Xây dựng phương pháp nghiên cứu tối ưu nhằm phân tích sự đa dạng di truyền của giống loài hoàng liên gai (berberidaceae)

Trên thế giới đã có những nghiên cứu phân biệt các loài trong chi ở mức độphân tử đối với một số loài B.. Từ những lý do trên, việc nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền của cácgiống/loà

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến cô giáoThS Lưu Thúy Hòa, Viện Sinh – Nông, trường Đại học Hải Phòng và Ban lãnhđạo Viện Sinh – Nông, trường Đại học Hải Phòng đã nhiệt tình chỉ bảo, giúp đỡ

em rất nhiều và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình thực tập

Đồng thời em cũng xin được trân trọng cảm ơn các thầy giáo, cô giáo và cáccộng tác viên hiện đang công tác tại Bộ môn thực vật, Bộ môn Hóa phân tíchcủa Trường đại học Dược Hà Nội và Bộ môn Kỹ thuật di truyền của Viện Ditruyền nông nghiệp (thuộc Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam) đã tạo mọiđiều kiện thuận lợi cho em thực hiện những công việc liên quan trong quá trìnhthực tập

Cuối cùng, tôi cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, đặc biệt là ba mẹ đã luôn ởbên động viên, khích lệ tôi trong suốt quá trình thực tập này

Hải Phòng, ngày 2 tháng 6 năm 2016

Sinh viên

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH ẢNH, BIỂU ĐỒ

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism (Tính đa hình chiều

dài các phân đoạn được nhân bản)

DNA Deoxyribonucleic acid

dNTP Deoxyribonucleotit triphotphat

EDTA Ethylene Diamin Tetraaxetic Acid

PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)

RAPD Random Amplified Polymorphism DNA (Phân tích ADN đa

hình được nhân bản ngẫu nhiên)

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Phân tích chiều dải

các phân đoạn ADN cắt hạn chế)

SDS Sodium Dodecyl Sulphat

SSR Simple Sequence Repeats

STS Sequense Tagged Site

TAE Tris - Acetate - EDTA

Tris Trioxymetylaminometan

CTAB Cetyl trimethylammonium bromide

ISSRs Inter Simple Sequence Repeats

HPLC High Performance Liquid Chromatography

4

PHẦN 1: MỞ ĐẦU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Berberin là alcaloid có nhân isoquilolin (Khosla, 1992; Rastogi và cộng sự,1993) Đó là hoạt chất được ứng dụng từ lâu đời trong các nền y học truyềnthống trên thế giới để chữa các bệnh của các nước nghèo do đặc tính khángkhuẩn, nấm, đơn bào (Đỗ Huy Bích, 2006), berberin có thể sử dụng để chống lại

Staphylococcus aureus đã kháng kháng sinh Methicillin (Yu HH và cs, 2005),…

và ngày nay nó có tiềm năng rất lớn trong điều trị các bệnh đang phát triển như

hạ đường huyết (Wang Y và cs 2010, Gu Y và cs 2010 ), ung thư (Tang J và

cs 2009, Kim JB và cs 2009, Pinto-Garcia L và cs 2010).

Trên thế giới đã xác định khoảng 150 loài thực vật bậc cao có berberin,

thuộc 23 chi và 7 họ, bao gồm: Na (Annonaceae), Hoàng liên (Berberidaceae), Cải cần (Fumariaceae), Tiết dê (Menispermaceae), Thuốc phiện (Papaveraceae), Mao lương (Ranunculaceae), Cam (Rutaceae), trong đó các họ chủ yếu là Berberidaceae, Menispermaceae, Papaveraceae, Ranunculaceae và Rutaceae (Nguyễn Kim Cẩn, 2002)

Họ Berberidaceae là một họ thực vật có hoa, bao gồm 15-17 chi thực vật

có hoa Họ này thuộc bộ mao lương (Ranunculales) Họ này phân bố ở các

vùng ôn đới của phía bắc bán cầu (Judd và cộng sự, 1999) Họ Berberidaceaechứa khoảng 570-700 loài, trong đó phần lớn (khoảng 450-600 loài) thuộc về

chi Berberis Các loài trong họ là các cây thân gỗ, cây bụi hoặc cây thân thảo có

nguồn gốc từ các vùng ôn đới và cận nhiệt đới của châu Âu, châu Á, châu Phi,Bắc và Nam Mỹ (Ahrendt 1961)

Ở Việt Nam, đã xác định có 26 loài thực vật thuộc 5 họ khác nhau

chứa berberin là Berberidaceae, Menispermaceae, Ranunculaceae, Rutaceae Papaveraceae ( Nguyễn Kim Cẩn, 2002) Trong đó, các cây thuộc họ Berberidaceae bị khai thác triệt để để làm thuốc và buôn bán ở thị trường trong

nước để làm thuốc (Hoàng liên, Hoàng liên ô rô,…) và xuất khẩu qua TrungQuốc Điều này dẫn đã dẫn đến sự cạn kiệt nguồn tài nguyên các loài choberberin ở Việt Nam và trở thành những cây thuốc quý hiếm được ghi trongsách đỏ (Nguyễn Tiến Bân, 2007).

Việc phân loại các loài trong chi Berberis, Mahonia, Podophyllum trong họ Berberidaceae rất phức tạp với những đặc điểm hình thái giống nhau giữa các

loài trong cùng chi Sự phân biệt giữa các loài khó khăn do phần trăm đa bội cao

và do lai tạo (Cadic và Decourtye 1987) Điều này đã dẫn đến nhầm lẫn trongviệc xác định loài trong thu hái, sử dụng

Trên thế giới đã có những nghiên cứu phân biệt các loài trong chi ở mức độphân tử đối với một số loài B asiatica Roxb, B aristata DC., B lycium Royle(Subramani Paranthaman Balasubramani và cs, 2011; Vivek Tripathi và cs,

2013, ), loài Podophyllum hexandrum (Md Afroz và cs, 2009, Pradeep Kumar

Naik và cs, 2010; Akshay Nag và cs, 2013) hoặc so sánh các loài trong họ

Berberidaceae (C Roß và W Durka, 2006, Mehdi Rezaei và cs, 2011) nhưng

ở Việt Nam vẫn chưa có công trình nào trong nước nghiên cứu đánh giá, tư liệuhoá ở mức độ phân tử về đa dạng di truyền các tập đoàn cây này một cách sâurộng và có hệ thống

Từ những lý do trên, việc nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền của cácgiống/loài cho berberin trong họ Hoàng liên ở mức phân tử là cần thiết và cấpbách để định hướng cho công tác thu thập, bảo tồn khai thác và sử dụng cácnguồn gen cây bản địa quý này một cách có hiệu quả

1.2 MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU

1.2.1. Mục đích

Xây dựng phương pháp nghiên cứu tối ưu nhằm phân tích sự đa dạng di

truyền của giống/loài Hoàng liên gai (berberidaceae)

6

1.2.2. Yêu cầu

+ Điṇh danh chính xác các giống/loài Hoàng liên trên đăc c điểm hình thái

+ Xác định các chỉ thị đặc trưng, các alen hiếm nhận dạng chính xác cácgiống/loài Hoàng liên gai ưu tú

