Ứng dụng kháng nguyên tái tổ hợp p24, GP41, GP120 trong chẩn đoán HIV bằng kỹ thuật ngưng kết hạt latex

1 MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tên đầy đủ HIV Human immunodeficiency virus Gag Group-associated anti- gen Env envelop Pol polymerase RT Reverse transcriptase WB Western blot IFA Elisa Gp DNA cDNA Trx Trx- 120 Immunofluoresscence Enzyme linked immune sorbent assay Glycoprotein Deoxyribonucleic acid Comlemetary DNA A gen encodes thioredoxin A of E Coli, wich is available in plasmide pET32a(+) A recombinant fusion is encoded by a fusion gên of trx and gp120, produced in E coli Trx- gp41 A recombinant fusion is encoded by a fusion gen of trx and gp 41, produced in E coli Trx-p24 A recombinant fusion is encoded by a fusion gen of trx and p24, produced in E coli PBS SDS TBS TEMED Phosphate buffered saline Sodium dodecyl sulfat Tris buffered saline N,N,N’,N’- tetramethyl ethylenediamine Joint United Nations Programme on HIV/AIDS World Health Organization United Nations Children's Emergency Fund UNAID WHO UNICEF Tiếng việt virus suy giảm miễn dịch người Kháng nguyên liên kết nhóm Vỏ Enzym kéo dài Enzym phiên mã ngược Kỹ thuật miễn dịch màng polyvinyliden difluorit Kỹ thuật miến dịch huỳnh quang Kỹ thuật miễn dịch gắn enzym Glycoprotein acid deoxyribonucleic DNA bổ trợ Gen mã hóa thioredoxin A E.coli thiết kế sẵn plasmide pET32a(+) Protein tái tổ hợp dạng lai mã hóa từ gen trx dung hợp với gen gp120, tổng hợp E.coli Protein tái tổ hợp dạng lai mã hóa từ gen trx dung hợp với gen gp41, tổng hợp E.coli Protein tái tổ hợp dạng lai mã hóa từ gen trx dung hợp với gen p24, tổng hợp E.coli Đệm phosphat saline Natri dodexin sulfat Đệm saline N,N,N’,N’- tetramethyl ethylenediamine Chương trình phối hợp liên hợp quốc HIV/ AIDS Tổ chức y tế thê giới Quỹ Nhi đồng Liên Hiệp Quốc AIDS CD4 BSA mARN acquired immunodeficiency syndrome cluster of differentiation Bovine serum albumin Messenger ribonucleic acid Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải Tế bào CD4 Huyết bò ARN thông tin ĐẶT VẤN ĐỀ HIV virus gây hội chứng suy giảm miễn dịch người Từ bệnh đến trở thành nỗi sợ hãi, ám ảnh hàng triệu người toàn cầu Kể từ trường hợp nhiễm ghi nhận vào năm 1981, đến HIV lan rộng hầu giới Theo thống kê Tổ chức y tế giới Chương trình phối hợp Liên Hợp Quốc phòng chống HIV/AIDS, tính đến tháng 12/2007 toàn giới có 33,2 triệu người nhiễm HIV/AIDS sống, 95% số người nhiễm nước nghèo phát triển Việt Nam quốc gia chịu ảnh hưởng nặng nề đại dịch Do tính chất nguy hiểm bệnh, để đảm bảo an toàn truyền máu tầm soát bệnh, tránh lây lan, bùng phát dịch cộng đồng, việc phát triển kit chẩn đoán HIV vô cần thiết Tuy nhiên, Việt Nam, tất kit sử dụng chẩn đoán nhập ngoại với giá thành cao, độ đặc hiệu chưa thể đánh giá hãng sản xuất giữ bí mật phân type HIV sử dụng sản xuất chế phẩm Vì việc nghiên cứu phát triển chế phẩm chẩn đoán HIV có độ nhạy, độ đặc hiệu cao cho chủng HIV lưu hành nước có ý nghĩa lớn mặt thực tiễn lâm sàng Từ kết nghiên cứu gần TS Bạch Thị Như Quỳnh cộng viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam công bố biểu thành công kháng nguyên quan trọng virus HIV (p24, gp41 gp120) dựa phân type HIV lai CRF01-AE lưu hành chủ yếu Việt Nam tiền đề thuận lợi để tiến hành nghiên cứu “Ứng dụng kháng nguyên tái tổ hợp P24, GP41, GP120 chẩn đoán HIV kỹ thuật ngưng kết hạt latex” Đề tài nhằm thực mục tiêu: Ứng dụng kháng nguyên tái tổ hợp p24, gp41, gp120 tạo sinh phẩm thử nghiệm chẩn đoán HIV dựa kỹ thuật ngưng hạt latex Đánh giá độ tương đồng khả phát HIV sinh phẩm ngưng kết hạt latex kit nhập ngoại huyết bệnh nhân CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tình hình nhiễm HIV Việt Nam giới 1.1.1 Tình hình nhiễm HIV giới Theo thống kê tổ chức Y tế giới WHO, chương trình Phối hợp Liên Hợp Quốc HIV/AIDS (UNAIDS) Quỹ Nhi đồng Liên Hiệp Quốc (Unicef) năm 2010, có khoảng 34 triệu người sống chung với HIV toàn giới, có 3,4 triệu trẻ em 15 tuổi Chỉ tính riêng năm 2010 có thêm 2,7 triệu ca nhiễm HIV, 390 000 ca số trẻ em 15 tuổi [10] Sự phân bố tỷ lệ nhiễm HIV toàn giới không đồng quốc gia khu vực Cụ thể, Sub-Saharan Châu Phi khu vực chịu ảnh hưởng nặng nề với 70% tổng số ca nhiễm toàn giới, khu vực Đông Nam Á (17%) số quốc gia phát triển khác [10] Mặc dù số trường hợp nhiễm HIV gia tăng tỷ lệ nhiễm có xu hướng giảm năm qua Theo số liệu thống kê 39 quốc gia từ năm 2001 đến 2011cho thấy, tỷ lệ nhiễm HIV nhóm người trưởng thành giảm 25% Riêng khu vực châu Phi cận Sahara, số lượng người nhiễm HIV năm 2011 1,8 triệu người, thấp đáng kể so với 2,4 triệu người vào năm 2001 [11] 1.1.2 Tình hình nhiễm HIV Việt Nam Tại Việt Nam, kể từ ca nhiễm HIV phát năm 1990, tính đến ngày 31/12/2014 toàn quốc có 226,964 trường hợp nhiễm HIV, 71,433 người chuyển sang giai đoạn AIDS có tới 71,368 người tử vong bệnh Trong năm gần đây, số người nhiễm HIV phát với khoảng 12,000 – 14,000 ca mắc năm Tính đến 2014, 100% số tỉnh thành, 98.9% quận huyện 80.3% xã phường có người nhiễm HIV Dịch HIV Việt Nam tập trung chủ yếu nhóm quần thể có hành vi nguy lây nhiễm HIV cao người tiêm chích ma túy, nam quan hệ tình dục đồng giới phụ nữ bán dâm [20] 1.2 Đặc điểm chung HIV 1.2.1 Hình thái cấu trúc HIV Hình 1.1 Hình thái cấu trúc virus HIV Virus HIV (gồm HIV-1 HIV-2) thuộc vào họ Retroviridae, giống Lentivirus [1] HIV có dạng hình cầu, đường kính hạt virus 80-100 nm [2] Hạt virus HIV hoàn chỉnh (virion) có cấu trúc gồm lớp - Lớp vỏ (envelop) cấu trúc màng lipid kép [7] Trên màng có gai nhú glycoprotein liên kết đặc hiệu với thụ thể màng sinh chất tế bào chủ có trọng lượng phân tử 160 kDa (gp160), gồm phần: + Glycoprotein màng có trọng lượng phân tử 120 kDa (gp120) + Glycoprotein xuyên màng có trọng lượng phân tử 41 kDa (gp41) [8] - Vỏ capsid gồm lớp protein: + Lớp hình cầu có trọng lượng phân tử 18 kDa (p18) + Lớp hình trụ có trọng lượng phân tử 24 kDa (p24) gp120, gp41 p24 kháng nguyên quan trọng để chẩn đoán HIV - Lõi nằm bên vỏ capsid vật chất di truyền HIV gồm hai phân tử ARN mạch đơn, chuỗi dương Hệ gen HIV chứa nhóm gen cấu trúc: + Gen gag (group specific antigen) gen mã hoá cho kháng