NGHIÊN CỨU CHẤT ỨC CHẾ HOẠT TÍNH PROTEASE HIV TỪ DỊCH CHIẾT CỦA LÁ CÂY THẠCH DÂU

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Hồng Anh NGHIÊN CỨU CHẤT ỨC CHẾ HOẠT TÍNH PROTEASE HIV-1 TỪ DỊCH CHIẾT CỦA LÁ CÂY THẠCH CHÂU (PYRENARIA JONQUERIANA), ỔI (PSIDIUM GUAJAVA) VÀ MA HOÀNG (EPHEDRA DISTACHYA) TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2015 MỞ ĐẦU Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (AIDS) gây virus gây suy giảm miễn dịch người (HIV) Đây virus thuộc họ Retroviridae có hai type HIV-1 HIV-2, type xuất phổ biến nguyên nhân gây AIDS người Cho đến nay, dù có chương trình hành động toàn cầu với phát triển phương pháp điều trị, AIDS đại dịch toàn nhân loại cần thiết phải tăng cường biện pháp phòng ngừa, điều trị bệnh hiệu Trong phòng chống nhiễm HIV-1, phát triển vaccine gặp nhiều khó khăn thường thất bại thời gian ủ bệnh HIV-1 dài, thường xuyên xảy đột biến vùng gen mã hóa cho kháng nguyên Vì vậy, nay, người nhiễm HIV-1 muốn kéo dài sống có đường sử dụng liệu pháp dùng thuốc kháng retrovirus (ART) Trong chu trình tái HIV-1, protease enzyme có tác dụng phân cắt polyprotein tiền thân gag gag-pol thành protein cấu trúc chức trình trưởng thành virus Khi ức chế hoạt tính protease gây đột biến gen mã hóa cho protease, hạt virus hình thành không đóng gói phù hợp để tạo thành virus hoàn chỉnh nên chúng khả xâm nhiễm vào tế bào vật chủ Vì vậy, số chất ức chế protease HIV-1 (PI) phát triển thành thuốc điều trị bệnh nhân HIV/AIDS Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc thời gian dài với nồng độ cao với tốc độ đột biến lớn HIV-1 dẫn đến xuất chủng virus kháng thuốc nguyên nhân gây thất bại điều trị với ART nói chung PI nói riêng Hơn nữa, việc thiết kế chất PI dễ dàng, không định hướng, phải sàng lọc số lượng lớn hợp chất thiết kế tương tự sở hiểu biết cấu trúc chức protease HIV-1 Chính vậy, bên cạnh thuốc tổng hợp hóa học, nhà khoa học giới không ngừng tìm kiếm chọn lọc chất tự nhiên từ dịch chiết thực vật có tác dụng ức chế protease HIV-1 (protease HIV-1) Việt Nam với nguồn thực vật phong phú nhiều thuốc có giá trị lớn với sức khỏe người Theo thống kê, Việt Nam có 12.000 loài thực vật, có gần 4.000 loài dùng làm thuốc y học dân gian y học cổ truyền Như vậy, thực vật Việt Nam s nguồn nguyên liệu phong phú để sàng lọc xác định hoạt chất ức chế protease HIV-1, làm cở sở cho việc phát triển thuốc điều trị cho bệnh nhân HIV/AIDS Tuy nhiên, chưa khai thác nguồn tài nguyên phong phú đất nước theo hướng Xuất phát từ thực tế trên, tiến hành đề tài “Nghiên cứu chất ức chế hoạt tính protease HIV-1 từ dịch chiết Thạch châu (Pyrenaria jonqueriana), Ổi (Psidium guajava) Ma hoàng (Ephedra distachya)” nhằm thu nhận chất ức chế protease HIV-1 có nguồn gốc từ dược liệu Việt Nam Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ HIV VÀ PROTEASE CỦA HIV-1 1.1.1 Giới thiệu chung HIV Đại dịch HIV/AIDS thách thức to lớn tiến trình phát triển xã hội Sau thập kỷ phát mà nước phát triển, HIV/AIDS lan rộng toàn giới, đặc biệt khu vực châu Phi nước châu Á Đến chưa có vaccine phòng ngừa HIV hay thuốc chữa trị AIDS đặc hiệu Theo chương trình HIV/AIDS Liên hiệp quốc (UNAIDS, 2015), tính đến cuối năm 2014, giới có khoảng 36,9 triệu người (dao động khoảng từ 34,3 triệu đến 41,4 triệu) mang bệnh