+ Đánh giá sự khác biệt di truyền giữa các giống/loài Hoàng liên gai qua việcphân tích RAPD với primer ngẫu nhiên

+ Mô tả quan hệ di truyền bằng phần mềm NTSYS

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 NGUỒN GỐC PHÂN LOẠI

Họ Hoàng mộc, còn gọi là họ Hoàng liên gai (Berberidaceae), là một họ

của khoảng 14-15 chi thực vật có hoa Họ này thuộc bộ Mao lương

(Ranunculales) Họ chứa khoảng 570-700 loài, trong đó phần lớn (khoảng

450-600 loài) thuộc về chi Berberis Các loài trong họ là các loại cây thân gỗ, cây

bụi hoặc cây thân thảo chủ yếu là thường xanh

Phân loại khoa học của họ Berberidaceae trong hệ thống phân loại thực

vật như sau (Lê Đình Bích và Trần Văn Ơn, 2007):

- Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)

- Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)

- Phân lớp Hoàng liên (Ranunculidae)

- Liên bộ Hoàng liên (Ranunculanae)

- Bộ Hoàng liên (Ranunculales)

- Họ Hoàng liên gai (Berberidaceae)

- Diphylleia - sơn hà diệp

- Dysosma - bát giác liên

- Epimedium - dâm dương hoắc

- Jeffersonia - tiên hoàng liên

- Leontice - mẫu đan (đơn) thảo, không nhầm với các loài hoa mẫu đơn

- Mahonia - hoàng liên ô rô, thổ hoàng liên, thổ hoàng bá

- Nandina - nam thiên trúc

- Podophyllum - Podophyllum tonkinense là bát giác liên

2.2 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ PHÂN BỐ HỌ CỦA HOÀNG LIÊN GAI

2.2.1. Đặc điểm chung của họ Hoàng liên gai (Berberidaceae)

8

Hoàng liên gai là loại cây cỏ nhiều năm, cây bụi hoặc cây gỗ nhỏ, thừờngxanh hoặc rụng lá Thân có hoặc không có gai Lá đơn hay kép, mọc so le, đốihoặc mọc ở gốc Lá kèm có hoặc không Gân lá hình lông chim hoặc hình chânvịt Hoa đều, lưỡng tính, mẫu 3, mọc thành cụm hoặc đơn độc Cụm hoa dạngchùm, bông, tán, xim, hoặc chùy Hoa có cuống hoặc không Lá bắc có hoặckhông Đài 6-9, thường dạng cánh hoa, rời, xếp 2-3 vòng Tràng 6, rời Tuyếnmật có hoặc không Nhị 6, đối diện tràng; bao phấn 2 ô, mở bằng 2 van hoặc nứtdọc Bầu trên, nhìn bên ngoài như có 1 lá noãn; noãn nhiều, hiếm khi 1, đínhnoãn mép hoặc gốc; vòi nhụy có hoặc không, đôi khi tồn tại ở quả

Quả mọng, quả nang hoặc quả đại Hạt 1 hoặc nhiều, nội nhũ phong phú

2.2.2. Đặc điểm thực vật chi Berberis

Cây bụi thường xanh hoặc rụng lá Thân cành trơn nhẵn hoặc có lôngmăng, có rãnh hoặc không, có gai hoặc không, gai đơn hoặc chia làm 3-5 nhánh

Lá đơn, mọc so le, mép có gai, nguyên hay cuốn ngoài

Hoa đơn độc hay mọc thành cụm, dạng chùm, tán hoặc chùy Hoa màuvàng bóng, da cam, vàng đo đỏ, hay vàng nhạt, có khi vàng lục Hoa mẫu 3; lábắc con thường 3, sớm rụng, dạng vảy Đài 6, hiếm khi 3 hoặc 9, màu vàng.Tràng 6, màu vàng, móng có mật Nhị đối diện tràng; bao phấn mở bằng van.Bầu nhụy đối xứng dạng chùy; noãn 1-12, hiếm khi 15; vòi nhụy rất ngắn Quảmọng, thường màu đỏ, đỏ sẫm hoặc đen; hình cầu, hình elip, thuôn dài, hìnhtrứng hoặc trứng ngƣợc; kích thước 6-20mm; vòi nhụy tồn tại hoặc không Hạt1-10, màu nâu đến nâu đỏ hoặc đen, không có áo hạt (Võ Văn Chi, 2003; YingTsunshen, 2011)

Hình 2.1: Chi Berberis

Ở nước ta loài Berberis phân bố chủ yếu ở Sapa, trên núi Phan-xi-păng

vùng Bắc Hà thuộc tỉnh Lào Cai Cây mọc trong rừng kín thường xanh mưa mùa

ẩm, rừng núi đá, ở độ cao khoảng 1000-1600m Mùa hoa tháng 5-6, mùa quảtháng 6-10 (Võ Văn Chi, 2003)

2.2.3. Đặc điểm thực vật của chi Mahonia

Cây bụi hoặc cây gỗ nhỏ, thường xanh, cao 0,3 – 8 m Không gai

Lá kép hình lông chim lẻ, mọc so le, không cuống hoặc có cuống; lá chét 3 -4;

lá chét bên thường không cuống, lá chét tận cùng có cuống hoặc không cuống;mép lá nguyên hay có khía răng thô hay đẹp Cụm hoa mọc ở tận cùng, (1-) 3 –

18 chùm đơn hay phân nhánh, dài 3 – 35 cm, mọc đối diện với lá bắc Cuốnghoa dài 1,5 – 24 mm, đối diện với lá bắc, lá bắc ngắn hay dài hơn cuống hoa.Hoa màu vàng, lá đài xếp ba vòng, cánh hoa xếp một vòng, gốc cánh hoa

có hay không có tuyến Trung đới không kéo dài, nhọn đột ngột hay kéo dài

ra rõ ràng Bầu hình gần cầu, noãn 1 – 7, vòi nhụy không có hoặc dài tới 3 mm,

10

tồn tại ở quả Quả mọng, hơi xanh hay đen, thường có phấn Hạt 1 -7 (PrabhakarP.K, Doble M., 2009).