nguyên đặc hiệu vỏ capsid virus 10 + Gen pol (polymerase) mã hoá cho enzyme phiên mã ngược (RT Reverse transcriptase), protease endonuclease (còn gọi integrase) + Gen env (envelop) mã hoá cho glycoprotein vỏ HIV [2] 1.2.2 Chu trình sống HIV Chu trình sống virus HIV tóm tắt sơ đồ hình Hình 1.2: Chu trình sống HIV (1) Sự hấp phụ lên bề mặt tế bào: Do phù hợp cấu trúc gp120 với thụ thể biểu màng tế bào, HIV hấp phụ lên bề mặt tế bào chủ Trong đa số trường hợp, thụ thể CD4 biểu bề mặt tế bào lympho T hỗ trợ (T-help) số tế bào khác bạch cầu đơn nhân lớn, đại thực bào số tế bào dòng lympho B [2] (2) Sự xâm nhập vào tế bào: Sau bám vào thụ thể tế bào vật chủ, gp41 HIV cắm sâu vào màng tế bào, nhờ gen HIV chui vào bên tế bào Một số tế bào thụ thể CD4 tế bào thần 30 Nơi kiểm tra Số lượng Dương mẫu tính thật Trung tâm phòng 50 chống AISD 10 Âm tính giả Âm tính Dương thật tính giả 39 Bảng 3.2 kết kiểm tra mẫu huyết Trung tâm phòng chống AISD – Bộ Quốc Phòng ( tổng số mẫu, n = 50, số trường hợp dương tính thật = 10, số trường hợp âm tính thật = 39) Dựa công thức tính độ nhạy, độ đặc hiệu, tính độ nhạy độ đặc hiệu sinh phẩm sau: 31 Độ nhạy : - Độ nhạy = số trường hợp dương tính thật/ số trường hợp dương tính thật + số trường hợp âm tính giả PA Độ nhạy (SE %) = X 100 = N+ % 10 X 100 % = 100 10 PA: Tổng số mẫu cho kết dương tính thật = 10 ND: Số mẫu cho kết âm tính giả = N+: ND + PA = 10+0 =10 Độ đặc hiệu - Độ đặc hiệu = số trường hợp âm tính thật/ số trường hợp âm tính thật + số trường hợp dương tính giả NA Độ đặc hiệu (SP %): SP = N- x 100% = NA: Tổng số mẫu cho kết âm thật = 39 PD: Số mẫu cho kết dương tính giả = N-: NA + PD = 39+1=40 39 41 = 97,5% 32 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1 Độ tinh nồng độ protein mẫu thử nghiệm Như trình bày phần tổng quan, gp120, gp41 p24 loại kháng nguyên đóng vai trò đặc biệt quan trọng trình hấp phụ, xâm nhập HIV vào tế bào chủ Vì vậy, phương pháp phát HIV gián tiếp thường dựa dạng kháng nguyên này.Tuy nhiên việc chẩn đoán HIV dựa nguồn kháng nguyên tự nhiên có nhiều hạn chế nguy lây nhiễm cao, hàm lượng kháng nguyên thấp, khó tinh tốn nên để khắc phục nhược điểm này, người ta thường biểu chúng dạng protein tái tổ hợp Tuy nhiên đa dạng chủng loại HIV dựa kiểu gen phân bố chúng mặt địa lý vô lớn Mỗi quốc gia, châu lục giới lại khác lưu hành chủng HIV Vì để đảm bảo độ nhạy, độ đặc hiệu cao khả phát HIV dạng kháng nguyên phân lập biểu cần phải xác định phân type HIV lưu hành Việt Nam Một công bố nhóm nghiên cứu TS Bạch Thị Như Quỳnh cộng viện Công nghệ Sinh học cho thấy CRF01_AE phân type phổ biến Việt Nam (chiếm tới 96.7% tổng số 240 trường hợp nhiễm HIV thu thập ngẫu nhiên 13 tỉnh thành Việt Nam) Trên sở đó, nhóm nghiên cứu biểu thành công dạng protein tái tổ hợp gp120, gp41 p24 đặc trưng phân type HIV Kết đánh giá tính kháng nguyên dạng protein tái tổ hợp sau trình tinh cho thấy chúng giữ nguyên đặc tính sinh học tự nhiên mối tương tác với kháng thể kháng HIV huyết bệnh nhân nhiễm HIV Từ sản phẩm nghiên cứu đề tài, ứng dụng dạng kháng nguyên