Quy trình sản xuất enzyme amylase và ứng dụng trong công nghệ thực phẩm (sản xuất mật tinh bột).

Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật. Các enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước:RR’ + HOH RH + R’OHCó 6 loại enzyme được xếp vào 2 nhóm: Endoamylase (enzyme nội bào) và Exoamylase (enzyme ngoại bào).Endoamylase gồm có amylase và nhóm enzyme khử nhánh. Nhóm enzyme khử nhánh này được chia làm 2 loại: Khử trực tiếp là Pullunase (hay còn gọi là dextrin 6glucosidase) và khử gián tiếp là Transglucosylase (hay oligo1,6 glucosidase) và Maylo1,6glucosidase. Các enzyme này thủy phân liên kết bên trong các chuỗi polysaccharide.Exoamylase gồm có amylase và amylase. Đây là những enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide.Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen: Tinh bột: là nhóm carbohydrate ở thực vật có chủ yếu trong các loại củ (như khoai lang, khoai tây,..), trong các hạt ngũ cốc, các loại hạt có công thức tổng quát là (C6H12O6)n. Tinh bột từ mọi nguồn khác nhau đều có cấu tạo từ amylo và amylopectin. Các loại tinh bột đều có 2030% amylo và 7080% amylopectin. Trong thực vật, tinh bột được xem là chất dự trữ năng lượng quan trọng.Dưới tác dụng của enzyme amylase, tinh bột bị thủy phân do các liên kết glucoside bị phân cắt. Sự thủy phân tinh bột bởi enzyme amylase xảy ra theo 2 mức độ: dịch hóa và đường hóa. Kết quả của sự dịch hóa là tạo ra sản phẩm trung gian dextrin và khi dextrin tiếp tục bị đường hóa thì tạo ra maltose và glucose. Glycogen: là 1 loại Carbohydrate dự trữ. Ở động vật được dự trữ trong cơ thể động vật và được cơ thể chuyển hóa để sử dụng từ từ. Amylase có vai trò quan trọng trong sự chyển hóa glucid ở tế bào động vật, vi sinh vật. Glycogen được cấu tạo từ các glucose liên kết với nhau bằng liên kết 1,4glycoside. Ở các vị trí phân nhánh, glucose nối với nhau bằng liên kết 1,6glycoside. Glycogen có số mạch nhiều hơn tinh bột, phân tử lượng ở trong khoảng 23 triệu Da.Glycogen dễ tan trong nước, nếu chúng ta ăn quá nhiều carbohydrate thì cơ thể chúng ta sẽ chuyển hóa chúng thành chất béo dự trữ. Ở động vật và người, glycogen tập trung chủ yếu ở trong gan.