Chi Mahonia phân bố chủ yếu ở Đông và Đông Nam Á, ngoài ra còn có ở

Tây Bắc Mỹ, Trung Mỹ và Tây Nam Mỹ Ở Trung Quốc có 31 loài (Ying

Junsheng và cs, 2011), ở Đài Loan có 2 loài (Sheng You Lu and Yuen Po Yang,

2003). Ở Việt Nam, chi Mahonia phân bố ở các khu vực Bắc Kạn, Lai Châu,

Lào Cai, Hà Giang, Cao Bằng, Lâm Đồng

Hình 2.2 Chi Mahonia

2.2.4. Đặc điểm thực vật chi Podophyllum

Podophyllum là một chi của các loài cây lâu năm thân thảo trong họBerberidaceae có nguồn gốc Đông Á và Đông Bắc Mỹ

Cây thảo sống nhiều năm, cao 30 - 50cm, thân rễ thô to, mọc ngang Thânthường mang một đến hai lá, đính lá dạng ngù Phiến lá rộng đến 30cm, có 4 - 9thùy nông, thùy dạng tam giác rộng hoặc hình tròn dài dạng trứng, đỉnh nhọnsắc, mép lá có răng nhỏ Hoa màu hồng đậm, gồm 5 - 8 hoa mọc tập trung ở gốc

lá, hoa rủ xuống, cuống hoa nhỏ, dài, cong Lá đài 6, mặt ngoài có ít lông dài.Cánh hoa 6 dài 2cm Nhị 6 Bầu thượng, đầu nhụy to, quả mọng hình bầu dụchoặc hình trứng Hạt nhiều

Mùa hoa tháng 3 - 5, mùa quả chín tháng 7 - 9 Cây tái sinh bằng chồi từthân rễ vào vụ xuân hè Cây sống dưới tán rừng ẩm trên núi, ở độ cao 800 - 900

m Mọc rải rác trên đất rừng nhiều mùn, ẩm, độ chiếu sáng yếu

Ở Việt Nam các loài Podophyllum phân bố chủ yếu ở Hoà Bình (Đà bắc:

Chợ Bờ), Hà Tây (Ba Vì), Lạng Sơn (núi Khau Khú)

Hình 2.3: Chi Podophyllum

2.3 CÔNG DỤNG VÀ TÌNH HÌNH KHÁ THÁC SỬ DỤNG CỦA CÁC LOÀI CHỨA BERBERIN

Berberin là alcaloid có nhân isoquilolin, có trong khoảng 150 loài thực vậtbậc cao (Nguyễn Kim Cẩn, 2002; Phạm Thanh Kỳ, 2002)

12

Nó là hoạt chất được ứng dụng từ lâu đời trong các nền y học truyền thốngtrên thế giới để chữa các bệnh của các nước nghèo do đặc tính kháng khuẩn,nấm, đơn bào,…và ngày nay nó có tiềm năng rất lớn trong điều trị các bệnhđang phát triển như tiểu đường, ung thư, tăng mỡ máu,… Các tác dụng đã đượcchứng minh của berberin bao gồm:

(1) Tác dụng kháng khuẩn (Đỗ Huy Bích, 2006) (Yu HH, Kim KJ, Cha JD

(5) Tác dụng bảo vệ gan (Chang XX và cs., 2009) (Sun X và cs, 2009)

.v.v

Với các tác dụng truyền thống và các các tác dụng mới phát hiện trong điềutrị tiểu đường và ung thư cũng như tính an toàn trong sử dụng, berberin ngàycàng được sử dụng nhiều trên thế giới cũng như ở Việt Nam với hàng chục sảnphẩm đang được sản xuất tại các công ty Dược trong nước Điều này dẫn đếnviệc khai thác ồ ạt nguồn cho thực vật cho beberin tự nhiên Đó là một trongnhững nguyên nhân quan trọng dẫn đến suy kiệt những nguồn gen này

2.4 TỔNG QUAN VỀ NHỮNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ PHỔ BIẾN DÙNG

ĐỂ PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN

2.4.1. Phương pháp chỉ thị hình thái

Gen - thể hiện bản chất di truyền, thường thể hiện một hay nhiều tính trạng

có thể đo đếm được – gen đó xem như gen chỉ thị Chỉ thị hình thái là một trongnhững phương pháp sơ khai trong việc đánh giá sự đa dạng di truyền

Tuy nhiên, số chỉ thị hình thái hiện diện trong tự nhiên cũng rất ít, khôngthỏa mãn yêu cầu của nhiều chương trình chọn giống và chỉ có quy mô hình thái

(cơ 19 quan) hoặc ở giai đoạn phát triển đặc biệt của cá thể Sự thể hiện các chỉthị hình thái bị ảnh hưởng bởi điều kiện môi trường, điều này làm cho chỉ thịhình thái kém thu hút trong cải tiến giống cây trồng.

2.4.2. Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN

RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism, Đa hình chiều dài cácmảnh phân cắt giới hạn Các đa hình RFLP sinh ra bởi những đột biến tự nhiên ởnhững điểm cắt enzym giới hạn trong ADN bộ gen Mỗi loài sinh vật có một bộADN genom đặc hiệu trong cấu trúc, vì vậy khi sử dụng những enzym giới hạn

để cắt phân tử ADN của hệ gen, người ta có thể nhận biết được những đoạnADN có chiều dài khác nhau bằng kỹ thuật lai ADN với những mẫu dò (probe).Đây là nguyên lý kỹ thuật RFLP

Chỉ thị RFLP là chỉ thị đồng trội, nghĩa là có khả năng biểu hiện tất cả cácalen của cùng một locus Do vậy, có thể phân biệt được các cá thể đồng hợp tử(AA hoặc aa) và các cá thể dị hợp tử (Aa) Đây là đặc điểm ưu việt của loại chỉthị này Hạn chế của phương pháp này là tiêu tốn nhiều thời gian và sức lực, đòihỏi nhiều trang thiết bị phòng thí nghiệm, đặc biệt là tiêu hao một lượng lớnADN mà số lượng đa hình thu được rất ít ỏi, thậm chí ở một số loài khó nhậnđược đa hình

2.4.3. Chỉ thị phân tử dựa trên kỹ thuật PCR

Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction - PCR) được Karyphát minh năm 1985 (Kary Mullis và cs., 1985; 1990) Phương pháp này đãnhanh chóng được sử dụng hầu hết ở các phòng thí nghiệm trên toàn thế giới(Nair và cs., 1996) Nhờ vào việc phát hiện ra loại enzym chịu nhiệt được tách

từ một loại vi khuẩn sống ở suối nước nóng có tên là Thermus aquaticus hoạt

động tốt nhất ở nhiệt độ 70-800C, người ta đã kết hợp với những tính chất cơ bảncủa ADN là có khả năng duỗi xoắn ở một nhiệt độ thích hợp, có khả năng bắtcặp với những đoạn ADN có trình tự nucleotit bổ sung với đoạn ADN khuôn14

mẫu và có khả năng nhân đôi dưới xúc tác của enzym đặc hiệu để nhân bộinhững đoạn ADN khuôn mẫu Phản ứng PCR dựa trên nguyên tắc tổng hợp

ADN nhờ enzym ADN Polymerase chịu nhiệt (Taq, Pfu…) với sự có mặt của

đoạn ADN khuôn mẫu, ADN mồi, các nucleotit (dNTP) gồm dATP, dCTP,dGTP, dTTP và ion Mg2+ hoạt động như một chất xúc tác Tuỳ theo bản chất củanhững đoạn mồi sử dụng mà có những hệ thống chỉ thị đặc trưng gồm chỉ thịSTS, RAPD, SSR, AFLP,v.v… Việc sáng chế ra máy PCR sau đó giúp thựchiện được những phản ứng nhân bội AND dễ dàng

2.4.4. Chỉ thị STS (Sequence Tagged Sites)

STS Olson nêu ra lần đầu tiên vào năm 1989 để nghiên cứu lập bản đồ gen

ở người ngay sau khi kỹ thuật PCR ra đời (Olson M và cs., 1989) STS đượcđưa ra nhờ việc xác định trình tự 2 đầu các đoạn mẫu dò RFLP, trên cơ sở đóngười ra thiết kế mồi dùng cho phản ứng PCR

2.4.5. Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic ADN)

RAPD được sinh ra bởi phản ứng PCR, do sự nhân bội những đoạn ADN

hệ gen, sử dụng những đoạn mồi đơn lẻ, ngẫu nhiên (random primer) dài khoảng9-10 nucleotit dưới nhiệt độ kết cặp thấp (khoảng 370C) (Williams và cs., 1990).Sản phẩm của phản ứng được phân tách bằng điện di trên gel agarose, nhuộmtrong ethidium bromide và quan sát dưới tia cực tím RAPD sinh ra những chỉthị trội bởi sự có mặt hay vắng mặt những alen ADN đặc trưng Hạn chế của loạichỉ thị này so với chỉ thị đồng trội RFLP là không phân biệt được thể dị hợp tử.Mặc dù vậy, chỉ thị này vẫn là một công cụ hữu hiệu trong việc lập bản đồ ởnhững dòng nhị bội, những dòng cận phối hay các quần thể lai trở lại Lợi thếcủa loại chỉ thị này là không cần biết những thông tin về trình tự (William và cs.,1993) Chỉ thị RAPD còn có thể sử dụng trong việc điền vào những chỗ trốngtrên bản đồ phân tử RFLP (Chang và Meyerowitz, 1991), lập bản đồ gen khángđạo ôn ở lúa (Naqvi và cs., 1995)

- Những ưu điểm của kỹ thuật RAPD

Về mặt kỹ thuật: Kỹ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành công do khôngcần biết trước trình tự bộ gene của đối tượng cần nghiên cứu, thao tác đơn giản,chất lượng.

ADN khuôn không cần độ tinh sạch cao Thời gian thực hiện nhanh, khảnăng nhân bản cao

Về mặt kinh tế: Chi phí thực hiện thấp Kỹ thuật RAPD thường được sửdụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền vànhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao

Do chỉ thị RAPD có hạn chế là độ nhạy bị phụ thuộc vào điều kiện củaphản ứng, đôi khi kết quả không lặp lại được, nên người ta đã khắc phục bằngcách nhân dòng những alen RAPD đặc hiệu, xác định trình tự của chúng rồi thiết

kế những đoạn mồi dài khoảng 20bp từ cả hai đầu và gọi là chỉ thị SCARs(Sequence Characterized Amplified Region)

- Ứng dụng cũa kỹ thuật RAPD

Kỹ thuật RAPD được phát minh và sử dụng ngay sau khi kỹ thuật PCR ra đời,mặc dù cho kết quả có độ tin cậy không cao nhưng vẫn còn được sử dụng do ưuđiểm dễ thực hiện và chi phí thấp

Những ứng dụng của kỹ thuật RAPD: Đánh giá đa dạng di truyền: đã được ápdụng trên các đối tượng: cúc lai, cà phê, bắp, đậu nành, lúa mì, lúa mạch, dâu tây,khoai tây, cà chua,vv Cần quan tâm đến yếu tố nồng độ ADN, điều kiện thínghiệm, chương trình chạy PCR và cần lựa chọn primer thích hợp cho sự đa hìnhcao Đối với nấm bệnh thực vật thì kỹ thuật RAPD đã được áp dụng để phân tích

đa dạng di truyền của nhiều loại nấm khác nhau: Leptosphaeria maculans (Desm.)Ces.etde Not, Corynespora cassiicola

Nhận diện chỉ thị phân tử: ở Việt Nam, nghiên cứu đa dạng di truyền vàmối tương quan giữa kiểu gen RGA và kiểu hình phản ánh bệnh đạo ôn của một

số giống lúa ở Việt Nam (Nguyễn Thị Lang, 2002) Ngoài ra kỹ thuật RAPDcòn được áp dụng xây dựng bản đồ gen (Nguyễn Thị Lang, 2002)

16

- Những cải tiến của kỹ thuật RAPD

Đã có vài cải tiến của kỹ thuật RAPD được mô tả Kỹ thuật thứ nhất là sửdụng cùng lúc 2 primer khác nhau thay vì sử dụng 1 primer như kỹ thuật RAPDthông thường Phương pháp này có thể làm tăng hoặc giảm đi số alen so với khi

sử dụng một primer Việc lựa chọn, sử dụng cùng lúc 2 primer khác nhau mộtcách phù hợp cũng có thể làm tăng tính đa hình của những primer cho sản phẩm

ít đa hình Cải tiến thứ 2 là cắt ADN bằng các enzyme giới hạn trước hoặc saukhi thực hiện phản ứng PCR Sự cắt này cũng có thể tạo ra hai kết quả Một là

có thể làm giảm số lượng các alen khó xác định (complex band), điều đó làm dễdàng hơn cho việc đánh giá đa dạng di truyền Hai là tạo ra sự đa hình ở các mẫu

có hạn chế về sự đa hình Tuy nhiên việc sử dụng những cải tiến tuỳ thuộc vàochiến lược nhằm làm tăng số chỉ thị đa hình có thể hoặc đạt được các chỉ thịđồng trội Những cải tiến này có hạn chế là làm giảm đi lợi thế của kỹ thuậtRAPD cụ thể là tốc độ, giá thành và sử dụng phức tạp hơn (Kurt Weising và cs,1995)

Hình 2.4:Nguyên lí của phản ứng RAPD

2.4.6. Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

AFLP được sử dụng rộng rãi trong những nghiên cứu lập bản đồ gen và xácđịnh chỉ thị phân tử liên kết gen Kỹ thuật tạo ra các loại chỉ thị này được gọi lànhân bội chọn lọc những mảnh cắt giới hạn (Selective Restriction FragmentAmplication - SRFA) Phương pháp linh hoạt này có thể phát hiện được sự cómặt của những mảnh cắt giới hạn trong bất kỳ loại ADN nào (Vos và cs., 1995) Nguyên lý của kỹ thuật SRFA dựa trên cơ sở nhân bội có chọn lọc nhữngmảnh cắt giới hạn từ ADN hệ gen Kỹ thuật này bao gồm ba bước:

- Bước 1: ADN hệ gen được cắt bằng hai loại enzym, một enzym cắt hiếm (a

rare cutter) ví dụ như PstI hoặc EcoRI và một enzym cắt thường (a frequent cutter) như MseI, TaqI Kết quả là sinh ra những mảnh cắt có một đầu là trình tự

cắt hiếm và một đầu là trình tự cắt thường Sau đó gắn bộ thích ứng (adapter)vào hai đầu mảnh cắt Các bộ thích ứng AFLP bao gồm hai phần: phần cốt lõi(core sequence) và chuỗi trình tự đặc hiệu của enzym Vị trí nhận biết củaenzym giới hạn trên các bộ thích ứng được loại bỏ bằng cách thay đổi một gốc

base ở đầu 5’ Ví dụ vị trí nhận biết của enzym giới hạn EcoRI là

5’-GAATTC-3’, nhưng G trên bộ thích ứng được thay bằng C, do vậy mà sau khi đã gắn bộthích ứng vào mảnh ADN hệ gen thì vị trí này không thể bị cắt một lần nữa vì đã

mất vị trí đặc hiệu Tương tự như vậy, vị trí nhận biết của enzym giới hạn MseI

là 5’-TTAA-3” Nhưng gốc T ở đầu 5’ trên bộ thích ứng được thay bằng G Nhờ

kỹ thuật này mà ADN hệ gen có thể được cắt và gắn đồng thời Khi cắt ADN hệ

gen bằng hai enzym EcoRI và MseI, sẽ có 3 loại mảnh cắt gồm: mảnh có hai đầu cắt bởi MseI, mảnh có hai đầu cắt bởi EcoRI, mảnh cắt có một đầu là EcoRI và một đầu là MseI.