tái tổ hợp 33 gp120, gp41 p24 tạo chế phẩm ngưng kết hạt latex có độ nhạy, độ đặc hiệu cao nhằm mục đích sàng lọc nhanh trường hợp nhiễm HIV 4.1.1 Đánh giá độ tinh protein Trước tiến hành chế tạo sinh phẩm ngưng kết hạt latex phải kiểm tra, đánh gia độ tinh protein tái tổ hợp nhóm nghiên cứu đề tài chuyển giao kỹ thuật điện di protein gel polyacrylamide Quy trình thực kỹ thuật điện di trình bày cụ thể, chi tiết mục 3.1.2 Một gel điện di protein gồm lớp gel cô gel tách Trong lớp gel cô có tác dụng làm cho phân tử điện di tập trung lại lớp gel tách có đóng vai trò phân tách protein khác dựa vào khối lượng phân tử chúng Hình 4.1: Sơ đồ cấu trúc vector biểu protein tái tổ hợp pET32 sử dụng nghiên cứu Trong trình thiết kế vector biểu protein tái tổ hợp, để tối ưu hóa cho trình biểu tinh sạch, tác giả chèn gene gp120(537Kb), gp41(500Kb), p24(584Kb) vào vị trí enzyem cắt BamH I Xho I plasmit Kết protein tái tổ hợp hình thành dung hợp với đoạn polypeptide thioredoxin (TRX) (109 axit 34 amin), S.tag (24 axit amin), vùng His.tag (12 axit amin) với số axit amin vectơ Do sản phẩm sau tinh thu phân tử protein tái tổ hợp có kích thước nguyên gp120 (172 axit amin) , gp41 (159 axit amin), p24 (190 axit amin) mà protein tái tổ hợp dạng dung hợp với kích thước tương ứng 37,149kDa; 37,247kDa 40,225kDa Kết phân tích gel điện di polyacrylamide 12,5% cho thấy trường hợp, sản phẩm thu bao gồm band protein nhất, rõ ràng, sắc nét, kích thước phù hợp với tính toán Điều chứng tỏ gp120, gp41 p24 tái tổ hợp sau tinh chế có độ tinh cao đạt yêu cầu sử dụng phân tích 4.1.2 Xác định nồng độ protein tái tổ hợp Theo khuyến cáo hãng sản xuất kit PolyLink Protein Coupling Kit cung cấp hạt bead latex sử dụng nghiên cứu yêu cầu nồng độ tối thiểu protein phản ứng phải đạt 0.5ml/ml Vì vậy, sau điện di kiểm tra kích thước, tiến hành xác định nồng độ dạng protein tái tổ hợp kỹ thuật đo mật độ quang học dung dịch protein máy Nanodrops (Thermo) Phương pháp dựa nguyên tắc phương pháp quang phổ hấp thụ: protein hấp thụ tia cực tím cực đại bước sóng Độ hấp thụ 280nm thay đổi tuỳ loại protein hệ số tắt đo (nghĩa độ hấp thụ dung dịch protein 1% với đường sóng truyền qua 1cm) cho protein cho phép tính nồng độ protein tinh acid amine Kết xác định nồng độ dạng protein gp12, gp41 p24 0,614; 0,630; 0,661 chứng tỏ chất lượng loại protein tái tổ hợp đảm bảo yêu cầu sử dụng phản ứng ngưng kết hạt latex 35 4.1.3 Chế tạo sinh phẩm ngưng kết hạt latex chẩn đoán HIV Trong quy trình chuẩn, để xác nhận mẫu nhiễm HIV phải trải qua hai lần kiểm tra kỹ thuật Elisa cho kết dương tính Và khẳng định cuối kỹ thuật western-blot, kỹ thuật có tính chuyên sâu độ đặc hiệu cao Kỹ thuật western-blot kết luận dương tính phát phản ứng kháng nguyên kháng thể hai tổ hợp protein (p) sau: + gp120/gp160 + p24/gp41 + p31/gp41 + gp120/gp160 (Jo seph R Masci, M.D.) Tuy nhiên western-blot kỹ thuật tương đối phức tạp để thực sơ y tế, đồng thời giá thành tương đối cao Hiện nay, Việt Nam, Bộ Y tế ban hành quy định việc khẳng định mẫu HIV dương tính theo phương cách Theo