AIDS, số đối tượng nhiễm triệu người có khoảng 1,2 triệu bệnh nhân chết AIDS năm 2014 Trong phòng chống nhiễm HIV/AIDS, phương thức điều trị phổ biến liệu pháp dùng thuốc chống virus (ART-antiretroviral drug therapy) bao gồm thuốc ức chế reverse transcriptase, thuốc ức chế integrase thuốc ức chế protease (PI) Trong đó, protease mã hóa gen pol virus có chức cắt chuỗi polyprotein (gag, gag-pol) vị trí định để tạo thành protein cấu trúc chức cần thiết cho virus hoàn chỉnh Nếu protease bị hoạt tính, HIV-1 không đóng gói phù hợp để tạo virus hoàn chỉnh Vì vậy, protease HIV-1 (protease HIV-1) đích quan trọng để phát triển thuốc điều trị AIDS 1.1.2 Cấu trúc chức protease HIV-1 Về cấu trúc, protease HIV-1 protease aspartyl, họ retropepsin A2 Enzyme có cấu trúc dạng homodimer, monomer gồm 99 acid amin xếp gần theo kiểu đối xứng Cấu tạo protease HIV-1 chia thành ba vùng chính: vùng dimer hóa, vùng lõi vùng mũ Trong đó, vùng dimer hóa hình thành nhờ tương tác gốc acid amin – (vùng N đầu cùng) 96 – 99 (vùng C tận cùng) từ monomer acid amin trung tâm hoạt động 24 – 29 Khi enzyme gắn thêm chất ức chế chất, ổn định cấu trúc dimer tăng cường Vùng lõi gồm đầu N sợi β có vai trò quan trọng ổn định cấu trúc dimer hoạt tính xúc tác enzyme Trung tâm hoạt động enzyme nằm vùng lõi bao gồm ba gốc acid amin từ monomer Vùng mũ nằm phần rộng enzyme bao gồm acid amin từ 33 – 43 44 – 63 bao quanh trung tâm hoạt động Trung tâm hoạt động protease chứa ba Asp – Thr – Gly nằm mặt phân giới dimer Tại monomer nhóm ba xúc tác đặt vị trí 25 – 26 – 27 tính đối xứng monomer lại 25’ – 26’ – 27’ Phân tử Asp25 25’ cần thiết cho cấu trúc hoạt tính xúc tác protease Về chức năng, sau giải phóng khỏi màng tế bào vật chủ, HIV-1 tồn hạt virus khả lây nhiễm gọi virion Để trở thành hạt virus hoàn chỉnh, virion phải trải qua trình xếp lại cấu trúc nhờ khả phân cắt chuỗi polyprotein (gag, gag-pol) protease để tạo thành protein cấu trúc chức cần thiết cho trưởng thành virus Ngoài vai trò phân cắt tiền chất virus, protease HIV-1 cắt protein tế bào chủ Ngày có nhiều chứng cho thấy phân giải suy giảm protein tế bào dẫn tới trình chết hoại tử chết tự hủy tế bào CD4+ T Sự suy giảm tế bào CD4+ T dấu hiệu HIV/AIDS Như vậy, dễ dàng nhận thấy vai trò quan trọng protease HIV-1 việc phân cắt protein tiền thân virus, lắp ráp virion trưởng thành góp phần gây độc cho tế bào vật chủ trình xâm nhiễm 1.1.3 Phân tích hoạt độ protease HIV-1 Protease HIV-1 có chức phân cắt polyprotein tiền thân gag gag-pol virus Trung tâm hoạt động protease bao gồm ba Asp25, Thr26 Gly27; đột biến xảy Asp25 s dẫn đến hoạt tính protease HIV-1 Protease HIV-1 có hoạt tính tự cắt xảy sau protein gag-pol hình thành dimer hóa, qua cho phép giải phóng khỏi polyprotein tiền thân Hoạt tính enzyme tuyệt đối cần thiết cho trình hình thành virus hoàn chỉnh dẫn đến vai trò quan trọng protease liệu pháp dùng thuốc chống HIV-1 Phát triển thuốc ức chế protease HIV-1 cần thiết phải có phương pháp xác định hoạt độ protease phù hợp Do protease HIV-1 thủy phân peptide hay protein chứa trình tự đặc hiệu, không thủy phân protein thông thường nên việc xác định hoạt độ protease thực sử dụng chất thiết kế dựa trình tự phân cắt protease HIV-1 Vì vậy, phần lớn chất chuỗi peptide có trình tự giống với vị trí cắt đặc