41 4 3,7 4 3,6 4 3,7 4 3,2 Trung bình 3,63 SD 0,28 CV% 7,8 Bảng 4.4: Kết quả về độ lặp lại của cột đối với AFG1 ở lượng 19 ppb Nhận xét: Bảng 4.3 và bảng 4.4 cho thấy ít có sự chênh lệch về kết quả khảo sát của các cột khác nhau (10 cột) với cùng một lượng AFG1 cho vào mỗi cột IAC (SD= 0,28 và 1,23 tương ứng với lượng AFG1 4 ng và 19 ng). Khả năng bắt giữ AFG1 tương đối đồng đều, thể hiện qua hệ số biến thiên thấp (CV% < 20%, CV% = 7,8% và 8,03% tương ứng với lượng AFG1 4 ng và 19 ng). Lượng AFG1 cho vào cột (ppb) Lượng AFG1 thu hồi (ppb) 19 16 19 17 19 16 19 15 19 15 19 15 19 16 19 15 19 14 19 14 Trung bình 15,3 SD 1,23 CV% 8,03 42 Từ kết quả thu được khi thí nghiệm được bố trí tương tự với AFB1, CV% = 13,17% và 9,19% tương ứng với 5 ng và 20 ng lượng AFB1[2], cũng thấp hơn 20%, chứng tỏ cột IAC do Viện Pasteur sản xuất thể hiện độ đồng đều chấp nhận được trong phân tích. 43 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận - Cột IAC tạo thành có kích thước 0,4 x 10 cm với nồng độ kháng thể kháng AFB1 là 2,5 mg/ml gel CNBr - activated sepharose 4B, có khả năng bắt giữ AFB1 và AFG1. - Độ nhạy của cột IAC: 1 ppb. - Độ lặp lại của cột IAC: CV = 7,8% với lượng 4 ng AFG1 CV = 8,03% với lượng 19 ng AFG1. 2. Đề nghị - Khảo sát các chỉ tiêu đánh giá khác của cột như: dung tích cột, hiệu suất thu hồi để có thể kết lưận thuyết phục về khả năng bắt AFG1 của cột IAC. - Do có sự tương đồng về cấu trúc ở vòng difuran giữa AFB1, AFG1 và AFM1, là vị trí đặc hiệu miễn dịch của AFB1, do tính độc cũng như khả năng hiện diện trong sản phẩm sữa, cần thiết khảo sát các chỉ tiêu đánh giá đối với AFM1. 44 Phần 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Dương Ngọc Diễm, 2003. Tạo kháng thể kháng ochratoxin và giá ái lực bắt Ochratoxin. Khóa luận tốt nghiệp, khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học tự nhiên, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 2. Bùi Thị Mỹ Duyên, 2004. Khảo sát các đặc tính của cột sắc kí ái lực miễn dịch dùng trong định lượng Aflatoxin B 1 do Viện Pasteur TP. HCM sản xuất. Luận văn tốt nghiệp, khoa Chăn nuôi – Thú y, trường Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 3. Bùi Xuân Đồng và Nguyễn Huy Văn, 2000. Vi nấm dùng trong Công Nghệ Sinh Học. Nhà xuất bản Khoa học và Kĩ thuật, Hà Nội. 201 trang. 4. Trần Minh Đức, 2002. Khảo sát tình hình nhiễm Aflatoxin B 1 trên thức ăn hỗn hợp cho heo tại thị xã Cao Lãnh, tỉnh Đồng Tháp. Luận văn tốt nghiệp, khoa Chăn nuôi – Thú y, trường Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 5. Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003. Nấm mộc và độc tố aflatoxin trong thức ăn chăn nuôi. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Hà Nội. 210 trang. 6. Đặng Văn Hòa, 1993. Giáo trình kiểm nghiệm thuốc, trường Đại học Y Dược, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam 7. Đặng Văn Giáp, 1997. Phân tích dữ liệu khoa học bằng chương trình MS – Excel. Nhà xuất bản Giáo dục. 8. Nguyễn Ngọc Kiểng, 2000. Toán – Thống kê sinh vật, lý thuyết xác suất. Trường Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam 9. Đỗ Ngọc Liên, 2004. Thực hành hóa sinh miễn dịch. Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia Hà Nội, 316 trang. 10. Lâm Thị Nhạn, 2001. Cải tiến kĩ thuật định lượng Aflatoxin trong thực phẩm. Luận án thạc sĩ khoa học, chuyên nghành hóa phân tích, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Đại Học Quốc Gia, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 11. Lê Anh Phụng, 2001. Bệnh nhiễm độc Aflatoxin và các phương pháp phát hiện Aflatoxin. Chuyên đề cấp tiến sĩ, khoa Chăn nuôi – Thú y, trường Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 45 12. Trịnh Việt Anh Tài, 2002. Đánh giá hiệu quả thu hồi Aflatoxin của cột ái lực miễn dịch do phân viện công nghệ sau thu hoạch Tp. HCM chế tạo. Luận văn tốt nghiệp, khoa Chăn nuôi – Thú y, trường Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 13. Châu Vĩnh Thị, 2001. Khảo sát tình hình nhiễm vi nấm sinh độc tố & độc tố aflatoxin trên một số thành phẩm đông dược Việt Nam lưu hành tại Tp Hồ Chí Minh. Luận văn thạc sĩ dược học, chuyên nghành Kiểm nghiệm - Độc chất, trường Đại học Y Dược, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 14. Nguyễn Lê Trang, 2003. Aflatoxin B1: sản xuất giá ái lực miễn dịch bắt các aflatoxin(s). Thuyết minh đề tài nghiên cứu Khoa học Công nghệ cấp bộ, phòng Miễn dịch, viện Pasteur, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. TIẾNG ANH 15. Carlos A. Muro-Cacho et al, 2004. Mycotoxins: Mechanisms of toxicity and Methods of Detection for identifying exposed individuals. Journal of Land Use, Vol. 19:2, spring, 2004. 16. Fun sun Chun, 1983. Immunoassays for analysis of Mycotoxins. Journal of Food Protection, Vol. 47, No. 7, Pages 562-569 (July 1984). 17. M. O. Moss, 1998. Recent study of mycotoxins. Journal of Applied Microbiology Symposium Supplement 1998, 84, 62S-76S. 18. Maryann E. Smela et al, 2001. The chemistry and biology of aflatoxin B 1 : from mutational spectrometry to carcinogenesis. Carcinogenesis vol.22 no.4 pp.535- 545, 2001. 19. Yu et al, 2004. Clustered Pathway Genes in Aflatoxin Biosynthesis. Applied and Environmental Microbiology, March 2004, p. 1253-1262, Vol 70, No. 3. 20. http://www.schimmel-schimmelpilze.de/schimmelpilz/aspergillus-flavus.html 21. http://www.schimmel-schimmelpilze.de/schimmelpilz/aspergillus- parasiticus.html 22. http://www.ehso.com/ehshome/aflatoxin.php 46 Phụ lục 1: Các đặc tính lí hóa của AFT. Aflatoxin Công thức nguyên Trọng lượng phân tử Điểm nóng chảy Huỳnh quang dưới tia UV Bước sóng huỳnh quang khi kích thích bằng tia 365 nm λ Ex’ (nm) trong Metanol ACN Chloroform Aceton Nhóm difurocoumacyclopentenone AFL B1 C 17 H 12 O 6 312 267 Xanh lam 430 416 415 422 AFL B2 C 17 H 14 O 6 314 303- 306 Xanh lam 430 419 415 420 AFL B2a C 17 H 14 O 7 320 240 Xanh lam AFL M1 C 17 H 12 O 7 328 299 Xanh lam 428 AFL M2 C 17 H 14 O 7 330 293 Xanh lam 430 AFLM2a C 17 H 14 O 8 346 248 Lục Nhóm difurocoumarolactone AFL G1 C 17 H 12 O 7 328 257- 259 Xanh lục 450 440 435 448 AFL G2 C 17 H 14 O 7 330 237- 240 Xanh