- Bước 2: Nhân bội những mảnh cắt giới hạn sử dụng mồi đặc hiệu bổ sungvới trình tự của bộ thích ứng và trình tự giới hạn của enzym Bước này đượcthực hiện nhằm giảm bớt số lượng quá lớn của các mảnh ADN sau khi cắt vàgắn bộ thích ứng Sự nhận bội chọn lọc đạt được bởi sử dụng những mồi được

18

kéo dài phía điểm cắt giới hạn bằng cách thêm các nucleotid vào vị trí cắt Dovậy mà chỉ có những mảnh ADN có trình tự bổ trợ với các base thêm vào mớiđược nhân bội Phản ứng thứ nhất gọi là nhân bội sơ bộ (pre-amplification) haytiền nhân bội Phản ứng thứ hai gọi là nhân bội chọn lọc (selective PCR) Cácmồi AFLP gồm có ba phần: Chuỗi cốt lõi (CORE), chuỗi đặc hiệu enzym (ENZ)

và phần thêm vào các nucleotit chọn lọc (EXT)

Sử dụng phương pháp này có thể tạo ra một bộ tập hợp những mảnh cắtgiới hạn nhờ PCR mà không cần biết trình tự của chúng, cho phép nhân đặc hiệumột số lượng lớn những mảnh cắt giới hạn Một bộ gồm tập hợp lượng lớnnhững mảnh cắt ADN có thể phân tích đồng thời, phụ thuộc vào độ phân giảicủa hệ thống phát hiện

- Bước 3: Điện di các sản phẩm của phản ứng PCR nhờ hệ thống chạy điện

di trên gel polyacrylamit Thường là từ 50-100 mảnh cắt giới hạn được nhân lên

và phát hiện trên gel polyacrylamit biến tính nhờ sử dụng đồng vị phóng xạhoặc nhuộm bạc Kỹ thuật AFLP cung cấp khả năng nhận dạng ADN lý tưởng

từ ADN của bất kỳ nguồn gốc nào Đây là một kỹ thuật thiết thực và đáng tincậy bởi sự nghiêm ngặt của điều kiện phản ứng

Tính hợp lý của việc sử dụng hai enzym cắt là ở chỗ: 1) Enzym cắt thường

sẽ sinh ra những đoạn ADN ngắn, nằm trong miền kích thước lý tưởng cho việcnhân bội và phân tách trên gel polyacrylamit; 2) Số lượng các mảnh ADN đượcnhân bội sẽ giảm xuống nhờ sử dụng enzym cắt thường bởi vì chỉ có nhữngmảnh cắt bởi một đầu là enzym cắt hiếm và một đầu là enzym cắt thường mớiđược nhân lên; 3) Việc đánh dấu một đầu của mồi ngăn cản sự xuất hiện alenkép; 4) Sử dụng hai loại mồi sinh ra tính linh hoạt lớn trong việc điều chỉnh sốlượng ADN nhân bội 5) Một lượng lớn đa hình khác nhau có thể được sinh rakhi nhân bội bằng những tổ hợp mồi khác nhau

Tính đặc hiệu của loại đa hình này còn thể hiện bởi trình tự đặc hiệu và sốlượng của các nucleotit được thêm vào đầu 3’ của mỗi mồi Theo tính toán, cứ

thêm một nucleotit vào mồi AFLP thì số lượng các chủng loại alen ADN nhânbội trong phản ứng PCR lại giảm xuống 4 lần vì trong số các mảnh ADN chỉ cómột trong 4 nucleotit được chọn lọc và nhân bội Như vậy là thêm 2 nucleotitvào đầu của mỗi mồi thì số lượng các chủng loại alen ADN giảm xuống 16 lần,nếu thêm vào 3 nucleotit thì số lượng alen giảm xuống 64 lần Việc thêm cácnucleotit vào 2 đầu của các mồi AFLP dẫn đến kết quả là tạo ra những bộ phụ(subset) của bộ đa hình gốc Điều này chỉ ra rằng việc cho thêm các nucleotit lựachọn là con đường chính xác và có hiệu quả để lựa chọn một bộ đặc hiệu nhữngmảnh cắt cho quá trình nhân bội Kỹ thuật AFLP có thể tạo ra số lượng chỉ thị ditruyền nhiều nhất so với các kỹ thuật khác đối với mỗi tổ hợp mồi Lượng ADNtổng số tiêu tốn cho kỹ thuật này lại rất ít Đây là một phương pháp có hiệu quả

cả trong nghiên cứu đa dạng di truyền, tìm chỉ thị liên kết và lập bản đồ gen.Tuy nhiên AFLP là chỉ thị di truyền trội, do đó không thể phân biệt giữa thểđồng hợp tử và dị hợp tử, và giá thành cho nghiên cứu là tương đối cao

20

Hình 2.5: Nguyên lí của phản ứng AFLP

2.4.7. Chỉ thị vi vệ tinh (SSR)

Chỉ thị vi vệ tinh, là những đoạn ADN lặp lại một cách có trật tự, gồmnhững đơn vị lặp lại gồm từ 1 đến 6 nucleotit, theo kiểu lặp lại ngắn SSR đãđược nghiên cứu lần đầu tiên trên người (Hamada và Kakunaga, 1982; Weber vàcs., 1989), và cho đến nay nó được tìm thấy trong các hệ gen của một số cơ thểEukaryot khác như các gia cầm, động vật có vú (Cheng và cs., 1994; Love và

cs., 1990; Moran, 1993; Serikawa và cs., 1992), cá và trên vài loài cây một lámầm và hai lá mầm (Morgante và cs., 1993; Wang và cs., 1994) Bản chất đahình của SSR có thể được sinh ra do sự nhân bội từ ADN tổng số của hệ gennhờ sử dụng 2 đoạn mồi bổ trợ với trình tự gần kề hai đầu của vùng lặp lại Giátrị của SSR là ở chỗ nó sinh ra đa hình từ rất nhiều vùng tương ứng, bao phủrộng khắp hệ gen và có bản chất đồng trội, dễ dàng phát hiện bằng PCR Nhữngchuỗi đa hình đơn giản này đã được ứng dụng trong việc lập bản đồ ở cả hai đốitượng động vật và thực vật (Tautz và Renz, 1984) Ở người, SSR được gọi là thế

hệ thứ hai của các chỉ thị phân tử Ở thực vật, tần số và số lượng SSR đã đượcxác định trên các cây rừng nhiệt đới, cây bắp cải (Lagercrantz và cs., 1993), lúa

mì (Roder và cs., 1995) và 34 giống cây trồng khác (Morgante và Oliveri, 1993).Những kết quả nghiên cứu này đã chỉ ra rằng ở thực vật, SSR mang trình tự lặplại (AT)n nhiều hơn so với ở động vật, trong khi ở những loài động vật thì lạigiàu SSR kiểu (GT)n hơn Những nghiên cứu trên lúa (Wu và Tanksley, 1993),

ngô (Senio và Heun, 1993) và Arabidopsis cũng cho kết quả tương tự Nghiên

cứu sàng lọc thư viện genome lúa cho thấy có khoảng 5.700-10.000 vi vệ tinh ởlúa (McCouch và cs., 1997)

