NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẬP CHỐNG CHỊU HẠN HÁN CỦA KHOAI TÂY

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Vũ Thị Hoa Phƣợng NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TẬP CHỐNG CHỊU HẠN HÁN CỦA KHOAI TÂY (Solanum tuberosum L.) Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2015 Công trình hoàn thành tại: Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Quỳnh Mai Phản biện 1: TS Lê Thị Nguyên Bình Phản biện 2: TS Phạm Thị Lý Thu Luận văn bảo vệ trước Hội đồng chấm luận văn thạc sĩ họp tại: Khoa Sinh học - Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên Vào hồi 14 00 ngày tháng năm 2016 Có thể tìm hiểu luận văn tại: - Trung tâm thư viện Đại học Quốc gia Hà Nội MỞ ĐẦU Khoai tây (Solanum tuberosum L.) thành phần quan trọng hệ thống lương thực giới (FAO) Ở Việt Nam, nghiên cứu khoai tây tập trung chủ yếu vào việc khảo nghiệm, lai giống, tạo củ nhỏ số bệnh chưa có nghiên cứu chế tập chống chịu loại trước điều kiện phi sinh học Trên sở đó, lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu khả tập chống chịu hạn hán khoai tây (Solanum tuberosum L.)” Các nghiên cứu luận văn nằm đề tài “Nghiên cứu mối liên quan khả tập chống chịu khoai tây trước yếu tố nhiệt độ cao, hạn hán, độ mặn cao” Quỹ Phát triển Khoa học Công nghệ Quốc gia (NAFOSTED) tài trợ với mã số 106.06-2012.14 Các mục tiêu đặt cho đề tài sau: - Đánh giá khả tập chống chịu hạn khoai tây giống - Xác định cường độ hạn giai đoạn tập chống chịu cho hiệu nâng cao khả chống chịu hạn khoai tây - Đánh giá thay đổi hàm lượng proline, chất điều hòa thẩm thấu tế bào coi thị cho trình đáp ứng bất lợi áp suất thẩm thấu thực vật, khoai tây qua tập chống chịu hạn - Xác định biểu số gen yếu tố phiên mã khoai tây tương đồng với gen liên quan đến khả đáp ứng với hạn A thaliana Chƣơng 1- TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung khoai tây 1.1.1 Nguồn gốc lịch sử Cây khoai tây (Solanum tuberosum L.) thân thảo, có củ thuộc họ cà, có nguồn gốc vùng cao nguyên thuộc dãy núi Andes (Nam Mỹ) độ cao 2000-5000m 1.1.2 Phân loại học Phân loại học khoai tây hệ thống học thực vật (USDA, NRCS, 2010): Giới: Plantae (plants) Ngành: Magnoliophyta (flowering plants) Lớp: Magnoliopsida (dicotyledons) Bộ: Solanales Họ: Solanaceae Chi: Solanum L Loài: Solanum tuberosum L 1.1.3 Đặc điểm khoai tây Thân khoai tây hệ thống gồm thân, tia củ củ Lá khoai tây kép lông chim, không đối xứng Hoa khoai tây mọc thành chùm, hoa lưỡng tính Khoai tây tự thụ phấn có trường hợp giao phấn Sau thời kỳ hoa, vài loài kết 1.1.4 Vai trò khoai tây Khoai tây thực phẩm cung cấp lượng nguồn dinh dưỡng có giá trị Ngoài việc dùng khoai tây làm lương thực thực phẩm, nước phát triển sử dụng khoai tây làm thức ăn cho gia súc Bên cạnh đó, khoai tây dùng nhiều công nghiệp sản xuất axit hữu axit lactic, axit xitric; dung môi hữu ethanol, butanol, xeton, … 1.2 Hạn đáp ứng thực vật cạn trƣớc điều kiện hạn Ngày nay, biến đổi khí hậu toàn cầu, tượng hạn, mặn, úng, nóng, lạnh, … (các yếu tố cực đoan phi sinh học, abiotic stress) xảy ngày nhiều Trong đó, hạn yếu