phương cách mẫu coi HIV dương tính mẫu dương tính với ba xét nghiệm có nguyên lý chuẩn bị kháng nguyên khác mà không thiết phải thực kỹ thuật western blot Xuất phát từ lý đó, mong muốn chế tạo sinh phẩm ngưng kết hạt latex có độ nhạy, độ đặc hiệu cao phục vụ cho mục đích sàng lọc HIV Để chế tạo sinh phẩm ngưng kết hạt latex, sau kiểm tra độ tinh nồng độ kháng nguyên tái tổ hợp p24, gp41 gp120, tiến hành hoạt hoá nhóm carboxyl (COOH) bề mặt hạt latex với carbodiimide Hạt latex sử dụng nghiên cứu có chất hạt polystyren Kích thước trung bình hạt 1,1 µm Ở kích thước này, thí 36 nghiệm chứng minh khả gắn protein lên bề mặt hạt latex hiệu Trên ống chứa hạt latex hoạt hóa, bổ sung 500μg loại protein tái tổ hợp để thực phản ứng gắn Các nghiên cứu thời gian hàm lượng protein ủ có ảnh hưởng lớn đến tỷ lệ protein gắn lên bề mặt hạt latex Cụ thể nhiều protein bổ sung phản ứng tỷ lệ protein gắn bề mặt hạt latex cao Mặt khác, hàm lượng protein từ 200-500 μg, thời gian ủ kéo dài, hiệu suất phản ứng gắn tăng lên Do nghiên cứu lựa chọn hàm lượng protein đạt nồng độ tối đa 500μg theo khuyến cáo hãng sản xuất thời gian ủ Mặt khác, để tăng tính ổn định bề mặt hạt latex, sau thực phản ứng gắn protein tái tổ hợp lên hạt latex, rửa phức hợp gắn tiếp tục bổ sung protein huyết bò BSA 5% để che phủ vị trí trống chưa gắn bề mặt hạt latex Từng hỗn hợp sau phản ứng gắn kiểm tra, đánh giá khả ngưng kết với kháng thể kháng thioredoxin theo quy trình Kết cho thấy gắn thành công loại protein tái tổ hợp gp120, gp41 p24 HIV lên bề mặt hạt latex Tiếp theo phối trộn loại hạt latex gắn loại kháng nguyên khác theo tỷ lệ 1:1:1 để thu chế phẩm ngưng kết hạt latex Hỗn hợp thu tiếp tục đánh giá khả gây ngưng kết kháng thể kháng thioredoxin theo quy trình thử nghiệm mẫu huyết dương tính với HIV viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp Kết ngưng kết thấy rõ mắt thường Để tối ưu hóa khả ngưng kết chế phẩm với huyết bệnh nhân, thực thao tác pha loãng chế phẩm theo cấp số quy trình mục 2.4.4 Chúng dễ dàng nhìn thấy mắt thường kết 37 phản ứng ngưng kết Latex lam kính ( hình 3.8) sau 5- 10 phút Với mẫu huyết dương tính, giếng thứ giếng thư kết hoàn toàn âm tính, không xảy phản ứng ngưng kết Tại giếng thứ giếng bổ sung dung dịch hạt latex gắn kháng nguyên HIV tái tổ hợp, kết xảy phản ứng ngưng kết rõ ràng với độ pha loãng cuối 1/32 Thậm chí có mẫu duơng tính độ pha loãng huyết 1/64 Với mẫu huyết âm tính, hoàn toàn không xảy phản ứng ngưng kết Như loại bỏ kết duơng tính giả việc kiểm tra phản ứng hạt Latex gắn kháng nguyên tái tổ hợp Thioredoxin với huyết bệnh nhân Kết thực mong đợi, hoàn toàn phản ứng ngưng kết latex xảy mẫu huyết dương tính âm tính 4.3 Ứng dụng sinh phẩm chẩn đoán HIV Để đánh giá khả phát HIV từ sinh phẩm tạo tiến hành nghiên cứu thử nghiệm 50 mẫu huyết phòng thí nghiệm có chức khẳng định HIV dương tính theo quy định y tế Dựa kết xác định HIV từ bảng 3.3 tính độ nhạy độ đặc hiệu sinh phẩm mục 3.4 Ở ta thấy khả phát sinh phẩm cao với độ nhạy 100% độ đặc hiệu 97,5% So sánh với Kit nhanh chẩn đoán HIV