hiệu protease HIV-1 chuỗi polyprotein gag gag-pol HIV-1 Dưới số phương pháp xác định hoạt độ protease HIV-1 sử dụng phổ biến Phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp pha đảo (Reversed Phase HPLC) định lƣợng sản phẩm phân cắt từ chất tổng hợp: Phương pháp có độ nhạy cao nhược điểm là: tiêu tốn nhiều thời gian, không thích hợp làm nhiều mẫu thiếu tính liên tục Những hạn chế HPLC dần khắc phụ cách sử dụng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu UPLC (Ultra performance liquid chromatography) để tăng độ phân giải, độ nhạy số lượng So với HPLC, UPLC có trình chuẩn bị mẫu đơn giản, thời gian phân tích ngắn có tính chọn lọc cao cho phép đánh giá đồng thời nhiều chất ức chế Phƣơng pháp quang phổ kế với chất peptide có liên kết đặc hiệu protease HIV-1: chất peptide thiết kế có chứa vị trí phân cắt protease HIV-1 có khả hấp thụ cực đại bước sóng định vùng tử ngoại Dưới tác dụng protease, liên kết bị phân cắt, độ hấp thụ ánh sáng giảm dần theo thời gian tác dụng enzyme Phương pháp thực nhanh, không tốn nhiều thời gian, liên tục cho số liệu xác Phƣơng pháp quang phổ huỳnh quang: Dựa trình tự cắt protease HIV-1, Taylor tập thể (1992) tổng hợp chất huỳnh quang DABCYL-SerGlnAsnTyrProIleValGln-EDANS để đo hoạt độ enzyme Cơ chất đặc trưng chất phát quang EDANS chất thu tín DABCYL Khi protease HIV-1 thủy phân liên kết Tyr-Pro, DABCYL tách khỏi phần gắn EDANS, nhờ EDANS phát huỳnh quang đo tác dụng ánh sáng kích thích Phương pháp tốn thời gian, có độ nhạy, độ đặc hiệu cao quang phổ thông thường xem phương pháp đại để xác định hoạt độ protease HIV-1 1.2 CÁC CHẤT ỨC CHẾ PROTEASE HIV-1 VÀ ỨNG DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ AIDS 1.2.1 Chất ức chế protease HIV-1 có nguồn gốc hoá học Protease HIV-1 đích quan trọng để phát triển thuốc điều trị HIV/AIDS Nhìn chung, chất ức chế protease chia thành hai nhóm lớn: i) chất ức chế có chất peptide ii) chất ức chế peptide Ở nhóm thứ nhất, chất ức chế giống với chất tự nhiên mang liên kết đặc hiệu protease HIV-1 Chúng thiết kế giống với dạng trung gian chuyển tiếp tứ diện hình thành trình protease xúc tác Trong đó, nhóm chất ức chế peptide lại gắn với phân tử H2O trung tâm hoạt động protease làm cho protease không gắn với polyprotein tiền thân HIV-1 để thực chức Đến nay, có thuốc PI FDA cấp phép để điều trị cho bệnh nhân nhiễm HIV, bao gồm: Atazanavir, Darunavir, Fosamprenavir, Indinavir, Nelfinavir, Saquinavir, Tipranavir Ritonavir Để đánh giá mức độ mạnh yếu chất ức chế nghiên cứu trước thường sử dụng giá trị IC50 IC90 (nồng độ chất ức chế mà 50% 90% hoạt tính enzyme bị ức chế) Saquinavir chất ức chế FDA phê duyệt Cơ sở thiết kế dựa khả phân cắt liên kết bất thường Tyr-Pro PhePro chuỗi polypeptide pol tiền thân protease Các nghiên cứu phòng thí nghiệm cho thấy, Saquinavir có hoạt tính ức chế cao với giá trị IC90 nM Tuy nhiên, Saquinavir lại có hoạt tính sinh học thấp theo đường uống nhanh chóng bị phân hủy thể Indinavir, Nelfinavir Ritonavir thiết kế dựa chức nhận biết trình tự acid amin tương tự Saquinavir Trong điều kiện in vitro, Ritonavir chứng minh có khả ức chế chủng HIV-1 phân lập với IC90 vào khoảng 70 – 200 nM Tác dụng phụ thuốc tương tác thuốc cao nên nhiều thuốc bị chống định dùng Ritonavir, xảy nhiều rối loạn chuyển hóa, giảm