tố môi trường ảnh hưởng lớn tới sinh trưởng suất trồng 1.2.1 Đặc điểm thích nghi thực vật chịu hạn Tính chịu hạn thực vật cạn hạn sinh có chất di truyền, thể thích nghi hình thái sinh lý 1.2.2 Ảnh hưởng hạn đến sinh trưởng phát triển thực vật Ảnh hưởng hạn đến sinh trưởng hấp thu nước Đáp ứng thực vật điều kiện bất lợi gây hạn ngừng sinh trưởng Sự hạn chế sinh trưởng xảy chồi, rễ Trong điều kiện hạn, phân tử carbohydrate cung cấp cho trình sinh trưởng điều kiện bình thường dùng cho sinh trưởng rễ để tổng hợp chất điều chỉnh thẩm thấu Ảnh hưởng hạn đến quang hợp Sự thiếu hụt nước làm tăng cường tổng hợp ABA Sự hạn chế carbon dioxide kéo dài thời gian đóng khí khổng dẫn đến tích lũy hợp chất làm giảm khả vận chuyển electron, làm giảm phân tử oxy tăng cường dạng ROS Các phân tử bị oxy hóa ROS bị biến đổi cấu trúc chế tổng hợp, gây rối loạn phản ứng sinh lý, sinh hóa nội bào, dẫn đến sai hỏng chức năng, chí gây chết tế bào Ảnh hưởng hạn đến hô hấp nội bào Trong điều kiện hạn, trình mà chúng sửa dụng sản phẩm hô hấp bị ảnh hưởng dẫn đến tăng cường hô hấp Ảnh hưởng hạn đến hormone Khi thiếu nước, ABA tổng hợp rễ vận chuyển lên làm khí khổng đóng lại cản trở trình sinh trưởng thực vật Bên cạnh tăng cường hàm lượng ABA, hàm lượng auxin có biến đổi thực vật chống chịu với hạn Sự giảm nhanh chóng hàm lượng zeatin gibberellin nội sinh xảy ngô để đối phó với hạn Bên cạnh đó, hàm lượng khả hoạt động cytokinin giảm điều kiện hạn Brassinosteroid (BR) báo cáo có khả bảo vệ thực vật chống lại nhiều yếu tố bất lợi phi sinh học 1.2.3 Đáp ứng hạn thực vật Thực vật đáp ứng với điều kiện bất lợi từ môi trường qua đường: phụ thuộc ABA không phụ thuộc ABA Các tín hiệu dẫn truyền đến nhân gây tăng cường biểu gen mã hóa yếu tố phiên mã Các yếu tố phiên mã gây tăng cường biểu gen liên quan đến tính chống chịu Các đáp ứng bị điều kiện bất lợi 1.3 Ảnh hƣởng môi trƣờng hạn đến khoai tây Hạn thường tác động mạnh giai đoạn: sinh trưởng sinh dưỡng, phình to củ chín.Đã có nghiên cứu chứng minh đáp ứng hạn khoai tây có liên quan đến biểu gen Khoai tây tăng cường biểu gen StMYB1R-1 cho khả chống chịu cao với hạn mà đồng thời lại không ảnh hưởng tới tính trạng nông học khác Trong điều hạn khoai tây tăng cường biểu số gen mã hóa yếu tố phiên mã họ NAC 1.4 Tính tập chống chịu thực vật Khả tập chống chịu (acclimation) với yếu tố bất lợi từ môi trường thực vật cho phép thực vật tăng cường tính chống chịu với điều kiện bất lợi ngưỡng lớn sau giai đoạn tiếp xúc với điều kiện bất lợi ngưỡng nhỏ vừa Hình 1.3 Sơ đồ đơn giản trình nhận, truyền tín hiệu gây đáp ứng tập chống chịu Cơ chế tập chống chịu biết đến bao gồm chế nhận tín hiệu từ biểu bất lợi từ môi trường, tiếp đến trình truyền tín hiệu từ “cảm biến” vào nhân Trong nhân, số gen đặc hiệu liên quan đến việc đáp ứng lại với yếu tố bất lợi hoạt hóa protein biểu đáp ứng thích hợp (Hình 1.3) Các đáp ứng đảm bảo tái lập cân nội môi tế bào, bảo vệ chức màng sinh chất protein nhằm chống chịu lại điều kiện bất lợi Rất nhiều gen hoạt hóa theo chiều hướng giữ cân trao đổi nước ion tế bào, bảo vệ chức chaperone, giảm oxi hóa bảo vệ áp suất thẩm thấu Riêng chế cân thẩm thấu mô, tế bào, có xu hướng tăng sinh proline số loại đường galactinol, glucose, fructose, sucrose, raffinose chất biết đến chất bảo vệ thẩm thấu thực vật cần chống lại bất lợi từ môi trường Những hoạt động đáp ứng qua gen biểu thực vật đa phần điều hòa qua yếu tố phiên mã Các chế liên quan đến trình đáp ứng thực vật với yếu tố bất lợi từ môi trường từ lâu trở thành tâm điểm nghiên cứu sinh học nói chung thực vật nói riêng [21] Đề tài “Nghiên cứu tính tập chống chịu hạn hán khoai tây (Solanum tuberosum L.)” thực theo định hướng mong muốn góp phần tìm hiểu thêm sức sống thực vật biến đổi môi trường Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 VẬT LIỆU 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu tính tập chống chịu hạn tiến hành khoai tây có nguồn gốc từ hạt, giống HH7 2.1.2 Hóa chất 2.1.3 Thiết bị 2.2 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Phương pháp vào mẫu, nuôi cấy in vitro tạo tập chống chịu Hạt khoai tây giống HH7 khử trùng gieo môi trường khoáng Murashige & Skoog (MS, 1962), có bổ sung 30g/l sucrose, 7g/l agar sorbitol với hàm lượng khác Các nồng độ sorbitol sử dụng là: mM; 50 mM; 100 mM; 200 mM Tỷ lệ nảy mầm hạt đánh giá hạt nảy mầm môi trường có bổ sung sorbitol coi qua giai đoạn tập chống chịu 2.2.2 Phương pháp cấy chuyển mẫu đánh giá số sinh lý Sau 30 ngày gieo hạt, cắt lấy phần thân có chiều cao 1,5 cm mang chuyển sang môi trường có nồng độ sorbitol tương đương với giai đoạn nảy mầm cao (Hình 2.2) Hình 2.2 Sơ đồ cấy chuyển mẫu sau gieo môi trường tập chống chịu Sau - tuần, tiến hành đánh giá khả tập chống chịu cách so sánh mẫu qua tập chống chịu mẫu chưa qua tập chống chịu nhóm TN, thông qua số số: hệ số nhân chồi, chiều cao chồi, số lá, số rễ, trọng lượng tươi, trọng lượng khô, hàm lượng Chl hàm lượng proline Hệ số nhân chồi Hệ số nhân chồi = 𝑇ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑐ℎồ𝑖 𝑐ủ𝑎 𝑚ẫ𝑢 𝑆ố 𝑚ẫ𝑢 𝑡𝑟𝑜𝑛𝑔 𝑚ô𝑖 𝑡𝑟ườ𝑛𝑔 Chiều cao chồi Chiều cao chồi = 𝑇ổ𝑛𝑔 𝑐ℎ𝑖ề𝑢 𝑐𝑎𝑜 𝑐á𝑐 𝑐ℎồ𝑖 𝑇ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑐ℎồ𝑖 𝑐ủ𝑎 𝑚ẫ𝑢 (cm) Số Số = 𝑇ổ𝑛𝑔 𝑠ố𝑙á 𝑇ổ𝑛𝑔 𝑠ố 𝑐ℎồ𝑖 Số rễ Số rễ trung bình= Tổ ng sốrễ Sốch i ch ính Trọng lượng tươi trọng lượng khô Trọng lượng tươi = Trọng lượng khô = Tổ ng tr ọ ng lượ ng tươi củ a mẫ u Tổ ng sốmẫ u Tổ ng tr ọ ng lượ ng kh ô củ a mẫ u Tổ ng sốmẫ u 2.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng chlorophyll Hàm lượng Chl xác định dựa theo phương pháp của Robert J Porra [60] Hàm lượng Chl tính toán theo công thức: Chla (µg/ml) = [12.7 × (A664) – 2.69 × (A646)] × hệ số pha loãng Chlb (µg/ml) = [22.9 × (A646) – 4.68 × (A664)] × hệ số pha loãng 2.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng proline mẫu Hàm lượng proline mẫu xác định phương pháp so màu (Bates cs., 1973) Hàm lượng proline mẫu tính toán cách so sánh với đường chuẩn Độ hấp thụ 520 nm 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 -0.1 y = 0.007x - 0.001 R² = 0.993 A520 Linear (A520) 20 40 60 80 100 Nồng độ proline (mM) 120 Hình 2.3 Đường chuẩn proline Công thức xác định nồng độ proline là: x = (A520 + 0,001) / 0,007 (mM) Nồng độ proline mM quy hàm lượng µg/mg theo công thức: Hàm lượng proline (µg/mg) = 𝑋∗𝑉∗𝐻𝑆𝑃𝐿 𝑚 Trong đó: x: nồng độ proline (mM) HSPL: hệ số pha loãng V: thể tích dịch chiết proline m: khối lượng mẫu tươi (ml) (mg) 2.2.5 Xác định biểu số gen mã hóa cho yếu tố phiên mã khoai tây (Solanum tuberosum L.) tương đồng với gen liên quan đến khả tập chống chịu Arabidopsis thaliana Kết đánh giá khả tập chống chịu thông qua số nuôi cấy mô, hàm lượng Chl proline cho biết nồng độ sorbitol môi trường 50 mM mang lại hiệu tập chống chịu hạn cao cho khoai tây HH7 Tiến hành xác định biểu số gen mã hóa yếu tố phiên mã khoai tây thu từ môi trường MS có bổ sung 50 mM sorbitol (mẫu TN) môi trường sorbitol ( mẫu ĐC) 2.2.5.1.Thu mẫu Chồi khoai tây in vitro giống HH7 cấy chuyển đồng thời môi trường MS sorbitol môi trường MS có bổ sung 50 mM sorbitol Thu mẫu 10 mốc thời gian: 0h, 1h, 2h, 4h, 6h, 8h, 12h, 24h, 72h 120h 2.2.5.2.Tách RNA tổng số RNA tổng số tách TRIzol RNA pha nước hút sau tủa isopropanol NaCl 2M, li tâm rửa lại ethalnol 70% sau thu hồi RNA tinh khiết 2.2.5.3.Kiểm tra, định lượng xác định độ tinh RNA tổng số RNA kiểm tra sơ kỹ thuật điện di gel agarose Hàm lượng RNA tổng số xác định máy đo quang phổ định lượng chất lượng đánh giá sơ qua đường cong hấp thụ Các mẫu RNA có giá trị A260/280 khoảng 2,0 giá trị A260/230 > 1,8 mẫu RNA đạt tiêu chuẩn 2.2.5.4.Xử lý DNA Để đảm bảo không lẫn DNA hệ gen cDNA sau này, mẫu xử lý DNAse 2.2.5.5.Tổng hợp cDNA cDNA tổng hợp theo kit The Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 2.2.5.6.Kiểm tra chất lượng cDNA Chất lượng cDNA kiểm tra qPCR Cặp mồi sử dụng để kiểm tra chất lượng cDNA cặp mồi GAPDH 3’ (G3) GAPDH 5’ (G5) 2.2.5.7.Chọn gen đích 2.2.5.8.Thiết kế mồi 2.2.5.9.Xác định tương quan mức độ biểu Gen tham chiếu gen đích chọn tiến hành qPCR với cặp mồi tương ứng 2.2.5.10 Xử lý số liệu Sử dụng phương pháp 2-ΔΔCt Livak cs 2001 để xác định tương quan mức độ biểu mẫu TN mẫu ĐC CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hƣởng sorbitol đến tỷ lệ nảy mầm hạt khoai tây Hồng Hà Kết cho thấy giống khoai tây nghiên cứu chịu ảnh hưởng rõ rệt điều kiện hạn Khả nảy mầm hạt giảm nồng độ sorbitol tăng (Hình 3.1) Hình 3.1 Tỷ lệ nảy mầm hạt khoai tây HH7 sau 30 ngày gieo môi trường có bổ sung sorbitol 10 Hình 3.2 Cây khoai tây đĩa thạch sau 30 ngày gieo hạt Quan sát khoai tây sau 30 ngày gieo hạt, ta thấy môi trường có nồng độ sorbitol cao nảy mầm chậm có thân ngắn (hình 3.2) 3.2 Đánh giá số nuôi cấy mô sau giai đoạn tập chống chịu 3.2.1 Hệ số nhân chồi Hệ số nhân chồi chịu ảnh hưởng không nhỏ hàm lượng sorbitol tăng cao môi trường nuôi cấy Các mẫu chưa qua tập chống chịu chuyển sang môi trường có nồng độ sorbitol tăng có hệ số nhân chồi giảm dần Các mẫu qua tập chống chịu khả nhân chồi nuôi cấy chuyển sang môi trường tiếp tục trì mức độ hạn nhân tạo nâng cao mức hạn 11 tuần tuần Hệ số nhân chồi (lần) Nồng độ sorbitol công thức chuyển môi trƣờng (mM) Hình 3.3: Hệ số nhân chồi khoai tây HH7 môi trường có nồng độ sorbitol khác sau tập chống chịu hạn giai đoạn nảy mầm 3.2.2 Chiều cao chồi Chiều cao chồi trung bình (cm) 12 tuần 10 tuần Nồng độ sorbitol công thức chuyển môi trƣờng (mM) Hình 3.4 Chiều cao chồi khoai tây HH7 môi trường có nồng độ sorbitol khác sau tập chống chịu hạn giai đoạn nảy mầm Ở mẫu chưa qua tập chống chịu, chiều cao chồi trung bình chịu ảnh hưởng lớn hàm lượng sorbitol môi trường Những mẫu qua tập 12 chống chịu môi trường chứa sorbitol rõ phát triển chiều cao chồi Nhìn chung nhận thấy công thức TN có hệ số nhân tương đối cao chiều cao chồi thấp ngược lại Điều thể sinh khối mẫu in vitro có giới hạn định điều kiện hạn Việc đánh giá khối lượng mẫu cho thông tin quan trọng sinh trưởng khoai tây điều kiện hạn nhân tạo 3.2.3 Số Trong môi trường sorbitol, số trung bình mẫu đạt giá trị thấp sau tuần tuần (Hình 3.5) Ở mẫu qua tập chống chịu, công thức 50-50, 100-100, 100-200 200-200, cho số trung bình lớn so với mẫu chưa qua tập chống chịu cấy chuyển sang môi trường có nồng độ sorbitol tương đương cao sau tuần tuần Tuy nhiên khác biệt tương đối nhỏ Hình 3.5 Số trung bình khoai tây HH7 môi trường có nồng độ sorbitol khác sau tập chống chịu hạn giai đoạn nảy mầm 3.2.4 Số rễ 13 4.5 tuần Số rễ trung bình (rễ) tuần 3.5 2.5 1.5 0.5 Nồng độ sorbitol công thức chuyển môi trƣờng (mM) Hình 3.6 Số rễ trung bình khoai tây HH7 môi trường có nồng độ sorbitol khác sau tập chống chịu hạn giai đoạn nảy mầm Biểu đồ số rễ mẫu chồi nuôi cấy cho thấy có xu hướng tăng hàm lượng sorbitol môi trường tăng mẫu qua tập chống chịu so với mẫu chưa qua tập chống chịu môi trường nuôi cấy Đặc biệt là, mẫu qua tập chống chịu ngưỡng 50 mM 100 mM sorbitol công thức chuyển môi trường 50-50 100-100 có số rễ trung bình cao mẫu điều kiện môi trường không bị hạn 3.2.5 Trọng lượng tươi trọng lượng khô 14 Hình 3.7 Trọng lượng tươi trọng lượng khô chồi khoai tây HH7 môi trường có nồng độ sorbitol khác sau tập chống chịu hạn giai đoạn nảy mầm (đánh giá sau tuần nuôi cấy) Trọng lượng tươi khoai tây HH7 chịu ảnh hưởng lớn điều kiện hạn Khi chuyển nảy mầm sau 30 ngày sang môi trường có chứa sorbitol, hàm lượng sorbitol cao trọng lượng tươi mẫu giảm Trong trọng lượng khô có giảm chuyển sang điều kiện hạn tăng cao mức giảm tương đối so với biến động trọng lượng tươi (Hình 3.7) Kết cho thấy điều kiện hạn nuôi cấy làm giảm nhanh khả hấp thu nước khoai tây in vitro không làm giảm khả tích lũy chất khô Và, chồi khoai tây qua giai đoạn tập chống chịu nảy mầm khả tích lũy chất khô chúng cải thiện đáng kể 15 3.3 Hàm lƣợng chlorophyll khoai tây HH7 qua giai đoạn tập chống chịu Chla Chlb Hàm lƣợng Chl (µg/mg) 3.5 2.5 1.5 0.5 Nồng độ sorbitol công thức chuyển môi trƣờng (mM) Hình 3.8 Hàm lượng chlorophyll khoai tây HH7 môi trường có nồng độ sorbitol khác sau tập chống chịu hạn giai đoạn nảy mầm (đánh giá sau tuần nuôi cấy) Kết nghiên cứu cho thấy, mẫu qua tập chống chịu có hàm lượng Chl cao so với mẫu chưa qua tập chống chịu cao so với môi trường đối chứng 0-0 Đặc biệt môi trường tiếp xúc hạn ngưỡng 50 mM sorbitol cho thấy tăng hàm lượng Chl a, Chlb tăng tỷ lệ hàm lượng Chla/ Chlb 16 3.4 Hàm lƣợng proline Hàm lƣợng proline (µg/mg) 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 Nồng độ sorbitol công thức chuyển môi trƣờng (mM) Hình 3.9 Hàm lượng proline thân khoai tây HH7 môi trường có nồng độ sorbitol khác sau tập chống chịu hạn giai đoạn nảy mầm (đánh giá sau tuần) Xét tính tập chống chịu, hầu hết mẫu qua tập chống chịu có hàm lượng proline cao so với mẫu chưa qua tập chống chịu Hàm lượng proline thể rõ ràng vai trò giai đoạn tập chống chịu với độ hạn thấp (50mM sorbitol) vừa (100mM sorbitol) khoai tây gia tăng hàm lượng proline tất các điều kiện hạn ngang mức cao 17 3.5 Mức độ biểu số gen yếu tố phiên mã liên quan đến tính chịu hạn khoai tây 3.5.1 Hàm lượng độ tinh RNA tổng số Bảng 3.1 Hàm lượng RNA tổng số giá trị đánh giá mức độ tinh Mẫu Hàm lƣợng (ng/µl) A260/280 A260/230 2963,7 1,9 1,99 1h0 854,1 2,03 2,32 1h50 1158,67 2,01 2,22 2h0 1075,19 2,03 2,04 2h50 1226,52 2,01 1,82 4h0 1260,5 2,05 2,13 4h50 1193,56 2,03 2,19 6h0 544,03 1,5 6h50 985,77 2,03 2,14 8h0 837,12 2,03 1,86 8h50 916,73 2,04 2,16 12h0 1286,44 2,17 12h50 1870,35 2,22 24h0 1177,5 2,02 2,3 24h50 1125 2,03 2,29 72h0 557,4 2,04 2,06 72h50 700,48 2,06 1,86 120h0 1407,28 2,02 2,2 120h50 568,8 2,02 1,99 RNA tổng số thu hầu hết đạt chất lượng tốt ngoại trừ mẫu 6h0 có số A260/230 thấp 18 3.5.2 Kết kiểm tra chất lượng cDNA Bảng 3.2 Kết kiểm tra chất lượng cDNA Giá trị Ct Mẫu Mồi GAPDH 3’ Mồi GAPDH 5’ ΔCt 24,54 25 0,46 1h0 16,89 17,51 0,62 1h50 25,67 24,34 1,33 2h0 23,82 23,09 0,73 2h50 19,77 20,43 0,66 4h0 15,72 16,41 0,69 4h50 18,36 19,54 1,18 6h0 22,89 22,1 0,79 6h50 21,88 20,55 1,33 8h0 21,77 21,06 0,71 8h50 22,71 21,98 0,73 12h0 22 20,9 1,1 12h50 21,22 20,17 1,05 24h0 16,09 16,54 0,45 24h50 16,65 16,87 0,22 72h0 24,58 23,92 0,66 72h50 24,63 23,26 1,37 120h0 24,03 23,28 0,75 120h50 26,8 25,37 1,43 3.5.3 Sự biểu gen PGSC0003DMG400014309 (P1) Trong 12h đầu, mức độ biểu gen P1 mẫu TN có dao động lớn so với môi trường ĐC Mẫu cấy môi trường 50 mM sorbitol có biểu mạnh mẫu ĐC mốc thời gian: 1h, 4h, 8h, 24h 72h lại có biểu mốc: 2h, 6h, 12h 120h Sự tăng cường biểu gen P1 khoai tây HH7 tập chống chịu hạn điều kiện 50mM sorbitol 19 in vitro so với mẫu môi trường sorbitol có dao động tương đối lớn với lần gia tăng biểu gen lại cao so với lần tăng trước Tƣơng quan mức độ biểu (lần) 20 18 16 14 12 10 0 20 40 60 Thời gian (h) 80 100 120 Hình 3.10 Biểu đồ tương quan mức độ biểu mẫu khoai tây xử lý hạn mẫu đối chứng gen PGSC0003DMG400014309 (P1), tương đồng với gen mã hóa yếu tố phiên mã DREB1A Arabidopsis thaliana 3.5.4 Sự biểu gen PGSC0003DMP400026903 (P2) Sự biểu gen PGSC0003DMP400026903 (gen P2) khoai tây giống HH7 nghiên cứu có chiều hướng biến động tương tự gen P1 (Hình 3.11) Tuy nhiên thấy rõ tương quan mức độ biểu gen P2 thấp so với gen P1 mốc thời gian P2 có biểu mẫu tập chống chịu 50 mM sorbitol so với mẫu đối chứng cao 6h Sau 72h, tương quan mức độ biểu có cao lên không vượt mức 6h 20 Tƣơng quan mức độ biểu (lần) 20 18 16 14 12 10 0 20 40 60 80 100 120 Thời gian (h) Hình 3.11 Biểu đồ tương quan mức độ biểu mẫu khoai tây xử lý hạn mẫu đối chứng của gen PGSC0003DMP400026903 (P2), tương đồng với gen mã hóa yếu tố phiên mã RD26 Arabidopsis thaliana 3.5.5 Sự biểu gen PGSC0003DMT400045091 (P3) Gen P3 mã hóa cho protein thuộc lớp thứ họ AP2/ERF protein, tương đồng với gen At4G13040 A thaliana Ở A thaliana, At4G13040 có chức điều khiển tích lũy salicylic acid, chống lại bệnh liên quan đến Tƣơng quan mức độ biểu (lần) vi khuẩn Mức độ tương đồng gen P3 At4G13040 100% 20 18 16 14 12 10 0 20 40 60 80 100 120 Thời gian (h) Hình 3.12 Biểu đồ tương quan mức độ biểu gen PGSC0003DMT400045091 (Gen P3), tương đồng với gen yếu tố phiên mã At4g13040 Arabidopsis thaliana 21 Từ biểu đồ, nhận thấy mức độ biểu gen P3 mẫu TN thấp so với gen nghiên cứu Chiều hướng biến động giá trị tương quan mức độ biểu gen P3 tương tự với gen P2 Trong gen nghiên cứu, so sánh tương quan khoai tây giai đoạn tập chống chịu trước điều kiện có sorbitol gây hạn mức 50mM với mẫu nuôi cấy môi trường đối chứng gen P1 có mức độ biểu mạnh mẽ cả, tiếp đến gen P2 thấp gen P3 Điều khẳng định vai trò yếu tố phiên mã DREB1A chế chống chịu hạn thực vật nói chung khoai tây nói riêng 22 KẾT LUẬN Tỷ lệ nảy mầm hạt khoai tây (Solanum tuberosum L.) giống Hồng Hà giảm nồng độ sorbitol môi trường tăng Sự tăng lên số lượng rễ, trọng lượng tươi, trọng lượng khô, hàm lượng chlorophyll, hàm lượng proline mẫu nảy mầm môi trường hạn so với mẫu chưa tiếp xúc hạn bước đầu cho thấy khoai tây (Solanum tuberosum L.) giống Hồng Hà có khả tập chống chịu hạn Hàm lượng sorbitol 50 mM môi trường mang lại hiệu tập chống chịu tương đối cao cho khoai tây (Solanum tuberosum L.) giống Hồng Hà Với nồng độ 50 mM sorbitol môi trường làm tăng cường đáng kể biểu gen mã hóa yếu tố phiên mã PGSC0003DMG400014309 khoai tây (Solanum tuberosum L.) giống Hồng Hà (tương đồng với gen DREB1A) KIẾN NGHỊ Nghiên cứu ảnh hưởng khả tập chống chịu hạn đến khả tập chống chịu số yếu tố bất lợi khác khoai tây (Solanum tuberosum L.) giống HH7 Nghiên cứu tính tập chống chịu hạn số giống khoai tây (Solanum tuberosum L.) khác 23 [...]... cường đáng kể biểu hiện của gen mã hóa yếu tố phiên mã PGSC0003DMG400014309 ở khoai tây (Solanum tuberosum L.) giống Hồng Hà 7 (tương đồng với gen DREB1A) KIẾN NGHỊ 1 Nghiên cứu ảnh hưởng khả năng tập chống chịu hạn đến khả năng tập chống chịu một số yếu tố bất lợi khác của khoai tây (Solanum tuberosum L.) giống HH7 2 Nghiên cứu tính tập chống chịu hạn của một số giống khoai tây (Solanum tuberosum L.)... proline trong thân và lá khoai tây HH7 trên môi trường có các nồng độ sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm (đánh giá sau 4 tuần) Xét tính tập chống chịu, hầu hết những mẫu đã qua tập chống chịu đều có hàm lượng proline cao hơn so với những mẫu chưa qua tập chống chịu Hàm lượng proline đã thể hiện rất rõ ràng vai trò của giai đoạn tập chống chịu với độ hạn thấp (50mM sorbitol)... pháp 2-ΔΔCt của Livak và cs 2001 để xác định tương quan mức độ biểu hiện giữa mẫu TN và mẫu ĐC 9 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Ảnh hƣởng của sorbitol đến tỷ lệ nảy mầm của hạt khoai tây Hồng Hà 7 Kết quả cho thấy giống khoai tây đang nghiên cứu chịu ảnh hưởng rõ rệt của điều kiện hạn Khả năng nảy mầm của hạt giảm khi nồng độ sorbitol tăng (Hình 3.1) Hình 3.1 Tỷ lệ nảy mầm của hạt khoai tây HH7 sau... Số rễ trung bình của khoai tây HH7 trên môi trường có các nồng độ sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm Biểu đồ về số rễ của mẫu chồi nuôi cấy cho thấy có xu hướng tăng khi hàm lượng sorbitol trong môi trường tăng ở những mẫu đã qua tập chống chịu so với những mẫu chưa qua tập chống chịu trong cùng môi trường nuôi cấy Đặc biệt là, những mẫu đã qua tập chống chịu ở ngưỡng 50... tươi, trọng lượng khô, hàm lượng chlorophyll, hàm lượng proline của mẫu đã nảy mầm trong môi trường hạn so với các mẫu chưa tiếp xúc hạn bước đầu cho thấy cây con khoai tây (Solanum tuberosum L.) giống Hồng Hà 7 có khả năng tập chống chịu hạn 3 Hàm lượng sorbitol 50 mM trong môi trường mang lại hiệu quả tập chống chịu tương đối cao cho khoai tây (Solanum tuberosum L.) giống Hồng Hà 7 4 Với nồng độ 50 mM... tươi của mẫu càng giảm Trong khi đó trọng lượng khô có giảm khi chuyển cây sang các điều kiện hạn tăng cao nhưng mức giảm là tương đối ít so với biến động của trọng lượng tươi (Hình 3.7) Kết quả cho thấy điều kiện hạn trong nuôi cấy đã làm giảm nhanh khả năng hấp thu nước của khoai tây in vitro nhưng không làm giảm khả năng tích lũy chất khô Và, nếu các chồi khoai tây đã qua giai đoạn tập chống chịu. .. trong giai đoạn tập chống chịu trước điều kiện có sorbitol gây hạn mức 50mM với mẫu nuôi cấy trên môi trường đối chứng thì gen P1 có mức độ biểu hiện mạnh mẽ hơn cả, tiếp đến là gen P2 và thấp nhất là gen P3 Điều này khẳng định vai trò của yếu tố phiên mã DREB1A trong cơ chế chống chịu hạn của thực vật nói chung và của khoai tây nói riêng 22 KẾT LUẬN 1 Tỷ lệ nảy mầm của hạt khoai tây (Solanum tuberosum... nảy mầm thì khả năng tích lũy chất khô của chúng được cải thiện đáng kể 15 3.3 Hàm lƣợng chlorophyll ở khoai tây HH7 đã qua giai đoạn tập chống chịu 4 Chla Chlb Hàm lƣợng Chl (µg/mg) 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 Nồng độ sorbitol trong các công thức chuyển môi trƣờng (mM) Hình 3.8 Hàm lượng chlorophyll trong lá khoai tây HH7 trên môi trường có các nồng độ sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai... Hệ số nhân chồi của khoai tây HH7 trên môi trường có các nồng độ sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm 3.2.2 Chiều cao chồi Chiều cao chồi trung bình (cm) 12 4 tuần 10 6 tuần 8 6 4 2 0 Nồng độ sorbitol trong các công thức chuyển môi trƣờng (mM) Hình 3.4 Chiều cao chồi của khoai tây HH7 trên môi trường có các nồng độ sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn... hơn cả mẫu trong điều kiện môi trường không bị hạn 3.2.5 Trọng lượng tươi và trọng lượng khô 14 Hình 3.7 Trọng lượng tươi và trọng lượng khô của chồi khoai tây HH7 trên môi trường có các nồng độ sorbitol khác nhau sau khi tập chống chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm (đánh giá sau 6 tuần nuôi cấy) Trọng lượng tươi của khoai tây HH7 chịu ảnh hưởng lớn bởi điều kiện hạn Khi chuyển cây con nảy mầm sau 30 ngày sang