Hình 2.6: Nguyên lí của phản ứng microsatellite

22

Bước 1: phá vỡ màng tế bào và màng nhân.

Bước 2: loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, như các protein,polycharide

Bước 3: tủa axit nucleic

Bước 4: hòa tan cặn DNA

- Yêu cầu:

+ DNA đảm bảo độ tinh khiết

+ Đảm bảo nguyên vẹn về cấu trúc để thực hiện các bước nghiên cứu tiếp

- Tách chiết DNA mô thực vật bằng phương pháp cơ học:

Bước 1: phá vỡ màng tế bào và màng nhân bằng cách cho dung dịch phá tế bào

và protenase K

Bước 2: loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, như các protein,polycharide Mẫu được bổ sung hỗn hợp dung dịch(phenol: chloroform:isoamylalcohol), lắc mạnh cho đến khi dung dịch có màu trắng sữa

Sau ly tâm cao tốc hỗn hợp dung dịch chia làm 3 pha:

+ Pha trên là dung dịch lỏng chứa DNA

+ Pha giữa là phần dung dịch chứa protein và các chất thứ cấp bị kết tủa

+ Pha dưới đáy chứa hóa chất

Bước 3: tủa axit nucleic

Tủa bằng cồn tuyệt đối (tỉ lệ 2:1), tủa tốt nhất ở -20 oC trong 30 phút hoặc

0 oC qua đêm Hầu như các phân tử DNA đều bị kết tủa

Tủa bằng isopropanol (tỉ lệ 1:1) ở 0oC các phân tử DNA có trọng lượngphân tử thấp không bị kết tủa

Sau đó ly tâm sẽ thu được cặn(DNA và RNA) và cặn được rửa bằng cồn 70% đểloại bỏ muối và isopropanol còn lại

Bước 4: hòa tan cặn và xử lý loại bỏ RNA bằng enzyme Rnase Sau đó kết tủalại được DNA.

2.5.1.2.Tủa và tinh sạch DNA bằng muối natri acetate và ethanol

- Nguyên lý: khi có mặt của cation đơn hóa trị và 2-3 lần thể tích cồn tuyệt đối thì

các axit nucleic trong dung dịch sẽ tủa xuống ở nhiệt độ thấp từ 0 oC- 70 oC Thờigian ủ càng lâu thì hiệu suất thu hồi axit nucleic càng lớn Thông thường ta ủqua đêm ở nhiệt độ -20 oC Axit nucleic sẽ lắng xuống khi ly tâm ở nhiệt độ 4 oC.Tiếp theo là rửa tủa ở cồn 70% Sau khi ly tâm ngắn, lượng muối dư và nướcđược gạn bỏ

- Phương pháp tiến hành:

+ Thêm 1/10 lần thể tích dung dịch muối natri acetate(NaOAc) và 2 lần thể +tích cồn tuyệt đối vào dung dịch axit nucleic để tủa

+ Ủ 30 phút ở nhiệt độ -70 oC hoặc qua đêm ở nhiệt độ -20 oC

+ Ly tâm 15 phút ở nhiệt độ 4 oC với tốc độ 14000 vòng/phút Gạn bỏ từ từdịch nổi và úp ngược ống xuống khăn giấy để làm khô

+ Thêm 2 lần thể tích ethanol 80%, ủ 5-10 phút ở nhiệt độ phòng Sau khi lytâm 5 phút, gạn bỏ và làm khô ống ly tâm như trên

+ Đặt máy ly tâm vào máy đông khô chân không, làm khô axit nucleickhoảng 5-10 phút hoặc cho tới khi mẫu khô hoàn toàn

+ Hòa tan axit nucleic trong đệm TE

2.5.2. Điện di.

Phương pháp điện di trong gel(keo) thường được sử dụng để phân li DNA,RNA,oligonucleotide,protein… Sau đó có thể tinh chế các chất đó Việc phân licác chất dựa trên hình thái và độ lớn các chất

Thông thường sử dụng gel agarose và polyacrylamide nhưng gel agarosecho phép phân li nucleic acid lớn hơn 1kb còn polyacrlamide dùng để phân licác đoạn acid nucleic nhỏ hơn 1kb

- Nguyên lý:

24

Khi ở trong điện trường, do tích điện (-) nên các phân tử DNA dịch chuyển

về phía cực(+) và với tốc độ khác nhau phụ thuộc vào khối lượng phân tử Cácđoạn DNA càng lớn thì dịch chuyển càng chậm Kết quả là từ một điểm chungcác đoạn DNA khác nhau dịch chuyển về một hướng tạo thành một làn, và trênlàn đó có các đoạn DNA khác nhau phân bố ở các vị trí khác nhau tương ứngvới độ lớn của chúng

- Quy trình điện di:

+ Chuẩn bị gel: Cho 0.8 g agaroza vào 100 ml dung dịch đệm TAE 1x Đuncho agaroze tan hoàn toàn Để nguội 50 – 600C, đổ dung dịch agaroza vào khuôngel đã cài sẵn răng lược Sau 30 – 60 phút, khi gel đã đông cứng đặt vào bể điện

di Đổ đệm TAE 1x ngập cách mặt gel từ 1 – 2 mm, rút lược ra

+ Tra mẫu agaroza: Mẫu ADN trộn 1.5 ml màu bromophenol blue và đượctra vào các giếng trên gel Chạy điện di cùng thang marker chuẩn để xác địnhkích thước phân tử

+ Chạy điện di: 100V-40mA Quan sát màu bromophenol blue để xác địnhthời gian dừng

+ Nhuộm ADN: Bản gel được lấy nhẹ ra khỏi khuôn gel và ngâm vào dungdịch EtBr nồng độ 0.5 mg/ml trong 10 phút và được lắc nhẹ trên máy lắc Sau đórửa sạch bản gel bằng nước cất