chức gan Indinavir chất ức chế mạnh chọn lọc protease nồng độ 0,6 nM Indinavir tăng cường độ hòa tan, hoạt tính sinh học theo đường uống tốt ức chế virus với nồng độ từ 50 – 100 nM Mặc dù vậy, có số vấn đề liên quan đến Indinavir thuốc gây sỏi thận khoảng – 25% số bệnh nhân, có tác dụng phụ da, niêm mạc gây tăng bilirubin không triệu chứng Do đó, Indinavir có vai trò thứ yếu điều trị HIV Nelfinavir chất ức chế protease sử dụng nhiều Ở điều kiện in vitro, Nelfinavir ức chế protease HIV-1 mạnh với Ki 2,0 nM Thuốc chứng minh có khả kháng số chủng HIV-1 HIV-2 với IC50 – 60 nM Tác dụng Nelfinavir tăng cường sử dụng thuốc kháng retrovirus khác Bên cạnh tác dụng phụ, sử dụng thuốc tổng hợp hóa học để điều trị cho bệnh nhân nhiễm HIV phải xem xét tới vấn đề đột biến kháng thuốc HIV-1 Trong đột biến kháng thuốc phổ đột biến PI rộng, đa hình xảy 49 gốc acid amin tổng số 99 gốc acid amin protease Khi điều trị thuốc ức chế protease không tăng cường, đột biến làm giảm rõ rệt hoạt tính thuốc Đối với chất ức chế protease tăng cường phải cần xuất nhiều đột biến đồng thời xảy tình trạng kháng thuốc 1.2.2 Chất ức chế protease HIV-1 có nguồn gốc tự nhiên Mặc dù PI tổng hợp hoá học có tính đặc hiệu cao nhược điểm gây nhiều tác dụng phụ không mong muốn sử dụng thời gian dài khả kháng thuốc cao Do đó, đời loại thuốc PI chống HIV/AIDS cần thiết Tuy nhiên, việc thiết kế chất thường phức tạp, phải trải qua nhiều bước thử nghiệm không thân thiện với người Chính vậy, thuốc tổng hợp hóa học, nhà khoa học không ngừng tìm kiếm chọn lọc chất tự nhiên có tác dụng ức chế protease HIV-1 Nhiều dịch chiết từ thực vật vi sinh vật sử dụng để chống nhiễm trùng, chống lại phát triển khối u có hoạt tính kháng HIV-1 protease HIV-1 Otake tập thể nghiên cứu tác dụng 30 dịch chiết thực vật lên hoạt động HIV-1 nhận thấy khả ức chế nhiều dịch chiết methanol xà cừ Tây Ấn Các loài thực vật khác có khả ức chế 40 – 50% hoạt tính protease HIV-1 nồng độ 100 µg/ml dịch chiết methanol thân rễ Riềng nếp (Alpinia galangal) ức chế 48,70% Nhọ nồi (Eclipta prostrate) ức chế 42,53% Protease HIV-1 thuộc họ protease aspartyl, có dạng dimer mang đặc điểm tương đồng với pepsin cấu trúc chế xúc tác Do protease HIV-1 có tính đặc hiệu chất cao nên gần sử dụng khâu sàng lọc, chất có mặt s ảnh hưởng đến phép phân tích Chính vậy, nhiều nghiên cứu, pepsin thường dùng thay cho protease HIV-1 trình sàng lọc Chẳng hạn như, Rege tập thể sử dụng pepsin thay cho protease HIV-1 để đánh giá hoạt tính ức chế dịch chiết từ thực vật Kết cho thấy, dịch chiết ethanol Hương nhu tía (Ocimum sanctum) Thần thông (Tinospora cordifolia) có hoạt tính ức chế với IC50 tương ứng 123,73 11,20 µg/ml Từ dịch chiết thực vật vi sinh vật ban đầu, loạt hợp chất thứ cấp có khả ức chế protease HIV-1 phân tách tinh bao gồm: Các flavonoid: Đây nhóm chất lớn (các hợp chất polyphenol) tổng hợp tế bào thực vật Chúng biết đến với nhiều tác dụng sinh học quan trọng đặc biệt hoạt tính chống oxy hóa Hoạt tính kháng HIV-1 flavonoid khác chứng minh Một số chalcone nhóm flavonoid như: hydroxypanduratin A panduratin A từ dịch chiết metanol thân, rễ Gừng (Boesenbergia pandurata Holtt) thể khả ức chế hoạt độ protease HIV-1 với IC50 tương ứng 5,6 µM 18,7 µM Các lignin: Lignin hợp chất cao phân tử, có mặt chủ yếu