thị trường Kit latex tạo có độ nhạy độ đặc hiệu tương đương Kit thử chẩn đoán HIV1/2 hãng ACON có độ nhạy 99.9% độ đặc hiệu 99,6%; Kit chẩn đoán nhanh BioTracer TM HIV 1/2 Rapid Card có kết độ nhạy > 99,8% độ đặc hiệu 99,9%; Test nhanh DETERMINE™ HIV-1/2 có độ nhạy 100%, độ đặc hiệu 99.75%… 38 4.4 Độ tương đồng khả phát Kit với huyết chuẩn Để đánh giá độ phù hợp Kit chẩn đoán, người ta dựa tương quan hệ số Kappa Nếu hệ số đạt từ 0,0 – 0,2 phù hợp ít, từ 0,3 – 0,4 phù hợp ít, từ 0,4 – 0,6 phù hợp vừa, từ 0,6 – 0,8 phù hợp khá, từ 0,8 – 1,0 phù hợp cao Trong nghiên cứu này, hệ số Kappa đạt 0,89 tính toán mục 3.5 Như kết luận sinh phẩm chẩn đoán HIV tạo đánh giá dựa mẫu huyết chuẩn có độ phù hợp cao 39 KẾT LUẬN Đã tạo sinh phẩm thử nghiệm chẩn đoán HIV dựa kỹ thuật ngưng hạt latex ứng dụng kháng nguywwn tái tổ hợp gp120, gp41 p24 Đánh giá độ tương đồng khả phát HIV sinh phẩm ngưng kết hạt latex kit nhập ngoại huyết bệnh nhân 40 KHUYẾN NGHỊ ứng dụng kháng nguyên tái tổ hợp tạo kit chẩn đoán HIV phổ rộng phục vụ chẩn đoán Nghiên cứu kỹ thuật chẩn đoán khác dựa ứng dụng kháng nguyên tái tổ hợp virus HIV 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1] Cẩm nang y khoa thực hành – Nguyễn Minh Tiến [288] [2] Giáo trình Vi sinh vật y học – GS TS Lê Huy Chính [3] Sinh học phân tử màng tế bào- tập - GS TS Đỗ Ngọc Liên(78,79) [4] Theo đề tài luận án tiến sĩ “HIỆU QUẢ CAN THIỆP DỰ PHÒNG LÂY TRUYỀN HIV Ở PHỤ NỮ MANG THAI TẠI HAI QUẬN, HUYỆN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH” BS Phan Thanh Xuân [5] Theo Tạp chí Y học dự phòng “Tình hình dịch HIV/AIDS năm 2013 Việt Nam” [6] Kỹ thuật xét nghiệm huyết học truyền máu ứng dụng lâm sàngGS.TSKH Đỗ Trung Phấn: trang 256 Tiếng Anh [7] Chan DC, Fass D, Berger JM, Kim PS (1997) "Core structure of gp41 from the HIV envelope glycoprotein" (PDF) Cell 89 (2): 263–73] [8] Klein, Joshua S.; Bjorkman, Pamela J.; Rall, Glenn F (27 May 2010) "Few and Far Between: How HIV May Be Evading Antibody Avidity" PLoS Pathogens 6] [9] Wyatt R, Sodroski J (1998) "The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens" Science 280 (5371): 1884–8.] Jamison DT, Feachem RG, Makgoba MW, et al., editors Washington (DC): World Bank; 2006 [10] GLOBAL HIV/AIDS RESPONSE Epidemic update and health sector progress towards Universal Access Progress Report 2011 42 [11] Comprehensive Cervical Cancer Control, a Guide to Essential Practice WHO 2006 (www.WHO.int): [9] [12] Chan DC, Kim PS (1998) "HIV entry and its inhibition" Cell 93 (5): 681–4] [13 ] Barman S, Ali A, Hui EK, Adhikary L, Nayak DP (2001) “Transport of viral proteins to the apical membranes and interaction of matrix protein with glycoproteins in the assembly of influenza viruses” Virus Res 77 (1): 61–9] [14] Hallenberger S, Bosch V, Angliker H, Shaw E, Klenk HD, Garten W (November 26, 1992) "Inhibition of furin-mediated cleavage activation of HIV-1 glycoprotein gp160" Nature 360 (6402): 358–61] [15 ] Gelderblom HR (1997) "Fine structure of HIV and SIV" (PDF) In Los Alamos National Laboratory HIV