31 NaCl 0,5 M pH = 4 (6) Tris – HCl 0,1 M NaCl 0,5 M NaN 3 0,05% pH = 7,4 (7) HCl 1 nM pH = 3 Chuẩn bị protein Kháng thể IgG dưới dạng tủa trong ammonium sulphate. Thẩm tích tủa trong dung dịch (1): 1 (lit) x 2 lần. Thẩm tích tủa trong dung dịch (2): 1 (lit) x 2 lần. Xác định nồng độ IgG bằng quang phổ kế ở λ= 280 nm. Thẩm tích trong dung dịch (3) qua đêm. Chuẩn bị gel CNBr – activated Sepharose 4B (Amersham Pharmacia BiotechAB). 1 g gel khô trương phồng thành 3,5 ml gel. Rửa gel với dung dịch (7), thể tích 200 ml dung dịch/ g gel. Cộng hợp IgG vào Sepharose Cho dung dịch IgG vào gel đã rửa (từ 2,5 đến 10 mg IgG/ ml gel), để 2 giờ ở nhiệt độ phòng hay qua đêm ở 4 o C. Lấy dịch nổi đo hấp phụ quang ở λ= 280 nm. Rửa lại với đệm (3). Bất hoạt nhóm -C N + còn lại với đệm (4) trong 1 giờ. Rửa với đệm (5). Lần cuối rửa với dung dịch (6) ở 4 o C - 8 o C. Nén cột Rửa frit và cột bằng ethanol. Nén miếng frit vào đáy của cột. Cho gel đã cộng hợp IgG vào cột. Cho dung dịch (6) vào cột. Bảo quản ở 4 o C. 32 3.3.1.2 Phương pháp quang phổ kế để xác định nồng độ AFG1(theo Nollet, 1992) Nguyên tắc: Photon ánh sáng ở vùng tử ngoại do đèn nguồn phát khi qua bộ tạo ánh sáng đơn sắc sẽ chỉ cho qua ánh sáng với bước sóng nhất định, và khi qua dung dịch trong cốc sẽ gây ra sự thay đổi năng lượng của các điện tử. Khi phân tử hấp thụ năng lượng ánh sáng này, các điện tử sẽ chuyển lên mức năng lượng cao hơn. Tuy nhiên, chỉ có điện tử ở các hợp chất có nối đôi hay/và ba mới hấp thụ ánh sáng ở vùng tử ngoại. Tiếp đến, bộ nhận tín hiệu, bộ khuyếch đại tín hiệu và đồng hồ đo sẽ phân tích cho 2 chỉ tiêu: Mật độ quang (OD) Độ thấu quang (T- transmittance) Cực đại hấp thụ (λ max ) là bước sóng mà ở đó chất cho độ hấp thụ lớn nhất. Và ở mỗi cực đại hấp thụ, chất lại có hệ số hấp thụ mol nhất định (Σ) [6]. Nồng độ của chất phân tích được tính theo công thức 1000MOD ml/g max OD 360 : giá trị hấp thụ ở cực đại hấp thụ (λ max ) M: trọng lượng phân tử chất cần phân tích Chuẩn bị dung dịch AFG1 chuẩn và xác định nồng độ Mục đích: Pha loãng dung dịch AFG 1 chuẩn, cần thiết cho những lượng mẫu rất ít sẽ dùng ở các thí nghiệm sau. Đèn nguồn Bộ tạo ánh sáng đơn sắc Cốc đựng mẫu đo Bộ nhận tín hi ệu Bộ khuyếch đại tín hiệu Đồng h ồ đo Hình 3.1: Sơ đồ hoạt động của máy quang phổ tử ngoại 33 Tiến hành: Chuẩn AFG 1 1mg Pha thành dung dịch AFG 1 có nồng độ 250 ppm (1 mg / 4 ml CHCl 3 ) Lấy 280 µl AFG 1 /CHCl 3 (250 ppm) pha trong 720 µl CHCl 3 thành 1 ml dịch pha Thêm tiếp 9 ml CHCl 3 vào Đo OD 360 Mẫu trắng: dung dịch CHCl 3 . Cách thực hiện: Cho 2 cóng chứa đầy dung môi CHCl 3 vào quang phổ kế, sau đó lấy cóng bên ngoài ra, thay dung môi bằng dung dịch AFG1 đã pha vào đầy cóng, cho cóng vào lại quang phổ kế. Sau đó đọc kết quả ở ánh sáng λ = 360 nm. Tính µg AFG1/ml với λ = 360 nm, M=360 và Σ= 19500. 