thực vật có mạch Longipedunin A phân lập từ Na rừng (Kadsura longipedunculata Finet et Gagnet) ức chế protease HIV-1 với giá trị IC50 50 µM Nhóm nghiên cứu Gao phân lập xác định 26 lignin (và hai triterpenoid) từ Oải hương (K.angustifolia (Bertol.) O Kuntze) Trong số này, binankadsurin A thể hoạt tính kháng HIV với IC50 3,86 µM Các triterpen dẫn xuất chúng: Triterpen terpene chứa đơn vị isoprene, có công thức C30H48, số kết hợp với đường gọi HIV-2 Từ dịch chiết chloroform thể nấm G colossum Việt Nam phân lập hai hợp chất hydroquinone farnesyl ganomycin B biết hợp chất ganomycin I Cả hai ganomycin I ganomycin B ức chế protease HIV-1 với giá trị IC50 tương ứng 21,9 µM 2,9 µM Ở nước, nghiên cứu Đỗ Thế Lộc Phạm Viết Dự cho thấy tác dụng hỗ trợ điều trị HIV/AIDS lâm sàng thuốc y học cổ truyền MD 07 Ngoài ra, số nghiên cứu tiến hành để đánh giá tác dụng viên nang Brishamin hay thuốc BSP1 hỗ trợ điều trị bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS Nghiên cứu Lã Đình M i Đái Duy Ban điều tra 40 loài thảo mộc có tác dụng kháng virus, kháng HIV tăng cường miễn dịch có triển vọng Việt Nam Khả ức chế protease HIV-1 8hydroxyquinoline, menadione acid asiatic phát Nguyễn Thị Hồng Loan Phan Tuấn Nghĩa Mặc dù, chưa có loại thuốc có nguồn gốc tự nhiên đưa vào điều trị lâm sàng cho bệnh AIDS hoạt động đầy hứa hẹn sản phẩm tự nhiên chứng minh Bên cạnh tác dụng ức chế trực tiếp protease HIV-1, việc tìm hoạt chất s sở để thiết kế chất hóa học có cấu trúc tương tự cải biến phù hợp nhằm tăng hiệu ức chế protease HIV-1 Theo thống kê Viện Dược liệu, Việt Nam có 12.000 loài thực vật, có gần 4.000 loài dùng làm thuốc y học dân gian y học cổ truyền Các nghiên cứu gần thuốc Việt Nam có chứa nhiều hoạt chất có tác dụng sinh học đáng ý Nguồn thực vật phong phú nhiều thuốc, vị thuốc Việt Nam s nguồn nguyên liệu phong phú cho việc sàng lọc phát hoạt chất ức chế protease HIV-1, làm cở sở cho việc phát triển thuốc điều trị cho bệnh nhân HIV/AIDS 11 Chƣơng NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU 2.1.1 Mẫu dƣợc liệu Các mẫu thực vật, bao gồm: Thạch châu (Pyrenaria jonqueriana Pierre.), Ổi (Psidium guajava L.), Ma hoàng (Ephedra distachya L.) thu hái kiểm tra tính xác loài thông qua đặc điểm hình thái TS Đỗ Thị Xuyến, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Mẫu nghiên cứu lưu giữ Khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu 2.1.2 Các hoá chất, nguyên liệu khác Các hóa chất sử dụng cho nghiên cứu gồm: protease HIV-1 sản phẩm đề tài mã số: ĐT-PTNTĐ.2012-G/02; pepsin, hemoglobin, pepstatin A, dimethyl sulphoxide (DMSO), Coomassie Brilliant Blue R-250 (CBB), chất peptide L6525(Lys-Ala-Arg-Val-Nle-p-nitro-Phe-Glu-Ala-amide) cho protease HIV-1 Sigma-Aldrich (Mỹ), kit xác định hoạt tính protease HIV-1 sử dụng chất huỳnh quang Kit SensoLyte® 520 HIV-1 Protease Assay (Anaspec, Mỹ) Các hóa chất khác trichloroacetic acid (TCA), agar, urea, βmercaptoethanol… đạt độ tinh dành cho phân tích 2.2 MÁY MÓC VÀ TRANG THIẾT BỊ Các máy móc, trang thiết bị sử dụng cho nghiên cứu bao gồm: tủ ấm 37ºC (Memmert, Anh); tủ an toàn sinh học cấp (Nuaire, Mỹ); máy li tâm lạnh 5417R (Eppendorf, Đức); máy li tâm Sigma 3K (Sartorius, Đức); máy gia nhiệt khô Multi Blok® Heater (Lab-Line Instruments, Hoa Kỳ); máy quang phổ (Thermo Scientific, Hoa Kỳ); máy quang phổ kiến DU 800 (Beckman coulter, Hoa Kỳ); máy NanoDrop huỳnh quang 3300 (Thermo Scientific, Hoa Kỳ) Các dụng cụ, trang thiết bị khác phòng Protein tái tổ hợp thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme Protein 12 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Phân tách hợp chất từ dịch chiết thực vật - Lá dược liệu (1,5 kg) độ ẩm 8,5% cắt nhỏ, chiết hồi lưu với ethanol 96% nhiệt độ sôi (chiết lần, lần giờ) - Dịch chiết gộp lại cất loại dung môi áp suất giảm thu cao chiết ethanol cô khô - Cao chiết hòa tan vào nước cất (0,5 lít) thành nhũ dịch tiếp tục chiết phân đoạn với dung môi có độ phân cực tăng dần theo thứ tự n-hexan (Hx) (0,5 lít × lần), ethyl acetate (EtOAc) (0,5 lít × lần), n-butanol (BuOH) (0,5 lít × lần) - Các dịch chiết Hx, EtOAc BuOH tách riêng, cất loại dung môi áp suất giảm thu phần cao tương ứng - Cao phân đoạn có hoạt tính ức chế tốt tiếp tục chạy qua cột sắc ký silica gel, rửa giải hệ dung môi dicloromethan/methanol với tỷ lệ methanol tăng dần từ đến 100% - Thành phần dịch rửa giải kiểm tra sắc ký lớp mỏng Sự có mặt hợp chất quan tâm quan sát sắc ký đèn tử ngoại bước sóng UV – 254 nm, 365 nm ánh sáng trắng sau phun thuốc thử H2SO4 10%/ethanol sấy 110oC phút - Phân đoạn lựa chọn chạy qua cột silica gel rửa giải với hệ dung môi gradient n-hexan/ethyl acetat (4/1; 2/1; 1/1) thu hợp chất quan tâm 2.3.2 Xác định cấu trúc chất đƣợc phân tách Công thức cấu tạo chất phân tách xác định thông qua tính chất lý hóa (cảm quan, nhiệt độ nóng chảy) phổ tử ngoại (UV), hồng ngoại (IR), phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, sử dụng chất nội chuẩn TMS - tetramethyl silan) so sánh với liệu công bố 13 2.3.3 Xác định hoạt tính ức chế pepsin phƣơng pháp khuếch tán đĩa thạch có chứa chất hemoglobin Trong giai đoạn sàng lọc, hoạt tính ức chế protease HIV-1 dịch chiết thực vật đánh giá gián tiếp thông qua khả ức chế pepsin phân giải chất hemoglobin Quá trình chuẩn bị đĩa thạch gồm bước sau: Các đĩa agar (2,5%) chuẩn bị đệm acetate 50 mM pH 3,5, chứa hemoglobin (0,3%) đục lỗ (đường kính mm) mẫu 10 µl dịch chiết thực vật phân đoạn tinh pha DMSO cho vào giếng, ủ 37ºC 15 phút dịch chiết khuếch tán phần vào đĩa thạch 10 µl pepsin (1 mg/ml) pha HCl 0,01 N bổ sung tiếp tục ủ 37ºC Mẫu kiểm tra âm mẫu thay đồng thời dịch chiết DMSO, thay pepsin dung dịch pha pepsin (HCl 0,01 N), mẫu kiểm tra dương mẫu thay dịch chiết (chứa chất ức chế) DMSO Sau ủ 120 phút, đĩa thạch nhuộm dung dịch CBB 0,25% tẩy nhiều lần nhìn rõ vòng phân giải pepsin Hoạt tính ức chế pepsin đánh giá sở đo vòng phân giải chất, so sánh mẫu thí nghiệm mẫu kiểm tra Cụ thể, khả ức chế hợp chất thực vật thống kê sở đo vòng phân giải (Bảng 1) Bảng Mức độ ức chế pepsin hợp chất thực vật theo đƣờng kính vòng phân giải Đƣờng kính vòng phân giải (ĐKVPG) (cm) Mức độ ức chế < ĐKVPG ≤ 0,6 cm +++ 0,6 < ĐKVPG ≤ 0,9 ++ 0,9 < ĐKVPG < 1,1 + 1,1 ≤ ĐKVPG (Không ức chế) 14 2.3.4 Xác định hoạt tính ức chế pepsin theo phƣơng pháp Anson cải tiến Bên cạnh phương pháp khuếch tán đĩa thạch, hoạt tính ức chế pepsin dịch chiết thực vật đánh giá phương pháp Anson cải tiến với chất hemoglobin theo quy trình mô tả hãng Sigma Aldrich Nguyên tắc: Hemoglobin bị phân cắt pepsin thành peptide acid amin hòa tan