sequence compendium Los Alamos National Laboratory pp 31–44 [16] Schmidt, SD; Mazzella, MJ; Nixon, RA; Mathews, PM (2012) "Aβ measurement by enzyme-linked immunosorbent assay" Methods in Molecular Biology 849: 507–27 [11] Theo UNAIDS Report on the global AIDS epidemic | 2012 [12] Theo Biomed reseach internatinnal 2016 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4812187/) [13] Chan DC, Kim PS (1998) "HIV entry and its inhibition" Cell 93 (5): 681–4 43 [14] Wyatt R, Sodroski J (1998) "The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens" Science 280 (5371): 1884–8 [15] King Steven R (1994) "HIV: Virology and Mechanisms of disease" Annals of Emergency Medicine24: 443–449 [16] Mushahwar, Isa K (2007) Human Immunodeficiency Viruses: Molecular Virology, pathogenesis, diagnosis and treatment Perspectives in Medical Virology 13:75-87 [17] Zheng YH, Lovsin N, Peterlin BM (2005) "Newly identified host factors modulate HIV replication" Immunol Lett 97 (2): 225–34 [18] Kragstrup, Tue W; Vorup-Jensen, Thomas; Deleuran, Bent; Hvid, Malene (2013) "A simple set of validation steps identifies and removes false results in a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay caused by antianimal IgG antibodies in plasma from arthritis patients" SpringerPlus (1): 263 [19] Towbin H, Staehelin T, Gordon J (1979) "Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications" Proceedings of the National Academy of Sciences USA 76 (9): 4350–54 [20] Hướng dẫn quản lý, điều trị chăm sóc HIV/AIDS Bộ Y tế Quyết định số 3047/QĐ-BYT ngày 22-7-2015 [21] Poljak M1, Zener N, Seme K, Kristancic L (1997), Particle agglutination test "Serodia HIV-1/2" as a novel anti-HIV-1/2 screening test: comparative study on 3311 serum samples, Folia Biol Praha) ;43(4):171-3 [22] Renart J, Reiser J, Stark GR (1979) "Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure" Proceedings of the National Academy of Sciences USA 76 (7): 3116–20 44 [...]... hợp Mẫu không gắn kháng nguyên tái tổ hợp 27 Hình 3.5: Phản ứng ngưng kết hạt latex trên lam kính của 3 mẫu protein đã được gắn trên bề mặt hạt latex Mẫu 1: hạt latex có gắn protein tái tổ hợp gp120; mẫu 2: hạt latex có gắn protein tái tổ hợp gp41; mẫu 3: hạt latex có gắn protein tái tổ hợp p24 Kết quả trên cho thấy phản ứng phản ứng ngưng kết hạt latex có thể dễ dàng nhìn bằng mắt thường chỉ sau 5-10... 280nm Kết quả thu được trong bảng sau: Bảng 3.1 Nồng độ Protein tái tổ hợp được đo bằng máy Nanodrops Protein tái tổ hợp Nồng độ( mg/ml) () Gp120 0,614 Gp41 0,630 P24 0,661 3.1.2 Kiểm tra độ tinh sạch của Protein tái tổ hợp Để có thể ứng dụng các protein tái tổ hợp cho nghiên cứu vào ứng dụng tạo Kit chẩn đoán HIV bằng kỹ thuật ngưng kết hạt latex, trước tiên phải kiểm tra độ tinh sạch của protein tái tổ. .. gắn kháng nguyên được trộn với dung dịch chứa kháng thể kháng HIV theo tỷ lệ 1:1 và được so sánh với chứng âm là các hạt latex trộn với dung dịch PSB 26 Hình 3.4: Ảnh chụp dưới kính hiển vi sự ngưng kết của phức hợp hạt latex kháng nguyên -kháng thể sau khi trộn