3.3.1.3 Quy trình chiết xuất, cô đặc và tinh chế AFG1 trên cột IAC Sử dụng quy trình của hãng Vicam (Mỹ). Để cột cân bằng ở nhiệt độ phòng 15 o C. Rửa cột bằng 15 ml nước. Với mẫu, quy trình được tiến hành 30 g mẫu + 6 g NaCl + 150 ml MeOH 80% Lắc 30 phút Lọc qua giấy lọc thường Cho 20 ml dịch lọc vào bình chính xác. Thêm nước cho đủ 60 ml Lọc qua lọc thuỷ tinh 34 Cho 15 ml dịch lọc vào cột Rửa cột bằng 10 - 15 ml dịch rửa (62 ml nước + 8 ml MeOH + 70 µl Tween 20) Rửa cột bằng 10 ml nước. Rửa giải bằng 1ml MeOH Cho tác dụng với 1ml dung dịch Br 2 0.003% Đọc kết quả bằng huỳnh quang kế 3.3.1.4 Phương pháp dùng huỳnh quang kế đo lường hàm lượng aflatoxin Nguyên tắc: Các phân tử hấp thụ các photon ánh sáng thích hợp để chuyển từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích. Ngược lại, các phân tử đã ở trạng thái kích thích có thể trở về trạng thái cơ bản bằng cách giải phóng năng lượng hấp thụ dưới dạng photon, tức là tự phát ra ánh sáng, gọi là sự phát quang (luminescene). Cường độ và bước sóng của ánh sáng phát ra có thể đo lường được [6]. Nguồn sáng Bộ tạo ánh sáng kích thích đơn sắc Cốc đựng mẫu đo Bộ nhận tín hi ệu Bộ khuyếch đại tín hiệu Đồng h ồ đo Khe sáng vào Khe sáng ra Bộ tạo ánh sáng bức xạ đơn sắc Hình 3.2: Sơ đồ hoạt động của huỳnh quang kế 35 Mỗi chất được đặc trưng bởi 2 hằng số: Cực đại kích thích (λ Ex. ) là bước sóng mà khi bị kích thích tại bước sóng này, chất cho cường độ phát quang tương đối (I tđ ) là lớn nhất. Cực đại bức xạ (λ Em. ) là bước sóng mà ở đó chất cho I tđ lớn nhất. Ở nồng độ loãng, I tđ tỉ lệ với nồng độ của chất trong dung dịch. Tiến hành: Chuẩn bị huỳnh quang kế: mở máy trước 15-20 phút. Sau đó, cho tuần tự 3 ống chuẩn của máy (màu đỏ, xanh, vàng) vào để chuẩn máy. Chuẩn bị dung dịch cần đo: mẫu hoặc chuẩn AFG1 được chuẩn bị theo quy trình 3.3.1.3. Đo lượng AFG1: Cuvet (cốc đựng mẫu đo) chứa 1 ml dịch giải hấp và 1 ml dung dịch Br 2 0,003% (làm tăng khả năng phát huỳnh quang của AFG1) được cho vào huỳnh quang kế, đậy nắp lại. Sau 1 phút, máy sẽ tự động tính và hiển thị kết quả cho biết hàm lượng AFT. 3.3.2 Xây dựng đường chuẩn cho AFG1 bằng huỳnh quang kế Mục đích: Khảo sát sự tương quan tuyến tính giữa lượng AFG1 và cường độ sáng trên máy huỳnh quang. Thực hiện: Chuẩn bị dung dịch AFG1 chuẩn/ MeOH (0,25 ng/µl) từ dung dịch AFG1 chuẩn/CHCl 3 với nồng độ được xác định bằng quang phổ kế (3.3.1.2). Bố trí các nồng độ AFG1 theo bảng Bảng 3.1: Bố trí các nồng độ AFG1 chuẩn để xây dựng đường chuẩn. Lượng AFG1 chuẩn (ng) Dung dịch AFG1 (0,25 ng/µl) (µl) MeOH (µl) Dung dịch Br 2 (µl) 5 10 20 40 50 20 40 80 160 200 980 960 920 840 800 1000 1000 1000 1000 1000 36 Đo trên huỳnh quang kế với các nồng độ AFG1 trên (thể tích đo là 2 ml). Xây dựng đường chuẩn với phần mềm M. Excel 2003. 