+ Quan sát và chụp ảnh: Bản gel được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại 254

nm và trên máy soi ADN Quan sát thấy ADN hiện lên dưới dạng các vạch sáng

và được chụp trên máy GDS 8000

2.5.3. Phương pháp PCR

2.5.3.1.Khái niệm chung

Kỹ thuật PCR do Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 Đây là kỹ thuậtcủa sinh học phân tử cho phép nhân bản một đoạn ADN mong muốn từ hệ genADN của cơ thể sinh vật thành nhiều bản sao

2.5.3.2.Các lĩnh vực ứng dụng

- Nguyên cứu khoa học

+ Xác định các đoạn trình tự cần nghiên cứu

+ Phát hiện đột biến

+ Nghiên cứu quá trình tiến hoá phân tử

+ Phục hồi các gen đã tồn tại hàng triệu năm

+ Chọn giống vật nuôi, cây trồng

+ Lựa chọn các cặp cha mẹ thuần chủng trong thời gian ngắn

+ Đa dạng sinh học

- Xác định các loài mới, các loài đặc hữu bằng phương pháp di truyền phân

tử

- Y học - Khoa học hình sự

+ Chuẩn đoán chính xác các bệnh nhiễm trùng từ vi khuẩn, nấm, virus

+ Chuẩn đoán sớm các bệnh gây ra do ung thư, các bệnh di truyền

+ Xác định huyết thống, truy tìm dấu vết tội phạm

2.5.3.3.Nguyên tắc của phản ứng PCR

Nguyên tắc của phản ứng PCR là sử dụng ADN polymerase chịu nhiệt đểtổng hợp trong ống nghiệm các đoạn ADN mới từ mạch khuôn trong môi trường

dư thừa dNTPs và các cặp mồi đặc hiệu

- Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ có 3 giai đoạn:

+ Giai đoạn tháo xoắn: ở nhiệt độ khoảng 92 –95 oC thì hai mạch đơn củachuỗi xuắn kép tách nhau thành hai mạch riêng rẽ tạo điều kiện cho sự bắt cặpcủa các đoạn mồi Giai đoạn này kéo dài từ 30 giây đến 1 phút

+ Giai đoạn gắn mồi: Khi hạ nhiệt độ xuống 45 – 65oC trong thời gian 1phút , các đoạn mồi sẽ bắt cặp với mạch đn ADN khuôn mẫu ở vị trí bổ xung

26

+ Giai đoạn kéo dài chuỗi: ở nhiệt độ 72oC là nhiệt độ tối ưu cho những hoạtđộng của ADN polymerase Dưới sự xúc tác của ADN polymerase những đoạnmồi đã bắt cặp với ADN khuôn mẫu sẽ được kéo dài

Các đoạn ADN mới được hình thành lại được sử làm khuôn để tổng hợp cho cácchu kỳ tiếp theo

Như vậy số lượng bản sao sẽ tăng gấp 2 sau mỗi chu kỳ và sau n chu kỳ,tính theo lý thuyết số lượng bản sao là 2n

- Phản ứng PCR yêu cầu:

+ ADN khuôn mẫu

+ Hai đoạn mồi đặc hiệu có chiều dài từ 15 – 30 nucleotit

+ Bốn loại deoxyribonucleotit triphosphat (dATP, dTTP, dGTP, dCTP)

+ Enzym ADN polymerase

Hình 2.7: Giao diên NTSYSpc 2.10m

- Quy trình xử lý dữ liệu bằng NTSYS

Phân tích số liệu RAPD, SSR, RFLP được thực hiện trên máy vi tính theochương trình NTSYSpc 2.1 (Applied Biostatistisc Inc., USA., 1998) Với mụctiêu là xác định sự giống nhau và khác nhau về cấu trúc DNA trong phạm viphân tích các đoạn; xác định sự đa hình các phân đoạn DNA; tìm quan hệ di

28

truyền giữa các đối tượng nghiên cứu Nguyên tắc xử lý các số liệu gồm 3 bướcsau đây:

+ Bước 1: So sánh từng cặp đối tượng trong nghiên cứu bằng cách tính toán khoảng cách quan hệ giữa chúng

+ Bước 2: Lập một ma trận gồm tất cả những giá trị tính toán được trước đó+ Bước 3: Giải ma trận và biễu diễn thành một biểu đồ đặc trưng

Các bước phân tích được thực hiện như sau:

+ Nhập các số liệu của bảng thống kê các band điện di sản phẩm RAPD vàobảng tính NTEDIT

2.6.1. Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền trên thế giới

Trước đây, các nghiên cứu phân loại các loài trong họ Berberidaceae chủyếu dựa vào đặc điểm hình thái và các khóa phân loại Đã có một vài nghiên cứu

chi Berberis và Mahonia trên số lượng nhiễm sắc thể (Dermen, 1931), cấu tạo

giải phẫu gỗ (Shen, 1954) và huyết thanh học (Jensen, 1973) chỉ ra rằng chúngthuộc cùng một chi Mặt khác, các nghiên cứu về phôi học và đặc điểmhình thái khác nhau như cây có gai và lá mọc đơn ở chi Berberis nhưng lạikhông có ở các loài Mahonia đã khẳng định chúng thuộc hai chi khác nhau(Ahrendt, 1961) Gần đây, các kỹ thuật di truyền được sử dụng để nghiên cứutính đa dạng của các loài trong họ Berberidaceae và đi tìm mối quan hệ phát sinhloài giữa các loài

Để xác định sự khác biệt giữa các loài xâm lấn và các loài bản địa trong chi

Mahonia, tác giả C Roß and W Durka (2006) đã đưa ra 10 microsatellite cho loài Mahonia Nuttall xâm lấn và ứng dụng để khuếch đại họ hàng của chúng là Mahonia repens và Mahonia pinnata từ Bắc Mỹ và một loài thuộc chi Berberis (Berberis vulgaris) có nguồn gốc châu Âu Sử dụng các chỉ thị vệ tinh trên M aquifolium, M repens và M Pinnata từ Bắc Mỹ (8 cá thể), được giả định là loài gốc của các loài Mahonia xâm lấn và 9 cá thể từ 5 quần thể Berberis vulgaris

từ Châu Âu Kết quả cho thấy các locus dường như được bảo tồn trong chi

Mahonia và một phần trong chi Berberis.

Somayeh Heidary và cộng sự (2009) tiến hành đánh giá cấu trúc bộ gen và

sự đa dạng của quần thể Berberis tự nhiên ở tỉnh Khorasan (Iran) và chỉ ra rằng Mahonia aquifolium nằm ở nhóm khác xa về di truyền so với các loài còn lại Mặc dù dựa vào các đặc điểm hình thái Mahonia đã được tách khỏi chi Berberis, nhưng mối quan hệ phát sinh loài chưa được rõ ràng Nghiên cứu đã

sử dụng chỉ thị AFLP và so sánh với các chỉ thị hình thái Dựa vào cây ditruyền từ kết quả AFLP chỉ ra các quẩn thể được chia thành hai nhóm chính với

hệ số tương đồng 0,48 tách ra thành hai chi Mahonia và Berberis.

