định lượng aflatoxin bằng các phương pháp như: sắc kí cột, sắc kí lớp mỏng (TLC), sắc kí lỏng cao áp (HPLC) dễ bị sai số do phải qua nhiều thao tác, tăng thất thoát trong các công đoạn. Trước những khó khăn trên, sắc kí ái lực miễn dịch (immuno-affinity chromatography-IAC) ra đời, sử dụng trong công đoạn tinh sạch và cô đặc mẫu đồng thời, dựa trên nguyên lí gắn kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, tạo khả năng chọn lọc cao mà các phương pháp khác không có được; quy trình chiết và tinh chế aflatoxin của phương pháp IAC lại đơn giản đã đáp ứng được nhu cầu về độ tin cậy cao trong các kết quả phân tích. Trong số các aflatoxin, aflatoxin B 1 được chú ý nhiều nhất do sự hiện diện rộng khắp nhất cũng như do tính độc ngắn hạn và dài hạn của aflatoxin B 1 cao hơn nhiều so với các aflatoxin khác.
2 Từ những cơ sở trên, viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh đã tiến hành thực hiện đề tài Sản xuất giá ái lực miễn dịch bắt aflatoxin B1. Giá (cột) sắc kí ái lực tạo nên đã cho hiệu quả cao trong phân tích định lượng aflatoxin B 1 . Bên cạnh đó, aflatoxin G1 là độc tố vi nấm chỉ đứng sau aflatoxin B1 về độc tính, cũng có khả năng gây hại cao cho người và vật nuôi, hơn nữa cấu trúc hoá học lại khá tương đồng với aflatoxin B1 nên cũng là một đối tượng quan trọng cần tiến hành nghiên cứu. Được sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, sự hướng dẫn của PGS. TSKH Nguyễn Lê Trang - Viện Pasteur, Tp. Hồ Chí Minh và TS. Nguyễn Ngọc Hải, tôi tiến hành đề tài “Đánh giá khả năng bắt aflatoxin G1 của cột ái lực miễn dịch do Viện Pasteur Tp.HCM sản xuất”. 1.2 Mục đích Khảo sát khả