3.3.3 Khảo sát các chỉ tiêu 3.3.3.1 Độ nhạy của cột Mục đích: khảo sát khả năng bắt giữ AFG1 ở mức thấp nhất của cột IAC. Thực hiện: Chuẩn bị dung dịch AFG1 chuẩn/ MeOH (0,025 ng/µl) từ dung dịch AFG1 chuẩn/CHCl 3 với nồng độ được xác định bằng quang phổ kế (3.3.1.2). Bố trí thí nghiệm theo bảng Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm để khảo sát độ nhạy. Lượng AFG 1 chuẩn (ng) Thể tích các thành phần cho qua cột Dung dịch AFG 1 (µl) MeOH (µl) Nước cất (ml) 1 40 1960 8 2 80 1920 8 4 160 1840 8 Cho lượng AFG1 chuẩn với nồng độ 0,025 ng/µl và hàm lượng giảm dần 4 ppb, 2 ppb và 1 ppb qua cột IAC và chiết tách theo quy trình 3.3.1.3. Mỗi hàm lượng thực hiện lặp lại trên 3 cột. Hàm lượng AFG1 tối thiểu sau khi qua cột IAC được xác định bằng phương pháp huỳnh quang kế. 3.3.3.2 Độ lặp lại của cột Mục đích : khảo sát độ đồng đều của các cột IAC (khả năng bắt giữ của các cột có như nhau không). Thực hiện: Thử nghiệm khả năng lặp lại của cột khi bắt AFG1 ở 2 nồng độ 5 ppb và 20 ppb. Ở mỗi nồng độ, chọn ngẫu nhiên 10 cột trong lô cột đã sản xuất. Chuẩn bị dung dịch AFG1 chuẩn/ MeOH (0,25 ng/µl) từ dung dịch AFG1 chuẩn/CHCl 3 với nồng độ được xác định bằng quang phổ kế (3.3.1.2). 37 Cho dung dịch AFG1 qua cột tương ứng với 4 ppb và 19 ppb và chiết tách theo quy trình 3.3.1.3 Hàm lượng AFG1 được xác định bằng phương pháp huỳnh quang kế. 3.3.4 Phương pháp xử lí số liệu Số liệu được thu thập và xử lí bằng phần mềm Excel 2003. 38 Hình 4.1: Cột IAC Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Cột IAC 2,5 do Viện Pasteur Tp. HCM sản xuất Cột có đặc điểm Cột nhựa có kích thước 0,4 x 10 cm. Nồng độ kháng thể kháng AFB1gắn lên cột bằng 2,5 mg/ml gel CNBr - activated sepharose 4B, có khả năng bắt giữ AFB1. 4.2 Nồng độ dung dịch AFG1 chuẩn xác định bằng quang phổ kế Với giá trị OD 360 = 4 nhận được từ huỳnh quang kế, ta có nồng độ của dung dịch AFG1 chuẩn thuộc 280 µl lấy ra từ dung dịch mẹ ban đầu: 38,7 19500 10003604 ml/1gAFG (µg/ml) hay (ppm) 4.3 Đường chuẩn AFG1 dựa trên huỳnh quang kế Kết quả được trình bày qua bảng 4.1 và được minh họa qua biểu đồ 4.1 Bảng 4.1: Kết quả xây dựng đường chuẩn AFG1 dựa trên hùynh quang kế Lượng AFG1 (ng) r Kết quả đo bằng hùynh quang kế (ng) SD CV% (1) (2) (3) (4) (5) TB 5 5 4,6 3,8 5,2 4,5 3,6 4,34 0,65 14,9 10 5 8,4 9,1 9,8 8,2 9,3 8,96 0,66 7,3 20 5 18 18 18 19 19 18,4 0,55 3 40 5 37 41 38 41 39 39,2 1,79 4,6 50 5 42 46 48 50 49 47 3,16 6,7 (r: số lần lặp lại; TB: trung bình) 39 y = 0,966x - 0,583 0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60 L ượ ng AFG1 (ng) N ồ ng độ t ừ hu ỳ nh quang (ng) Biểu đồ 4.1: Mối tương quan giữa lượng AFG1 và cường độ phát huỳnh quang. Từ bảng và đồ thị có nhận xét: Độ lệch chuẩn (SD) nói lên mức độ chênh lệch giữa các số liệu; số liệu càng rời rạc thì SD càng lớn [8]. Ở bảng 4.1, SD biến thiên từ 0,55 - 3,16 và có thể thấy, với lượng AFG1 càng lớn thì SD càng tăng tương ứng với mức độ sai số xảy ra càng cao. Các sai số có thể là thao tác hút bằng micropipet không chuẩn xác, sự thất thoát AFG1 trong quá trình thực hiện… Hệ số biến thiên (CV%) nhằm đánh giá độ chính xác và tính khách quan của các số liệu thu thập được [8]. Ở bảng 4.1, CV% nhỏ hơn 20% (3% - 14,9%) nên đạt mức chấp nhận trong phân tích [7]. Đồ thị đã thể hiện được mối liên hệ tuyến tính giữa lượng AFG1 và cường độ phát huỳnh quang qua phương trình y = 0,966x – 0,583 với R 2 = 0,998. 4.4 Độ nhạy của cột Cho lượng AFG1 với nồng độ 7,38 ppm và hàm lượng giảm dần 4 ppb, 2 ppb, 1 ppb qua cột IAC và chiết tách theo quy trình, mỗi hàm lượng lặp lại trên 3 cột, ta thu được kết quả: 40 Bảng 4.2: Kết quả về độ nhạy của cột đối với AFG1 Lượng AFG1 cho vào cột (ppb) Lượng AFG1 thu hồi (ppb) Lượng thu hồi trung bình (ppb) CV% 4 3,5 3,0 3,4 3,3 8,02 2 1,8 1,9 1,9 1,87 3,09 1 0,8 0,7 0,8 0,77 7,53 Nhận xét: Bảng 4.2, với CV% từ 3,09-8,02 tức nhỏ hơn 20% cho thấy tính chính xác và khách quan có thể chấp nhận của số liệu [7]. Từ đó suy ra, khả năng bắt giữ và phát hiện AFG1 của cột IAC và huỳnh quang kế ở hàm lượng thấp nhất 1 ppb. Kết quả này tương đương với kết quả đối với AFB1, cũng như với việc sử dụng phương pháp chiết tách hóa học và phân tích bằng TLC (Lê Anh Phụng, 2002). Kết quả này một lần nữa khẳng định ưu điểm của IAC có thể phục vụ tốt cho việc phân tích AFT ở mức vi lượng; và cùng với huỳnh quang kế, việc phân tích trở nên ít tốn thời gian hơn (đọc kết quả trực tiếp trên huỳnh quang kế chỉ mất 1 phút) và không dùng hóa chất độc hại nên thân thiện với môi trường hơn. 4.5 Độ lặp lại của cột Thử nghiệm khả năng lặp lại của cột khi bắt AFG1 ở nồng độ 4 ppb, 19 ppb , 10 cột lặp lại cho mỗi nồng độ, ta thu được kết quả: Bảng 4.3: Kết quả về độ lặp lại của cột đối với AFG1 ở lượng 4 ppb Lượng AFG1 cho vào cột (ppb) Lượng AFG1 thu hồi (ppb) 4 3,5 4 3,4 4 3,9 4 3,4 4 4,2 4 3,7 . 4. 1: Cột IAC Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4. 1 Cột IAC 2,5 do Viện Pasteur Tp. HCM sản xuất Cột có đặc điểm Cột nhựa có kích thước 0 ,4 x 10 cm. Nồng độ kháng thể kháng AFB1gắn lên cột. 3.3.3.2 Độ lặp lại của cột Mục đích : khảo sát độ đồng đều của các cột IAC (khả năng bắt giữ của các cột có như nhau không). Thực hiện: Thử nghiệm khả năng lặp lại của cột khi bắt AFG1 ở 2 nồng. 5,2 4, 5 3,6 4, 34 0,65 14, 9 10 5 8 ,4 9,1 9,8 8,2 9,3 8,96 0,66 7,3 20 5 18 18 18 19 19 18 ,4 0,55 3 40 5 37 41 38 41 39 39,2 1,79 4, 6 50 5 42 46 48 50 49 47 3,16 6,7 (r: số