lục 450 437 435 448 AFL G2a C 17 H 14 O 8 346 190 Xanh lục 47 Phụ lục 2: Bảng xếp loại các độc chất dựa vào liều LD 50 trên động vật (Lu, 1996) Độc tính LD 50 Cực độc (Super toxic) 5 mg/kg Rất độc (Extremely toxic) 5 -50 mg/kg Độc tính cao (Highly toxic) 50 – 500 mg/kg Độc tính khá cao (Moderately toxic) 0.5 – 5 g/kg Độc tính nhẹ (Slightly toxic) 5 – 15 g/kg Không độc (Practically nontoxic) > 15 g/kg Phụ lục 3: Sơ lược cách chế tạo cột IAC (Viện Pasteur Tp. HCM, 2002) 1. Gây miễn dịch Thỏ để gây miễn dịch phải hoàn toàn khỏe mạnh, 2-3 tháng tuổi, trọng lượng trên 2 kg. Lấy 1 ml máu tai trước khi tiêm mũi mẫn cảm để làm chứng. Kháng nguyên dùng tiêm là cộng hợp AFB1 – BSA của hãng Sigma Chemical. Kháng nguyên được trộn với NaCl 0,9% và tá chất (lắc 30 phút) để thu được huyễn dịch AFB1 – BSA. Mũi mẫn cảm: tiêm 2 ml huyễn dịch/thỏ, liều tiêm được chia thành nhiều mũi trên lưng, 100 µl huyễn dịch còn lại tiêm ở một bên đùi. Đùi còn lại tiêm 100 µl vaccine ho gà. Mũi nhắc lại 1, 2, 3, 4, 5 tiêm trong 5 tháng (mỗi tháng 1 lần), quy trình tiêm tương tự như trên nhưng lượng kháng nguyên AFB1 – BSA giảm dần và không có vaccine ho gà. 2. Tinh chế IgG 14 ngày sau lần tiêm thứ 5, lấy toàn bộ máu từ động mạch đùi. Ly tâm thu huyết thanh và tách bỏ hồng cầu, sau pha loãng huyết thanh gấp đôi bằng nước muối sinh lí. Tủa IgG bằng (NH 4 ) 2 SO 4 45% bão hòa. Tiếp theo cho huyết thanh phản ứng với BSA để loại các thành phần IgG kháng BSA. 3. Tạo cộng hợp sepharose – IgG kháng AFB1 IgG thu được sau khi tinh chế được gắn đồng trị lên sepharose đã được hoạt hóa bởi CNBr theo quy trình của nhà sản xuất Amersham – Biotech. Quá trình gắn 48 được thực hiện ở một trong hai chế độ: (1) 22 o C – 25 o C trong 2 giờ hoặc (2) 4 o C trong 24 giờ. Trong thời gian tạo cộng hợp, hỗn hợp được trộn liên tục bằng máy lắc nhẹ. Khi cộng hợp kết thúc, cần kiểm tra lại IgG còn dư trong hỗn dịch để đánh giá hiệu suất gắn. Hiệu suất gắn càng cao thì chất lượng cột càng cao. Cộng hợp sepharose – IgG là gel có độ thấm cao khi cho chất lỏng chảy qua. Sau khi xử lí để loại bỏ các IgG còn bám cơ học trong gel, gel được đóng vào cột nhựa kích thước 0.4 cm x 10 cm với lượng 0.1 ml – 0.15 ml/cột. Cột được bảo quản ở nhiệt độ 4 o C – 8 o C. Giá ái lực miễn dịch giữ hoạt tính ổn định ít nhất 1 năm (Nguyễn Lê Trang, 2003) Phụ lục 4: Máy quang phổ (U – 3310 Spectrophotometer – Hitachi) Máy đo huỳnh quang (Vicam – Series – 4 Fluorometer, USA). . Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 45 12. Trịnh Việt Anh Tài, 2002. Đánh giá hiệu quả thu hồi Aflatoxin của cột ái lực miễn dịch do phân viện công nghệ sau thu hoạch Tp. HCM chế tạo. Luận văn. của cột sắc kí ái lực miễn dịch dùng trong định lượng Aflatoxin B 1 do Viện Pasteur TP. HCM sản xuất. Luận văn tốt nghiệp, khoa Chăn nuôi – Thú y, trường Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh,. AFG1. - Độ nhạy của cột IAC: 1 ppb. - Độ lặp lại của cột IAC: CV = 7,8% với lượng 4 ng AFG1 CV = 8,03% với lượng 19 ng AFG1. 2. Đề nghị - Khảo sát các chỉ tiêu đánh giá khác của cột như: