1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************ KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BẮT AFLATOXIN G1 CỦA CỘT SẮC KÍ ÁI LỰC MIỄN DỊCH DO VIỆN PASTEUR TP. HCM SẢN XUẤT Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ THU TRANG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BẮT AFLATOXIN G1 CỦA CỘT ÁI LỰC MIỄN DỊCH DO VIỆN PASTEUR TP. HCM SẢN XUẤT Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. NGUYỄN NGỌC HẢI NGUYỄN THỊ THU TRANG PGS.TSKH. NGUYỄN LÊ TRANG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 3 DANH MỤC CÁC BẢNG TRANG Bảng 2.1: LD 50 của AFB1 cho uống một lần duy nhất trên động vật (Ciegler, 1975).07 Bảng 2.2: Quy định hạn chế mức nhiễm aflatoxinB1 trong thực phẩm ở Pháp…… 11 Bảng 2.3: Giới hạn nhiễm độc tố vi nấm trong thực phẩm ở Việt Nam…………… 11 Bảng 2.4: Hàm lượng tối đa aflatoxin trong thức ăn hỗn hợp cho gia súc, gia cầm…11 Bảng 2.5: Các phương pháp sắc kí trong phân tích aflatoxin……………………… 15 Bảng 3.1: Bố trí các nồng độ AFG1 chuẩn để xây dựng đường chuẩn……………….27 Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm để khảo sát độ nhạy…………………………………… 27 Bảng 4.1: Kết quả xây dựng đường chuẩn AFG1 dựa trên huỳnh quang kế……… . 29 Bảng 4.2: Kết quả về độ nhạy của cột đối với AFG1…………………………… 31 Bảng 4.3: Kết quả về độ lặp lại của cột đối với AFG1 ở lượng 4 ppb………….……31 Bảng 4.4: Kết quả về độ lặp lại của cột đối với AFG1 ở lượng 19 ppb……….…… 32 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1: A. flavus (1) và A. parasiticus (2)………………………………………….03 Hình 2.2: Cấu trúc hoá học của AFB1 và AFG1…………………………………… 04 Hình 2.3 : Cấu trúc hoá học của các aflatoxin……………………………………… 05 Hình 2.4: Các sản phẩm chuyển hoá cuả AFB1…………………………………… 06 Hình 2.5: Cơ chế tác dụng của AFB1 ở mức tế bào gan (Cliford and Rees, 1967)… 08 Hình 2.6: AFB1-8,9-epoxide gắn vào DNA (Smela và ctv, 2001)………………… 09 Hình 2.7: Nguyên lí hoạt động của cột ái lực miễn dịch (IAC)………………………19 Hình 3.1: Sơ đồ hoạt động của máy quang phổ tử ngoại…………………………….23 Hình 3.2: Sơ đồ hoạt động của huỳnh quang kế…………………………………… 26 Hình 4.1: Cột IAC…………………………………………………………………….29 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1: Mối tương quan giữa lượng AFG1 và cường độ phát huỳnh quang……30 4 MỤC LỤC CHƯƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ……………………………………………………………………iii Tóm tắt …………………………………………………………………… iv Abstract……………………………………………………………………….v Mục lục ………………………………………………………………………vi Danh sách các chữ viết tắt……………………………………………… ….ix Danh sách các hình……………………………………………………………v Danh sách các bảng………………………………………………………… vi Danh sách các biểu đồ……………………………………………………… vi 1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Đặt vấn đề……………………………………………………………01 1.2 Mục đích…………………………………………………………… 02 1.3 Yêu cầu………………………………………………………………02 2. TỔNG QUAN 2.1 Đại cương về aflatoxin……………………………………………….03 2.1.1 Lịch sử phát hiện ……………………………………………….03 2.1.2 Phân loại……………………………………………………… 04 2.1.3 Tính chất hoá lí………………………………………………….05 2.1.4 Tác động sinh học……………………………………………….05 2.1.4.1 Độc tính cấp……………………………………………07 2.1.4.2 Độc tính mãn………………………………………… 08 2.1.5 Sự hiện diện trong thực phẩm………………………………… 10 2.1.6 Giới hạn về hàm lượng trong thực phẩm và thức ăn gia súc…….10 2.2 Các phương pháp phân tích aflatoxin…………………………………12 2.2.1 Phương pháp sinh học……………………………………………12 2.2.2 Phương pháp phân tích hoá lí…………………………………….12 2.2.2.1 Lấy mẫu………………………………………………….13 5 2.2.2.2 Chiết aflatoxin…………………………………………13 2.2.2.3 Làm sạch mẫu………………………………………….14 2.2.2.4 Cô đặc mẫu…………………………………………… 14 2.2.2.5 Phát hiện và xác định hàm lượng……………………….14 2.2.3 Phương pháp miễn dịch học…………………………………… 16 2.3 Sắc kí ái lực miễn dịch (IAC – ImmunoAffinity Chromatography)….17 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1 Thời gian và địa điểm………………………………………………….20 3.1.1 Thời gian…………………………………………………………20 3.1.2 Địa điểm………………………………………………………….20 3.2 Vật liệu…………………………………………………………………20 3.2.1 Đối tượng nghiên cứu…………………………………………….20 3.2.2 Hóa chất………………………………………………………… 20 3.2.3 Dụng cụ………………………………………………………… 20 3.2.4 Thiết bị……………………………………………………………21 3.3 Phương pháp nghiên cứu………………………………………………21 3.3.1 Các phương pháp phục vụ cho nghiên cứu………………………21 3.3.1.1 Quy trình tạo giá ái lực miễn dịch……………………….21 3.3.1.2 Phương pháp quang phổ kế để xác định nồng độ AFG1 23 3.3.1.3 Quy trình chiết xuất, cô đặc và tinh chế AFG1 với cột IAC 3.3.1.4 Phương pháp dùng huỳnh quang kế đo lường lượng AFT 3.3.2 Xây dựng đường chuẩn cho AFG1 bằng huỳnh quang kế……….26 3.3.3 Khảo sát các chỉ tiêu 27 3.3.3.1 Độ nhạy của cột………………………………………… 27 3.3.3.2 Độ lặp lại của cột…………………………………………28 3.4 Phương pháp xử lí số liệu…………………………………………… 28 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Cột IAC 2,5 do Viện Pasteur Tp. HCM sản xuất……………………… 29 4.2 Nồng độ dung dịch AFG1 chuẩn xác định bằng quang phổ kế……… 29 4.3 Đường chuẩn AFG1 dựa trên huỳnh quang kế…………………………29 4.4 Độ nhạy của cột……………………………………………………… 30 4.5 Độ lặp lại của cột……………………………………………………….31 6 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận……………………………………………………………….34 5.2 Đề nghị……………………………………………………………… 34 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………… 35 Phụ lục 7 LỜI CẢM TẠ Với tất cả tấm lòng, đời đời nhớ ơn công lao sinh thành, dưỡng dục cũng như luôn bên cạnh để động viên khích lệ của bố mẹ và gia đình đã dành cho con để có được như ngày hôm nay. Tôi xin chân thành cảm tạ: Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường. PGS.TSKH. Nguyễn Lê Trang đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tiến hành đề tài và hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp, cùng với lời dạy quí báu “CAN ĐẢM, SÁNG SUỐT VÀ KIÊN NHẪN” là những đức tính tối thiểu cần có của một người làm công tác khoa học. TS. Nguyễn Ngọc Hải đã hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho việc hoàn thành khoá luận tốt nghiệp của tôi. Viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh Phòng Phân tích Hoá lí – Trung tâm Phân tích thí nghiệm, Trường đại học Nông Lâm. Phòng Vi sinh, Khoa Chăn nuôi – Thú y, Trường đại học Nông Lâm. Chị Nguyễn Thị Nguyệt Thu, chị Dương Ngọc Diễm, chị Đỗ Thị Châm, chị Doãn Thị Sim đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian làm đề tài. Chị Phạm thị Thùy Trang, K26, Khoa chăn nuôi-Thú y. Các bạn bè thân yêu của lớp CNSH K27 đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. 8 CÁC CHỮ VIẾT TẮT AFB1 aflatoxin B1 AFB2 aflatoxin B2 AFB1 – BSA aflatoxin B1 – bovine serum albumin Cộng hợp aflatoxin B1 vào abumin huyết thanh bò. AFG1 aflatoxin G1 AFG2 aflatoxin G2 AFM1 aflatoxin M1 AFM2 aflatoxin M2 AFT aflatoxin AOAC Association of Official Analytical Chemists. Hiệp hội các nhà phân tích hóa học. Ctv cộng tác viên CV coefficient of variation, hệ số biến thiên ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay λ Em. Emission wave, bước sóng phát xạ λ Ex. Excited wave, bước sóng kích thích FAO Food and Agriculture Organisation of the United Nations Tổ chức nông lương thế giới HBV Hepatitis B virus, siêu vi viêm gan B HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc kí lỏng cao áp IAC Immuno - affinity chromatography, sắc kí ái lực miễn dịch. hay Immuno - affinity column, cột ái lực miễn dịch. LD 50 Lethal Dose 50, liều gây chết 50% OD 360 optical density 360 nm mật độ quang đo được ở bước sóng λ= 360nm. ppm part per million (µg/g) ppb part per billion (ng/g) RIA Radio Immuno Assay, Kĩ thuật miễn dịch phóng xạ SD Standard deviation, độ lệch chuẩn. TFA Trifluoracetic acid TLC Thin Layer Chromatography, sắc kí lớp mỏng UV Ultra Violet, bức xạ tử ngoại. 9 TÓM TẮT NGUYỄN THỊ THU TRANG, Đại học Nông Lâm, Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 9/2005. “ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BẮT AFLATOXIN G1 CỦA CỘT ÁI LỰC MIỄN DỊCH (IAC) DO VIỆN PASTEUR, TP. HCM SẢN XUẤT”. Hội đồng hướng dẫn: TS. NGUYỄN NGỌC HẢI PGS. TSKH. NGUYỄN LÊ TRANG Do tính độc rất cao nên độ nhiễm cho phép của aflatoxin trong lương thực thực phẩm là rất thấp (1 – 10 ppb). Việc sử dụng các phương pháp phân tích hoá lí gặp nhiều trở ngại do cần thiết phải sử dụng các dung môi siêu sạch. Phương pháp sử dụng kháng thể đặc hiệu với aflatoxin, cộng hợp lên gel Sepharose CL – 4B, cho phép vừa cô đặc vừa tinh chế aflatoxin trên cột ái lực miễn dịch. Cột ái lực miễn dịch (IAC – Immunoaffinity Column) có thể được sử dụng với 2 mục đích: (a) Thay thế các công đoạn chiết xuất cần thiết trước khi sử dụng các phương pháp sắc kí hóa lí (TLC, HPLC). (b) Tách chiết aflatoxin và định lượng trực tiếp theo phương pháp dùng huỳnh quang kế. Đề tài được tiến hành với mục đích xác định các đặc tính kĩ thuật của cột ái lực miễn dịch do Viện Pasteur Tp. HCM sản xuất đối với AFG1. Độ nhạy và độ lặp lại đã được xác định như sau: - Độ nhạy: 1 ppb - Độ lặp lại: CV = 7,8% với lượng 4 ng AFG1 CV = 8,03% với lượng 19 ng AFG1. 10 Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Vi nấm (Fungi) và độc tố vi nấm (Mycotoxin) là vấn đề rất quan trọng trong công tác bảo quản nông sản, thực phẩm và trong y tế. Gần 400 độc tố vi nấm được phát hiện cho đến nay [18], trong đó, aflatoxin là độc tố được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất. Aflatoxin là tên gọi một nhóm chất độc, sản phẩm của quá trình trao đổi chất của một số loài nấm mà chủ yếu là loài Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus…. Trong đó, phổ biến nhất và độc nhất là aflatoxin B 1 , G 1 , B 2 và G 2 , có thể gây bệnh ở mức vi lượng. Đối với động vật nuôi (gà, vịt, lợn…), aflatoxin gây bệnh nhiễm độc Aflatoxicosis, rất phổ biến, đặc biệt các nước nhiệt đới. Bệnh làm vật nuôi kém phát triển, sức sản xuất giảm, dễ mẫn cảm với các bệnh truyền nhiễm, bị ung thư và thậm chí bị chết. Do đó, hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi bị ảnh hưởng nghiêm trọng, chịu nhiều tổn thất lớn. Đối với người, đáng chú ý là khả năng gây ung thư gan và dị tật thai do aflatoxin nhiễm từ sữa mẹ truyền cho con. Aflatoxin có ảnh hưởng nghiêm trọng như vậy nhưng lại rất khó để loại bỏ vì aflatoxin hiện diện ở khắp nơi trong môi trường lại khó bị phân huỷ bởi nhiệt. Do vậy, việc nghiên cứu tìm ra các phương pháp phân tích tối ưu nhằm phát hiện aflatoxin trong thực phẩm và nguyên liệu thực phẩm là điều cần thiết. Quy trình phân tích aflatoxin thường phải qua nhiều giai đoạn chiết xuất, làm sạch, cô đặc, cùng với việc định tính và định lượng aflatoxin bằng các phương pháp như: sắc kí cột, sắc kí lớp mỏng (TLC), sắc kí lỏng cao áp (HPLC) dễ bị sai số do phải qua nhiều thao tác, tăng thất thoát trong các công đoạn. Trước những khó khăn trên, sắc kí ái lực miễn dịch (immuno-affinity chromatography-IAC) ra đời, sử dụng trong công đoạn tinh sạch và cô đặc mẫu đồng thời, dựa trên nguyên lí gắn kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, tạo khả năng chọn lọc cao mà các phương pháp khác không có được; quy trình chiết và tinh chế aflatoxin của phương pháp IAC lại đơn giản đã đáp ứng được nhu cầu về độ tin cậy cao trong các kết quả phân tích. . BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BẮT AFLATOXIN G1 CỦA CỘT ÁI LỰC MIỄN DỊCH DO VIỆN PASTEUR. AFB1 aflatoxin B1 AFB2 aflatoxin B2 AFB1 – BSA aflatoxin B1 – bovine serum albumin Cộng hợp aflatoxin B1 vào abumin huyết thanh bò. AFG1 aflatoxin G1 AFG2 aflatoxin G2 AFM1 aflatoxin M1. của cột ái lực miễn dịch do Viện Pasteur Tp. HCM sản xuất đối với AFG1. Độ nhạy và độ lặp lại đã được xác định như sau: - Độ nhạy: 1 ppb - Độ lặp lại: CV = 7,8% với lượng 4 ng AFG1 CV =