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH

MỤC LỤC

I Tổng quan về enzyme amylase: 1

1 Lịch sử nghiên cứu: 1

2 Enzyme amylase là gì? 1

3 Phân loại: 2

4 Đặc tính: 4

5 Cơ chế tác dụng: 4

II Nguồn thu nhận enzyme amylase: 6

1 Thu nhận enzyme amylase từ nguồn thực vật: 6

1.1 Malt đại mạch: 6

1.2 Lúa: 6

2 Thu nhận enzyme amylase từ nguồn VSV: 6

III Quy trình sản xuất enzyme amylase: 7

1 Bản chất của quá trình: 7

2 Nguyên liệu sản xuất enzyme amylase: 7

2.1 Nguyên liệu tạo môi trường nuôi cấy: 7

2.2 Giống vi sinh vật dùng trong sản xuất amylase: 8

a Quy trình sản xuất lên men bề mặt: 8

b Quy trình sản xuất lên men chìm: 16

3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men: 18

a Chủng vi sinh vật: 18

b Môi trường dinh dưỡng: 19

c Độ ẩm môi trường: 19

d Không khí: 20

e Ảnh hưởng của pH: 21

f Nhiệt độ: 21

g Thời gian nuôi cấy: 22

h Sục khí và khuấy trộn: 22

IV Ứng dụng enzyme amylase trong công nghiệp thực phẩm 23

1 Tình hình ứng dụng enzyme trong công ngiệp trên thế giới 23

2 Ứng dụng enzyme amylase trong lĩnh vực công nghiệp thực phẩm 24

a Ứng dụng enzyme amylase trong sản xuất mì chính 24

b Ứng dụng enzyme amylase trong sản xuất bia: 27

c Ứng dụng enzyme amylase trong sản xuất cồn 29

d Ứng dụng trong sản xuất siro 31

e ứng dụng enzyme amylase trong sản xuất bánh mỳ 33

f Ứng dụng enzyme amylase trong sản xuất bánh kẹo 35

g Ứng dụng enzyme amylase trong sản xuất glucoza và mật 35

Tài liệu tham khảo 37

Vào nửa cuối thế kỷ thứ XVIII, nhà tự nhiên học người Pháp là Réaumur cũng đã nghiên cứu bản chất của sự tiêu hóa Nhà tự nhiên học này đã cho chim quạ đen nuốt những miếng thịt đặt sẵn trong ống kim loại có thành đã được đục sẵn và buộc vào dây thép Sau vài giờ đã không thấy gì ở trong ống Hiện tượng này đã thúc đẩy sự nghiên cứu thành phần dịch tiêu hóa để tìm hiểu khả năng tiêu hóa của dịch dạ dày Sau thí nghiệm này một thời gian, vào năm 1783, nhà bác học người Ý là Spalanzani

đã lặp lại thí nghiệm bằng cách lấy dịch dạ dày trộn với thịt mới và thấy có hiện tượng hòa tan xảy ra

Vào đầu thế kỷ XIX, các nhà nghiên cứu đã tách được các chất gây ra quá trình lên men Năm 1814 Kirchoff, viện sĩ Saint Petercburg đã phát hiện nước chiết của mầm đại mạch có khả năng chuyển hóa tinh bột thành đường ở nhiệt độ thường Đây là công trình đầu tiên thu được chế phẩm amylase ở dạng dung dịch và lịch sử enzyme học thực sự được xem như bắt đầu từ đây

Mười chín năm sau (năm 1833), hai nhà khoa học người Pháp là Payen và Pessoz

đã chứng minh chất có hoạt động phân giải tinh bột thành đường có thể tách được ở dạng bột Thí nghiệm được tiến hành bằng cách cho etanol vào dịch chiết của lúa đại mạch nảy mầm thì thấy xuất hiện kết tủa Kết tủa được hình thành này có khả năng chuyển hóa tinh bột và nếu đun kết tủa này sẽ mất tác dụng chuyển hóa Danh từ diastase (từ chữ Latinh diastasis - phân cắt) là do Payen và Persoz dùng để gọi enzyme amylase lúc bấy giờ

2 Enzyme amylase là gì?

Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật Các enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước:

RR’ + H-OH RH + R’OH

Có 6 loại enzyme được xếp vào 2 nhóm: Endoamylase (enzyme nội bào) và Exoamylase (enzyme ngoại bào)

2

Endoamylase gồm có -amylase và nhóm enzyme khử nhánh Nhóm enzyme khử nhánh này được chia làm 2 loại: Khử trực tiếp là Pullunase (hay còn gọi là -dextrin 6-glucosidase) và khử gián tiếp là Transglucosylase (hay oligo-1,6 glucosidase) và Maylo-1,6-glucosidase Các enzyme này thủy phân liên kết bên trong các chuỗi polysaccharide

Exoamylase gồm có -amylase và -amylase Đây là những enzyme thủy phân

tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide

Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen:

 Tinh bột: là nhóm carbohydrate ở thực vật có chủ yếu trong các loại củ (như

khoai lang, khoai tây, ), trong các hạt ngũ cốc, các loại hạt có công thức tổng quát là (C6H12O6)n Tinh bột từ mọi nguồn khác nhau đều có cấu tạo từ amylo và amylopectin Các loại tinh bột đều có 20-30% amylo và 70-80% amylopectin Trong thực vật, tinh bột được xem là chất dự trữ năng lượng quan trọng

Dưới tác dụng của enzyme amylase, tinh bột bị thủy phân do các liên kết glucoside

bị phân cắt Sự thủy phân tinh bột bởi enzyme amylase xảy ra theo 2 mức độ: dịch hóa

và đường hóa Kết quả của sự dịch hóa là tạo ra sản phẩm trung gian dextrin và khi dextrin tiếp tục bị đường hóa thì tạo ra maltose và glucose

 Glycogen: là 1 loại Carbohydrate dự trữ Ở động vật được dự trữ trong cơ thể

động vật và được cơ thể chuyển hóa để sử dụng từ từ Amylase có vai trò quan trọng trong sự chyển hóa glucid ở tế bào động vật, vi sinh vật Glycogen được cấu tạo từ các glucose liên kết với nhau bằng liên kết -1,4-glycoside Ở các vị trí phân nhánh, glucose nối với nhau bằng liên kết -1,6-glycoside Glycogen có số mạch nhiều hơn tinh bột, phân tử lượng ở trong khoảng 2-3 triệu Da

Glycogen dễ tan trong nước, nếu chúng ta ăn quá nhiều carbohydrate thì cơ thể chúng ta sẽ chuyển hóa chúng thành chất béo dự trữ Ở động vật và người, glycogen tập trung chủ yếu ở trong gan

3 Phân loại:

 Endoamylase ( enzyme nội bào):

- -amylasae: có khả năng phân cắt các liên kết 1,4- glucoside của cơ chất một cách ngẫu nhiên, là enzyme nội bào

 Exoamylase (enzyme ngoại bào):

- β–amylase

(β-1,4-glucan-maltohydrolase) β–amylase xúc tác từ sự thủy phân các liên kết 1,4-glucan trong tinh bột, glucogen và polysaccharide, phân cắt từng nhóm maltose từ đầu không khử của mạch Maltose tạo thành có cấu hình β, vì thế amylase này được gọi là β- amylase Tác dụng của β- amylase lên tinh bột có thể được biểu diễn theo sơ đồ sau:

(Glycogen ) 

- γ–amylase (glucoamylase)

4

Glucoamylase có khả năng thủy phân liên kết -1,4 lẫn -1,6- glucoside, ngoài ra còn có khả năng thủy phân liên kết -1,2 và -1,3- glucoside Glucose amylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glucogen, amylopectin, dextrin… thành glucose

mà không cần có sự tham gia của các loại enzyme amylase khác

4 Đặc tính:

cao, đặc trưng cho tính chất của enzyme này α - amylase của sinh vật có những đặc tính rất đặc trưng về cơ chế tác động, chuyển hóa tinh bột, khả năng chịu nhiệt

 Thể hiện họat tính trong vùng axit yếu:

Trong dung dịch đệm pH = 4,7; α - amylase của Asp Oryzae rất nhạy với tác

động của nhiệt độ cao, thậm chí ở 40oC trong 3 giờ hoạt lực dextrin hóa của nó chỉ còn 22 - 29%, hoạt lực đường hóa còn 27 -85% Ở 50oC trong 2 giờ, α - amylase của nấm sợi này bị vô hoạt hoàn toàn

 -amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau

 Amylase dễ tan trong nước,trong dung dịch muối và rượu loãng

 Tính bền nhiệt: Phân tử có 1-6 nguyên tử C, tham gia vào sự hình thành ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme

 Các amylase bị kiềm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+, H+, Hg2+

5 Cơ chế tác dụng:

Các giai đoạn của QT thủy phân tinh bột của α-amylase:

* Giai đoạn dextrin hóa:

Tinh bột → dextrin phân tử lượng thấp

5

* Giai đoạn đường hóa:

Dextrin  tetra và trimaltose  disaccharide và monosaccharide

Amylase  oligosacharide  poliglucose

Maltose  maltotriose  maltotetrose

-amylase từ các nguồn khác nhau có nhiều điểm rất giống nhau,có khả năng phân cách các liên kết -1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất một cách ngẫu nhiên,không theo 1 trật tự nào cả -amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó còn thủy phân cả hạt tinh bột nguyên song với tốc độ rất chậm

 Ở

(giai đoạn dextrin hóa): Chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành 1 lượng lớn dextrin phân tử thấp( -dextrin ),độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh,( các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh)

 Giai đoạn thứ 2 (giai đoạn đường hóa): Các dextrin phân tử thấp tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với Iod Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi -amylase cho tới disaccharide và monosaccharide Dưới tác dụng của -amylase, amylose bị phân hủy khá nhanh tạo thành oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose

 Sau đó các polyglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo nên các mạch polyglucose colagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose, maltotritrose, maltose Tóm lại, dưới tác dụng của -amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp.Tuy nhiên, thông thường -amylase chỉ thủy phân tinh bột chủ yếu tạo thành dextrin phân tử thấp không cho màu với Iod và 1 ít maltose Vì vậy người ta thường gọi loại amylase này là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa

6

II Nguồn thu nhận enzyme amylase:

1 Thu nhận enzyme amylase từ nguồn thực vật:

Từ lâu nay ta đã biết sử dụng các loại enzyme từ hạt nảy mầm để sử dụng trong ngành chế biến thực phẩm (mạch nha), nước giải khát (bia),…hoặc sản xuất các hỗn hợp bột enzyme gồm amylase, protease để bổ sung vào các loại bột dinh dưỡng cho trẻ em, người già những người suy tiêu hóa

Hạt ngũ cốc được cho nảy mầm, tách bỏ phần rễ và thân mầm, sấy khô ở nhiệt độ thấp để giữ cho nguyên hoạt tính của enzyme được gọi là malt Malt có thể được sản xuất từ nhiều loại hạt ngũ cốc như đại mạch, lúa, ngô, đậu,…mà chủ yếu từ đại mạch, lúa

1.1 Malt đại mạch:

Các enzyme thủy phân tinh bột trong đại mạch chủ yếu là amylase mà chủ yếu là α-amylase và β-amylase, quá trình nảy mầm của đại mạch là giai đoạn chuyển hóa enzyme từ trạng thái không hoạt động sang trạng thái hoạt động, đồng thời tổng hợp thêm hàng loạt các enzyme mới, giai đoạn này cần chú ý không làm giảm nhiều chất khô của hạt, tạo độ thông thoáng bằng cách đảo trộn Hạt đại mạch trước khi ngâm không có hoạt lực của enzyme α-amylase, khi hạt trải qua 3-4 ngày trong giai đoạn nảy mầm thì hoạt lực đạt tới mức cực đại vào ngày thứ 7 Sau đó sẽ giảm xuống

1.2 Lúa:

Hệ enzyme trong lúa cũng tương tự như trong hạt đại mạch, trong quá trình nảy mầm, hoạt động các enzyme tăng cao thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp các loại enzyme và quá trình sinh hóa gần giống đại mạch, chỉ khác về mức độ tạo thành enzyme và tốc độ phản ứng

Khi hạt chưa nảy mầm, các enzyme tồn tại ở các dạng liên kết Khi hạt nẩy mầm, các enzyme này chuyển sang dạng hoạt động và còn có sự hình thành một số enzyme mới ở phôi

2 Thu nhận enzyme amylase từ nguồn VSV:

Enzyme amylase có thể thu được từ các VSV sau:

- Chủng nấm mốc Asp Oryzae, Asp.nier…

- Các loại vi khuẩn là bacillus subtilis, Bac Mensentericus…

Những chủng vi sinh vật tạo nhiều amylase thường được phân lập từ các nguồn tự nhiên Vi sinh vật tạo amylase được dùng nhiều hơn cả là nấm sợi, giả nấm men và vi khuẩn, còn xạ khuẩn thì ít hơn

Các giống nấm sợi thường dùng là giống nấm sợi Aspergillus, rhizopus Nấm men

và giả nấm men thuộc các giống Candida, Saccharomyces, Endomycopsy, Endomyces

cũng tạo amylase

Nhiều vi khuẩn có khả năng tạo lượng lớn amylase như: Bac.polymyxa,

Phytomonas destructans, Cassavanum… các vi khuẩn ưa nhiệt có khả năng sinh

trưởng nhanh và phát triển tốt ở nhiệt độ cao nên khi nuôi chúng ít bị nhiễm vi sinh vật khác

Enzyme amylase chủng yếu được thu nhận từ các loại VSV Nguyên nhân cơ bản

là do:

7

- Có thể điều chỉnh quá trình sinh tổng hợp enzyme dễ dàng hơn các nguồn khác

- Hệ enzyme từ vsv vô cùg phong phú

- Giá thành môi trường nuôi cấy đơn giản và rẻ tiền

- Tốc độ sinh sản rất nhanh

- Dễ kiểm soát quá trình sx và mở rộng ở quy mô công nghiệp

Vai trò của giống vi sinh vật trong công nghệ enzyme: Trong công nghệ enzyme

từ VSV, giống đóng vai trò quyết định:

- Giống VSV quyết định đến năng suất enzyme của nhà máy

- Giống VSV quyết định đến chất lượng sản phẩm sinh học (hay là hoạt tính enzyme)

- Giống VSV quyết định vốn đầu tư cho sản xuất

- Giống VSV còn quyết định đến giá thành sản phẩm

III Quy trình sản xuất enzyme amylase:

Muốn thu nhận được enzyme amylase với hiệu suất cao cần phải tiến hành phân lập, và chọn giống VSV để tuyển lấy những chủng hoạt động mạnh, đồng thời phải tiến hành lựa chọn cơ chất cảm ứng và thành phần môi trường tối thích cũng như tiêu chuẩn hóa các điều kiện nuôi Như vậy là sự tổng hợp enzyme amylase không chỉ phụ thuộc vào các tính chất di truyền của VSV mà còn phụ thuộc vào việc tuyển chọn các điều kiện nuôi đặc hiệu

1 Bản chất của quá trình:

Amylase rất thông dụng, được dùng nhiều trong công nghiệp thực phẩm Enzyme này làm nhiệm vụ thủy phân tinh bột thành các phân tử đường gluco gồm α-amylase, β-amylase và các glucoamylase

Chế phẩm amylase kỹ thuật và tinh khiết có thể sản xuất từ những hạt ngũ cốc nẩy mầm ( thóc, ngô, đại mạch, tiểu mạch, lúa mì…) và từ quá trình nuôi cấy vi sinh vật Chế phẩm amylase thu được từ phương pháp nuôi cấy vi sinh vật hầu hết được tổng hợp bởi nấm mốc, vi khuẩn và một số ít từ nấm men

2 Nguyên liệu sản xuất enzyme amylase:

2.1 Nguyên liệu tạo môi trường nuôi cấy:

- Nguyên liệu sử dụng trong nuôi cấy bề mặt thường là những nguyên liệu có nguồn gốc tự nhiên như cám mì, cám gạo, gạo, ngô mảnh, đậu nành và các loại hạt ngũ cốc khác Trong các loại nguyên liệu trên, cám gạo, cám mì được sử dụng nhiều hơn cả Hai loại này có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho VSV phát triển Mặt khác khi tạo môi trường, chúng thường có tính chất vật lý rất thích hợp để vừa đảm bảo khối kết dính cần thiết, vừa đảm bảo lượng không khí lưu chuyển trong khối nguyên liệu

- Nguyên liệu sử dụng trong nuôi cấy bề sâu (Sử dụng môi trường hoàn toàn lỏng ): Nguyên liệu nuôi cấy phổ biến là dịch đường như gluco, fructo, saccaro, nước chiết bắp, pepton,… nồng độ thích hợp khoảng 10 - 15%

8

2.2 Giống vi sinh vật dùng trong sản xuất amylase:

- Chủng nấm mốc Asp Oryzae, Asp.nier…

- Các loại vi khuẩn là bacillus subtilis, Bac Mensentericus…

a Quy trình sản xuất lên men bề mặt:

NUÔI CẤY

THU ENZYME THÔ

SẮC KÝ

BAO GÓI

SẤY

THÀNH PHẨM

Sơ đồ quy trình:

10

Thuyết minh quy trình:

Bước 1: Chuẩn bị nguyên liệu nuôi cấy:

Chuẩn bị môi trường nuôi cấy:

- Chất lượng của cám gạo, cám mì có ảnh hưởng lớn đến hoạt lực của các enzyme amylase Cám không được chứa hàm lượng tinh bột dưới 20-30%, không có

vị chua hay đắng, không hôi mùi mốc, độ ẩm của cám không quá 15%, tạp chất độc không quá 0,05%

- Các phụ phẩm thêm vào để tăng độ thoáng khí cho môi trường nuôi cấy: mầm mạch ( 15-20% ), trấu ( 20-25% ), mùn cưa ( 5-10% )…

 Xử lý nguyên liệu: cám gạo, trấu và mùn cưa được xử lý để loại bỏ các tạp

chất Trấu cho vào với tỉ lệ 20-25% so với khối lượng cám gạo

 Thanh trùng: Trước khi thanh trùng người ta cho vào môi trường 0,2%

formalin ( 40% ) và 0,8% HCl kỹ thuật theo khối lượng môi trường Nhiệt độ thanh trùng là 95oC trong 60 phút Đồng thời phải thanh trùng khay lên men

- Rải nguyên liệu lên khay có kích thước 2x3 m, độ dày 2-3 cm, dùng 3kg môi trường/khay

Trong quá trình chuẩn bị môi trường, điều quan trọng nhất là tạo được độ ẩm thích hợp Độ ẩm thích hợp cho nhiều vi sinh vật nuôi cấy trong môi trường cám là 60% W Độ ẩm vượt quá 60% thường tạo điều kiện cho nhiều vi khuẩn phát triển, khi đó dễ xảy ra nhiễm vi sinh vật lạ; đồng thời môi trường sẽ bị bết lại, không khí không thể thâm nhập vào trong lòng môi trường Nếu độ ẩm bé hơn 60 % W (thường 45-50% W) nấm khó phát triển, thường gây hiện tượng tạo nhiều bào tử ở nấm sợi,

và như vậy họat tính enzyme sẽ giảm rất mạnh

Trường hợp cần tạo giống trung gian, ta nên tạo độ ẩm môi trường khoảng 50% W Trong suốt quá trình nuôi cấy để thu nhận enzyme, ta cần duy trì độ ẩm thích hợp khoảng 50 – 60% W và độ ẩm trong không khí là 95 – 100% W

45-Sau khi chuẩn bị xong môi trường, ta tiến hành thanh trùng môi trường để tiêu diệt những vi sinh vật nhiễm vào môi trường mà có thể ức chế sự phát triển của giống

vi sinh vật mà ta quan tâm Người ta thường thanh trùng bằng hơi nước nóng ở 1 – 1,5

at trong thời gian 45 – 60 phút Để thuận lợi cho việc thanh trùng có hiệu quả cũng như tạo điều kiện thích hợp cho sợi nấm phát triển, trước khi thanh trùng, người ta thường dùng acid clohydric hay acid sunfuric để điều chỉnh pH của môi trường

Sau khi thanh trùng môi trường xong người ta bắt đầu nuôi cấy để thu nhận enzyme

11

Bước 2: Trộn và nuôi cấy:

- Môi trường sau khi làm nguội, tiến hành cấy mốc giống vào các khay với tỷ lệ cấy khoảng 0,2-2% lượng giống so với lượng môi trường ở mỗi khay

- Đưa khay lên các giá đỡ

- Nhiệt độ phòng nuôi cấy được giữ ở 25-30oC, độ ẩm 60-65%, đồng thời phải thoáng khí

- Đến khoảng 30-32 giờ sau khi cấy giống, ta thu nhận enzyme thô

Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường bán rắn khi nuôi bằng phương pháp bề mặt này trải qua các giai đoạn sau:

- Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy

Ở giai đoạn này có những thay đổi sau:

 Nhiệt độ tăng rất chậm

 Bào tử trưởng nở, sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa

 Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi

 Khối môi trường còn rời rạc

Thời kỳ này không hình thành enzyme, không đòi hỏi nhiều không khí, cho nên chỉ cần làm thoáng khoảng 2-3 thể tích không khí/thể tích phòng nuôi trên giờ

Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt độ Tuyệt đối không được đưa nhiệt độ cao quá 30o

C vì thời kỳ đầu này giống rất mẫn cảm với nhiệt độ

Độ ẩm tương đối của không khí là 96-100%

- Giai đoạn 2: Giai đoạn này kéo dài 14-18 giờ Trong giai đoạn này có những thay đổi cơ bản sau:

 Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển rất mạnh các sợi nấm này tạo ra những mạng sợi chằng chịt khắp trong các hạt môi trường, trong lòng môi trường

Trong giai đoạn này ta có thể hoàn toàn nhìn rõ các sợi nấm có màu trắng xám bằng mắt thường

Môi trường được kết lại khá chặt

Độ ẩm môi trường giảm dần

 Nhiệt độ môi trường sẽ tăng nhanh có thể lên tới 40-45oC ( do quá trình hô hấp của nấm mốc ), vì thế ta phải hạ nhiệt môi trường giúp cho nấm mốc mọc đều và đẹp

 Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh do sự đồng hoá mạnh của nấm sợi

 Enzyme amylase được tổng hợp mạnh

Lượng O2 trong không khí giảm và CO2 sẽ tăng dần, do đó trong giai đoạn này cần phải được thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì trong khoảng 29-30oC là tốt nhất Ở một số nhà máy người ta thổi không khí vô trùng có nhiệt độ 28-29oC và độ

ẩm cao vào phòng nuôi Lượng khí thổi vào ở giai đoạn này thường 60 thể tích khí/thể tích phòng nuôi/giờ; lượng khí thổi vào nhằm mục đích cung cấp khí oxy, thải CO2, vừa làm giảm nhiệt độ phòng nuôi

- Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài 10-20 giờ Ở giai đoạn này có một số thay đổi cơ bản như sau:

Quá trình trao đổi chất yếu dần, do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng sẽ chậm

12

lại

 Theo Rodxevits (Pozerur, 1967) trong một ngày đầu của giai đoạn sinh trưởng

thứ nhất và thứ hai, nấm mốc Asp Oryzae chỉ tạo được có 7,5-8% enzyme, trong vòng

12 giờ sau, hoạt lực của -amylase tăng 9-12 lần, hoạt lực đường hoá tăng hai lần và hoạt lực của oligo-1,6-glucosidase tăng lên 10 lần Đối với đa số VSV ở giai đoạn này nên hạ nhiệt độ xuống 3-40C so với giai đoạn đầu Nhiệt độ tối thích cho đa số nấm mốc trên môi trường rắn là 28-300C, cho Bac.subtilis là 35-370C

 Nhiệt độ của khối môi trường giảm, do đó làm giảm lượng không khí môi trường xuống 20-25 thể tích không khí /thể tích phòng nuôi cấy/ 1giờ Nhiệt độ nuôi duy trì ở 30oC, trong giai đoạn này, bào tử được hình thành nhiều do đó luợng enzyme amylase tạo ra sẽ giảm xuống Chính vì thế việc xác định thời điểm cần thiết để thu nhận enzyme rất cần thiết

Cần thu nhận enzyme thô vào thời điểm trước khi nấm sinh bào tử vì khi nấm sinh bào tử là lúc quá trình tổng hợp enzyme đã yếu đi Do đó, cần một bước nuôi cấy thử nghiệm để xác định thời điểm thu nhận enzyme thô Chế phẩm enzyme thô thu được chứa tế bào nấm, cơ chất, nước và enzyme

Thời gian nuôi để có lượng amylase cực lớn: Thời gian nuôi để có lượng amylase

cực lớn thường được xác định bằng thực nghiệm Tùy thuộc vào tính chất của chủng sinh vật và sự ngừng tổng hợp enzyme mà có thể ngừng sinh trưởng của nấm mốc vào bất kỳ lúc nào thấy cần thiết Sự tạo bào tử là hiện tượng không mong muốn vì thường làm giảm hoạt lực của enzyme Đối với đa số nấm mốc bắt đầu sinh đính bào tử Trong điều kiện sản xuất thoáng khí tốt thì thời gian nuôi để có tích lũy amylase cực đại đối với từng loại nấm sợi và vi khuẩn như sau:

Chủng Thời gian nuôi (giờ)

Để đảm bảo cho chế phẩm enzyme thô α-amylase không bị mất hoạt tính nhanh người ta thường sấy khô chế phẩm enzyme đến một độ ẩm thấp ( thiết bị sấy thường dùng ở đây là máy sấy chân không ) Độ ẩm cần đạt được sau khi qúa trình sấy kết thúc là nhỏ hơn 10% độ ẩm Để đảm bảo hoạt tính enzyme không thay đổi người ta thường sấy ở nhiệt độ 38-400

C Enzyme α-amylase ở nấm mốc Asp oryzae sẽ bị bất

hoạt nếu nhiệt độ lên đến 60-700C

13

Tùy theo mục đích sử dụng ta có thể dùng chế phầm thô này ngay không cần phải qúa trình tinh sạch Trong những trường hợp cần thiết khác, ta phải tiến hành làm sạch enzyme

Để sản xuất enzyme tinh khiết người ta phải tiến hành như sau:

- Toàn bộ khối lượng enzyme thô amylase được đem đi nghiền nhỏ

 Nghiền mịn:

 Mục đích: là vừa phá vỡ thành tế bào vừa làm nhỏ các thành phần của chế phẩm thô Khi thành tế bào được phá vỡ, các enzyme nội bào chưa thoát ra khỏi tế bào

sẽ dễ dàng thoát khỏi tế bào Phần lớn enzyme amylase ngoại bào khi được tổng hợp

và thoát khỏi tế bào ngay lập tức thấm vào thành phần môi trường Khi ta nghiền nhỏ, enzyme thoát ra khỏi các thành phần này dễ dàng hơn Trong khi nghiền người ta thường sử dụng những chất trợ nghiền trong trường hợp này được dùng là cát và bột thạch anh Các chất này là những chất vô cơ không tham gia vào phản ứng và khả năng tăng mức độ ma sát, trước khi sử dụng cát và bột thạch anh phải được rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ lớn hơn 1000C để loại bỏ nước và tiêu diệt VSV

 Trích ly:

 Mục đích: Sau khi nghiền mịn, người ta cho nước vào để trích ly enzyme α-amylase Các loại enzyme thủy phân có khả năng tan trong nước nên người ta thường dùng nước như một dung môi hòa tan Cứ một phần chế phẩm enzyme thô, người ta cho 4-5 phần nước, khuấy nhẹ và sau đó lọc lấy dịch, phần bã thu riêng dùng làm thực phẩm gia súc ( chú ý cần loại bỏ cát và bột thạch anh ra khỏi hỗn hợp bã rồi mới cho gia súc ăn) Dịch thu nhận được vẫn ở dạng chế phẩm enzyme thô vì trong đó

có chứa nước, các chất hòa tan khác từ khối môi trường nuôi cấy Việc tiếp theo là làm sao tách enzyme ra khỏi vật chất này

 Kết tủa enzyme α-amylase:

- Để làm việc trên người ta tiến hành kết tủa enzyme nhờ những tác nhân gây tủa Trong công nghệ tinh chế enzyme, người ta thường dùng cồn và sunfat amon Hai tác nhân kết tủa này dễ tìm kiếm và giá rẻ so với những tác nhân gây tủa khác Trong khi tiến hành kết tủa, người ta phải làm lạnh cả dung dịch enzyme thô và cả những tác nhân kết tủa để tránh làm mất hoạt tính enzyme Khi đổ chất làm kết tủa enzyme vào dung dịch enzyme thô phải hết sức từ từ để tránh hiện tượng biến tính Trong qúa trình kết tủa người ta dùng cồn hoặc sulfat amon với liều lượng như sau:

Cứ một phần dung dịch enzyme thô người ta cho 2 đến 2,5 lần cồn hoặc sulfat amon

- Khi cho chất kết tủa vào dung dich enzyme thô, người ta tiến hành khuấy nhẹ, sau đó để yên trong điều kiện nhiệt độ lạnh (thường từ 4-70C) theo thời gian, các enzyme sẽ được tạo kết tủa và lắng xuống đáy, người ta tiến hành gạn và lọc thu nhận kết tủa ở dạng paste (độ ẩm lớn hơn 70%W)

- Ở trạng thái này enzyme rất dễ bị biến tính vì còn nhiều nước, để dễ bảo quản người ta sấy kết tủa enzyn α-amylase ở 400C cho đến khi độ ẩm cuối cùng đạt 5-8%

W (thiết bị sấy thường dùng là máy sấy phun sương)

- Trong nhiều trường hợp chế phẩm enzyme α-amylase ở dạng kết tủa vẫn hoàn toàn chưa sạch về mặt hóa học vì trong đố còn chứa 1 số enzyme ngoài enzyme

14

amylase ta quan tâm, chẳng hạn enzyme α- amylase này còn chứa hoạt tính protase có tính acid và cellulose do đó muốn thu nhận được enzyme có độ tinh khiết cao hơn ta phải tinh chế enzyme α-amylase kết tủa bằng các qúa trình lọc Gel Gel sử dụng là Sephadex G200

15

Giải thích quy trình:

Đầu tiên, ta tiến hành nhân giống để chuẩn bị cho công đoạn lên men Cám sẽ được gầu tải cám số (5) đưa lên thùng chứa cám số (6), cám ở thùng chứa số (6) và dịch môi trường ở thiết bị số (8) sẽ cho đi qua thiết bị thanh trùng số (7) để loại có các

vi sinh vật tạp nhiễm gây ảnh hưởng đến quá trình lên men Môi trường cần có độ ẩm 50-60% Môi trường sau khi được thanh trùng sẽ cho vào các khây đã được hấp thanh trùng tại thiết bị số (9) với chiều dày môi trường trên mỗi khay 2-5 cm, sau đó chuyển sang bàn trung gian số (10) để tiến hành cấy mốc giống Các khay môi trường sau khi

đã cấy mốc giống được chuyển vào các tủ chứa khay, rồi được đẩy vào phòng nuôi mốc Tại đây, mốc được nuôi để thu enzyme amylase Mốc sau khi gieo cấy sẽ phát triển trên bề mặt và dần dần lan xuống phía dưới theo các kẽ hở giữa các cấu tử thành phần môi trường Môi trường nuôi cấy bề mặt là môi trường rắn xốp Vi sinh vật phát triển sử dụng oxy trong các quá trình biến đổi sinh hóa, đồng thời thải CO2 ra môi

16

trường xung quanh và tỏa nhiệt ra xung quanh làm nóng và khô môi trường, hệ sợi làm cho môi trường kết thành tảng Khi đó cần phải thông gió, phun mù và làm ẩm trực tiếp, lật khối môi trường nuôi cấy hoặc bẻ nhỏ Vì vậy, trong buồng nuôi cấy thường có hệ thống thoát khí vừa làm giảm đi lượng CO2 trong buồng, đồng thời cũng giúp hạ nhiệt của buồng Trong quá trình nuôi cấy VSV ta cần cung cấp oxy, oxy trước khi đưa vào phòng nuôi cấy sẽ được đi qua thiết bị lọc khí số (14) để loại bỏ các tạp chất, bụi bẩn cũng như VSV có hại cho quá trình lên men Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu được enzyme thô, để thu được enzyme tinh khiết thì các khây mốc này được lấy ra khỏi buồng nuôi cấy và tiến hành quá trình nghiền thông qua thiết bị nghiền số (15), sau đó đem đi trích ly và lọc Vì sản phẩm thu được còn hàm lượng ẩm lớn, dễ làm cho enzyme bị biến tính, nên ta cần sấy sản phẩm này thông qua thiết bị sấy số

(16) cho đến khi độ ẩm cuối cùng đạt được 5-8% W thì kết thúc quá trình sấy

 Ưu và nhược điểm của phương pháp này:

b Quy trình sản xuất lên men chìm:

Bước 1:Chuẩn bị môi trường:

Môi trường sử dụng trong nuôi cấy bề sâu: để tạo khả năng thoáng khí tốt hơn, người ta thường cho thêm trấu với tỷ lệ thích hợp cho từng loại enzyme đươc tạo ra từ VSV Thực chất cho trấu vào là làm tăng độ xốp của môi trường, tạo nên những khoảng trống để không khí có thể lưu thông trong lòng môi trường Chính vì thế ta

thấy rằng nấm mốc Asp oryzae không chỉ phát triển trên bề mặt môi trường mà còn

phát triển rất mạnh trên bề mặt hạt môi trường Hay nói cách khác, chủng nấm mốc

Asp.oryzae có khả năng phát triển ở giữa hai pha rắn và pha khí của môi trường.Trong

trường hợp này, nó có khả năng phát triển hẳn trong lòng môi trường nhưng nó vẫn hoàn toàn mang ý nghĩa của quá trình lên men bề mặt

Bước 2: Trộn giống vi sinh vật:

Sau khi đã bổ xung các chất dinh dưỡng cho môi trường thì ta tiến hành hấp khử trùng môi trường ở nhiệt độ 118 – 125 0C, thời gian 40 – 60 phút, sau đó để nguội đến