Năm 2012, tác giả Najmeh Sodagar thực hiện nghiên cứu hình thái, nhiễm

sắc thể và các nghiên cứu về phân tử 25 mẫu của bốn loài thuộc chi Berberis L.

thu thập ở tỉnh Khoanssan, Iran Kết quả cho thấy, về hình thái đã công nhận ba

loài mới Berberis Bốn loài chưa biết đơn vị phân loại mới với các đặc điểm

hình thái cũng đã được xác định nhưng lại để phân tích thêm vì tỷ lệ phần trămcao đa bội và lai tạo trong chi này Sử dụng phương pháp khoảng cách và PCoA

để phân tích dữ liệu hình thái học Dựa vào đơn vị phân loại, hình dạng và kíchthước hạt phấn hoa của bốn loài đó gần như bằng nhau và không có sự khác biệt

rõ ràng giữa chúng Kết quả kiểm tra nhiễm sắc thể ở tất cả các mẫu nghiên cứuđều là thể tứ bội (2n = 4x = 56) Nghiên cứu ở mức phân tử bằng kỹ thuật RAPD

và giải trình tự vùng ITS cho thấy mối quan hệ giữa các đơn vị phân loại và sựkhác biệt giữa các loài

30

Tác giả, Vivek Tripathi và Sandhya Goswami (2013) cũng sử dụng phươngpháp khuyếch đại ngẫu nghiên RAPD để đánh giá sự đa dạng di truyền của 50

loài Berberis lycium Royle thu thập ở các vùng sinh thái khác nhau ở Ấn Độ Trong số 80 mồi RAPD, kết quả thu được 11,638 phản ứng với 50 loài B Lycium của 28 mồi đa hình 332 sản phẩm khuyếch đại, trong đó 284 (85%) alen

đa hình và 84 alen đơn hình Mồi OPAP-3 thu được 21 loại alen và 20 loại alen

ở mồi OPB-4 Trung bình thu được 11,5 alen ở mỗi mồi và kích thước dao động

từ 100 đến 4500bp và sau khi nghiên cứu không có mồi nào cho alen đặc hiệu ởtất cả các loài Hệ số PIC dao động từ 0.013 đến 0.52, trung bình là 0,12 Cây di

truyền của 50 loài B Lycium chia thành 5 nhóm chính Nghiên cứu này không

hỗ trợ phân loại trước loài B Lycium (dựa vào đặc điểm hình thái) nhưng cho thấy sự đa dạng lớn trong loài B Lycium.

Đối với chi Podophyllum, tác giả Md Afroz Alam và cộng sự (2009) đã sử dụng chỉ thị RAPD để phân tích đa dạng di truyền của 28 loài Podophyllum hexandrum được thu thập ở độ cao khác nhau từ 1300-4300 m tại Tây Bắc khu

vực Himalaya, Himachal Pradesh, Ấn Độ Kết quả phần trăm các alen đa hình là

92,37 %, chứng tỏ 28 loài Podophyllum hexandrum đa dạng di truyền cao Đến

năm 2010, Naik và cộng sự đã sử dụng 19 mồi ngẫu nhiên RAPD, 11 mồi ISSR

và 13 cặp mồi AFLP để phân tích đa dạng di truyền của 28 loài Podophyllum hexandrum trên Kết quả cho thấy, phần trăm alen đa hình di truyền giữa các loài Podophyllum hexandrum khi sử dụng chỉ thị RAPD, ISSR, AFLP tương

ứng là 92,37%, 83,82% và 84,40%

Năm 2013, để bảo tồn các loài Podophyllum Hexandrum ở Ấn Độ trước

nguy cơ tuyệt chủng nghiêm trọng, Nag và cộng sự đã xác định được 20 mồiSSR để đánh giá đa dạng di truyền và phân biệt khác nhau giữa các loài Kết quảthu được tổng cộng 91 alen Số lượng alen dao động từ 2-9 với trung bình 4,55alen mỗi mồi và dị hợp tử (H0) dao động từ 0,067-1,000

2.6.2. Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền ở Việt Nam

Mặc dù việc nghiên cứu về tiềm năng di truyền thực vật ở Việt Nam đượctriển khai rất nhanh trong thời gian 10 năm trở lại đây, các nghiên cứu này chủyếu tập trung vào các cây trồng nông nghiệp, cây hoa và một số cây lâm nghiệp.Trên đối tượng cây thuốc chỉ có một số ít công trình nghiên cứu ở mức độ phân

tử dựa trên chỉ thị RAPD để phân tích tính đa dạng di truyền một số cây như: Ba

kích (Morinda officialis How (Đinh Đoàn Long (2007), Diệp hạ châu Phyllanthus amarus và P urinaria (Đinh Đoàn Long (2005), Giảo cổ lam (Gynostemma spp (Hoàng Văn Lâm, 2009), Hồi, Ngũ gia bì gai (A trifoliatus (L.) Merr.), Ngũ gia bì hương (Acanthopanax gracilistylus W.W.Smith) (Đinh Đoàn Long (2009), Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis), Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus), Thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana Zucc (Nguyễn Tiến Hùng

(2009),

Đối với các loài thuộc các chi của họ Berberidaceae, các nghiên cứu mới

dừng lại ở mức thu thập nguồn gen và trồng lưu giữ (chưa đầy đủ) một cáchngẫu nhiên, xác định phương pháp định tính berberin trong dược liệu (NguyễnKim Cẩn, 2000); xác định hàm lượng berberin từ Hoàng liên gai, Hoàng liênchân gà, Hoàng bá (Tạ Kim Thạch, 2005); phương pháp chiết xuất berberin, như

từ Vàng đắng (Phạm Viết Trung, 2000); bán tổng hợp tetrahydroberberin làmthuốc an thần (Ngô Ngọc Khuyến, 1995), nuôi cấy mô tế bào rễ ở Hoàng liêngai (Tạ Kim Thạch, 2005) và bảo vệ, tái sinh cây Vàng đắng (Nguyễn Tập,2000), chưa thấy có một nghiên cứu đa dạng di truyền nào ở mức phân tử đểđánh giá nguồn gen, tạo cơ sở cho việc bảo tồn, khai thác và sử dụng có hiệuquả nguồn tài nguyên cây thuốc bản địa này

32

2.7 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG BEBERIN – HỆ

THỐNG SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

2.7.1. .Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

- Khái niệm:

HPLC là chữ viết tắt 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc kýlỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước đây gọi

là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography)

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-1968 trên

cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển HPLC là mộtphương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột

là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lênmột chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học vớicác nhóm chức hữu cơ Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi vàphổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp táchcác hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt

Phạm vi ứng dụng của phuonkgw pháp HPLC rất rộng như: Phân tích cáchợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnhvực thực phẩm, dược phẩm, môi trường

- Nguyên tắc của quá trình sắc kí trong cột:

Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký

và lọai sắc ký

- Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có Sắc ký hấp phụ pha thuận hoặc pha

đảo

- Nếu pha tĩnh là chất trao đổi Ion thì ta có Sắc ký trao đổi ion

- Nếu pha tĩnh là chất Lỏng thì ta có Sắc ký phân bố hay sắc ký chiết

- Nếu pha tĩnh là Gel thì ta có Sắc ký Gel hay Rây phân tử