huyết thanh bệnh nhân HIV với huyền A B dịch hạt latex gắn kháng nguyên HIV Hạt latex có gắn kháng nguyên tái tổ hợp Mẫu không gắn kháng nguyên. .. nghiệm có kháng thể kháng HIV Tuy nhiên, đây là phương pháp có độ nhạy cao, do đó có thể cho những kết quả dương tính giả ELISA được ứng dụng để phát hiện các kháng thể IgG anti -HIV, IgA anti -HIV hoặc IgM anti -HIV bằng 3 kỹ thuật sau: Kỹ thuật ELISA gián tiếp Kháng thể kháng HIV trong máu bệnh nhân kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên HIV đã được cố định sẵn trên giá đỡ (ở các giếng phản ứng trên hạt nhựa)... protein tái tổ hợp Thực hiện quy trình gắn từng loại kháng nguyên tái tổ hợp lên hạt latex Phối trộn 3 loại hạt latex gắn kháng nguyên theo tỷ lệ 1:1:1 Tối ưu hóa điều kiện phản ứng ngưng kết Kiểm tra phản ứng ngưng kết với kháng thể bệnh nhân nhiễm HIV Đánh giá độ tương đồng của chế phẩm với các kit đang lưu hành - 2.4 Tiến trình triển khai nghiên cứu 2.4.1 Điện di kiểm tra chất lượng protein tái tổ hợp. .. chứng âm không có phản ứng ngưng kết xảy ra ngay cả trên kính hiển vi 3.3 Phối trộn 3 loại hạt latex được gắn 3 loại kháng nguyên Sau khi thử khả năng gắn kháng nguyên của từng loại tiến hành phối trộn 3 loại hạt latex có gắn 3 loại kháng nguyên ta được dung dịch hạt latex chứa cả ba loại kháng nguyên tái tổ hợp Gp120, gp41 và p24 có thể phục vụ cho chẩn đoán Để kiểm tra khả năng gắn cũng như tính kháng. .. sạch acid amine Kết quả xác định được nồng độ 3 dạng protein gp12, gp41 và p24 lần lượt là 0,614; 0,630; 0,661 chứng tỏ chất lượng mỗi loại protein tái tổ hợp đảm bảo yêu cầu sử dụng trong phản ứng ngưng kết hạt latex 35 4.1.3 Chế tạo sinh phẩm ngưng kết hạt latex chẩn đoán HIV Trong quy trình chuẩn, để xác nhận một mẫu là nhiễm HIV phải trải qua hai lần kiểm tra bằng kỹ thuật Elisa cho kết quả dương... protein tái tổ hợp đã tinh sạch Phân đoạn p24 được kiểm tra độ tinh sạch cũng tương ứng với thang chuẩn trên bản gel cho thấy độ tinh sạch của kháng nguyên tái tổ hợp p24 có độ tinh sạch cao 3.2 Kiểm tra khả năng gắn kháng nguyên lên bề mặt hạt latex Để đánh giá chất lượng kháng nguyên đã được gắn lên bề mặt hạt latex chúng tôi tiến hành thử phản ứng ngưng kết trên kháng thể kháng Trx Những hạt latex. .. mặt hạt latex Từng hỗn hợp sau phản ứng gắn được kiểm tra, đánh giá khả năng ngưng kết với kháng thể kháng thioredoxin theo quy trình Kết quả cho thấy chúng tôi đã gắn thành công 3 loại protein tái tổ hợp gp120, gp41 và p24 của HIV lên bề mặt hạt latex Tiếp theo chúng tôi phối trộn 3 loại hạt latex đã được gắn 3 loại kháng nguyên khác nhau theo tỷ lệ 1:1:1 để thu được một chế phẩm ngưng kết hạt latex. .. hợp vào lam thứ 2 - Nhỏ 1 giọt hạt latex gắn kháng nguyên thioredoxin tái tổ hợp vào lam thứ ba - Dùng pipet trộn đều các dung dịch trên lam kính - Ủ ở nhiệt độ phòng trong khoảng thời gian 10-15 phút 21 - Đọc kết quả bằng mắt thường và soi dưới kính hiển vi quang học - Ghi lại kết quả 2.4.4 Pha loãng dung dịch hạt latex gắn kháng nguyên tái tổ hợp của HIV - Tiến hành pha loãng chế phẩm gắn kháng nguyên