Sự có mặt acid amin thơm sản phẩm thủy phân xác định thông qua độ hấp thụ chúng bước sóng 280 nm (A280) sở để đánh giá hoạt độ pepsin Cách tiến hành: Pepsin ủ với dịch chiết 37ºC, phút Sau bổ sung hemoglobin 2% HCl 60 mM tiếp tục ủ 37ºC 15 phút Phản ứng làm ngừng TCA 5%, sản phẩm phân giải dịch thu sau ly tâm xác định cách đo A280 Mẫu kiểm tra pepsin bị bất hoạt TCA 5% trước bổ sung chất Hoạt độ pepsin đánh giá sở hiệu số số đọc A280 mẫu thí nghiệm mẫu đối chứng Công thức tính % ức chế: AĐC - ATN % ức chế = × 100% AĐC Trong đó: AĐC ATN độ hấp thụ bước sóng 280 nm mẫu đối chứng mẫu thí nghiệm 2.3.5 Xác định hoạt tính protease HIV-1 sử dụng chất peptide đặc hiệu Hoạt tính ức chế protease HIV-1 hợp chất xác định cách sử dụng chất tổng hợp có liên kết đặc hiệu dựa theo phương pháp mô tả Richards tập thể Nguyên tắc: Cơ chất peptide với trình tự Lys-Ala-Arg-Val-Leu*Nph-GluAla-Met (Sigma-Aldrich) chứa vị trí phân cắt protease HIV-1 dạng cải biến Nle (nonleucine) 4-NO2- phenylalanine (Nph) có khả hấp thụ ánh sáng cực đại bước sóng 300 nm (A300) Dưới tác dụng thủy phân protease 15 HIV-1 liên kết bị phân giải, đo độ giảm A300 theo thời gian máy quang phổ kế UV-VIS Cách tiến hành:  Enzyme chất ức chế ủ trước với môi trường đệm thử hoạt tính (Bảng 2.) phút  20 µL chất bổ sung  Hỗn hợp trộn tiến hành đo mức độ giảm A300 hệ thống máy quang phổ 10 phút 37oC  Mẫu kiểm tra hay đối chứng mẫu thay dung dịch chứa chất ức chế đệm chiết hay dung môi hòa tan chất ức chế Bảng 2.2 Thành phần phản ứng đo hoạt độ protease HIV-1 sử dụng chất peptide đặc hiệu L6525 Thể tích Thành phần (μL) H2O khử ion, khử trùng 127 Đệm 2x (Na-acetate 200 mM, pH 4.5, EDTA mM, -mecaptoethanol 10 mM, NaCl 1.8 M, CaCl2 10 mM) 150 Cơ chất 1mg/ml 20 Chất ức chế (ở nồng độ khác nhau) Protease HIV-1 150 ng/l Tổng thể tích 300 16 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 ĐÁNH GIÁ KHẢ N NG ỨC CHẾ PROTEASE HIV-1 CỦA THẠCH CHÂU (PYRENARIA JONQUERIANA PIERRE.), ỔI (PSIDIUM GUAJAVA L.) VÀ MA HOÀNG (EPHEDRA DISTACHYA L.) Nguyễn Văn Dũng tập thể tiến hành sàng lọc hoạt tính ức chế pepsin/protease HIV-1 cao chiết cồn từ 136 loài thực vật; kết cho thấy có cao chiết gồm: hạt Bơ (Persea americana Mill.), Gối hạc (Leea rubra L.), Ma hoàng (Ephedra sinica L.), Ổi (Psidium guajava L.) Thạch châu (Pyrenaria jonqueriana Pierre.) ức chế mạnh enzyme Từ dịch chiết ethanol Gối hạc (Leea rubra L.), hợp chất acid maslinic (2α,3βdihydroxy-olean-12-en-28-oic acid; công thức phân tử C30H48O4) phân lập Hợp chất có tác dụng ức chế mạnh pepsin protease HIV-1 với giá trị IC50 tương ứng 3,2 mM 4,5 µM Trên sở đó, nghiên cứu này, lựa chọn Thạch châu Pyrenaria jonqueriana Pierre (Theaceae), Ổi Psidium guajava L (Myrtaceae) Ma hoàng Ephedra distachya L (Ephedraceae) để tiếp tục phân lập, tinh chất ức chế tiềm protease HIV-1 nghiên cứu tính chất hoạt chất thu 3.1.1 Khả ức chế pepsin của dịch chiết phân đoạn từ Thạch châu (Pyrenaria jonqueriana Pierre.) Cây Thạch châu Pyrenaria jonqueriana Pierre thuộc họ Chè (Theaceae) loài phát số tỉnh nước ta (Lâm Đồng, Quảng Trị, Lào Cai) Người dân vùng từ lâu thu hái sử dụng Thạch châu để pha nước uống giải nhiệt thay cho chè Ngoài ra, Thạch Châu sử dụng thuốc để nhiệt, lợi tiểu, tăng sức đề kháng Theo nghiên cứu, nhiều thực vật họ Chè (Theaceae) thường chứa nhiều hợp chất thứ cấp quan trọng tanin, flavonoid, polyphenol, triterpen 17 glycoside… Tuy nhiên, Việt Nam giới có tài liệu nghiên cứu Thạch châu, nghiên cứu chủ yếu tập trung vào đặc điểm hình thái phân loại Do đó, nghiên cứu s góp phần cung cấp thêm thông tin thành phần hóa học số tác dụng sinh học hợp chất phân lập từ Thạch châu Trong nghiên cứu này, tiến hành chiết cao ethanol tổng số Thạch châu dung môi hexane (Hx), ethyl acetate (EtOAc) butanol (BuOH) có độ phân cực tăng dần để thu riêng phân đoạn cao nước Các dịch chiết sau kiểm tra khả ức chế pepsin phương pháp khuếch tán đĩa thạch với chất hemoglobin Kết cho thấy, giếng đối chứng có dung dịch pha pepsin HCl 0,01 N dung môi pha chất nghiên cứu DMSO 100% vòng phân giải; với giếng có pepsin pepsin DMSO, đường kính vòng phân giải chất lớn 1,2 cm Qua chứng tỏ, vòng phần giải hoạt tính pepsin tạo Trong đó, số giếng chứa dịch chiết pepstatin A có đường kính vòng phân giải bị giảm Dựa vào đường kính vòng phân giải kết luận, phân đoạn BuOH ức chế hoạt tính pepsin tốt 3.1.2 Khả ức chế pepsin của dịch chiết phân đoạn từ Ổi (Psidium guajava L.) Cây Ổi có tên khoa học Psidium guajava L., thuộc họ Sim (Myrtaceae) Các phần khác Ổi dùng làm thuốc điều trị loạt bệnh người: điều trị ngoài, bệnh tả, bỏng, liền da, hạ sốt, ho, viêm họng… Trong Ổi có nhiều hợp chất hữu thứ cấp, gồm saponin, alkaloid, tannin, flavonoid, steroid, tinh dầu giàu nhóm triterpen Triterpen biết đến với nhiều tác dụng sinh học có nhiều tiềm điều trị bệnh chống lại trình tăng sinh tế bào ung thư, điều trị tiểu đường, chống oxi hoá, kháng viêm kháng HIV-1 18 Tương tự Thạch châu, dịch chiết ethanol Ổi chiết dung môi Hx, EtOAc BuOH có độ phân cực tăng dần để thu cao tương ứng Khi tiến hành kiểm tra khả ức chế pepsin phương pháp khuếch tán đĩa thạch dựa đường kính vòng phân giải cho thấy phân đoạn Hx EtOAc có hoạt tính ức chế pepsin tốt 3.1.3 Khả ức chế pepsin của dịch chiết phân đoạn từ thân Ma hoàng (Ephedra distachya L.) Ma hoàng Ephedra distachya L loài bụi thuộc họ Ma hoàng (Ephedraceae) Trong y học cổ truyền, Ma hoàng thường dùng để chữa chứng bệnh cảm mạo phong hàn, tức ngực, hen suyễn, phù thũng, làm mồ hôi, trừ lạnh, trừ ho hen, long đờm, lợi tiểu… Các nghiên cứu thành phần hóa học cho thấy, chi Ma hoàng có chứa alkaloid với tỷ lệ – 2,5%, chủ yếu ephedrine có tác dụng gây hưng phấn tinh thần giảm đau Ngoài ra, ma hoàng chứa nhiều hợp chất thứ cấp flavonoid, tannin, tinh dầu, acid hữu cơ, hợp chất phenol… Các cao phân tách từ dịch chiết ethanol Ma hoàng dung môi khác nghiên cứu ảnh hưởng lên hoạt tính pepsin theo phương pháp khuếch tán đĩa thạch chứa hemoglobin Kết thu cho thấy cao BuOH có khả ức chế pepsin tốt Theo kết thử khuếch tán đĩa thạch, đường kính vòng phân giải giếng có bổ sung cao ethanol tổng số Ổi với nồng độ 100 mg/mL 0,95 cm, đó, hai giếng bổ sung cao ethanol từ Thạch châu Ma hoàng nồng độ có đường kính 1,15 cm Bên cạnh đó, hoạt tính cao Hx, cao EtOAc, cao BuOH cao nước từ dịch chiết ethnol Ổi ức chế pepsin tốt cao tương ứng thu từ dịch ethanol Thạch châu thân Ma hoàng, đặc biệt hai cao EtOAc Hx từ Ổi Như vậy, bước đầu kết luận hoạt tính ức chế pepsin dịch chiết từ Ổi 19 tốt dịch chiết từ Thạch châu Ma hoàng Từ kết này, Ổi lựa chọn cho nghiên cứu nhằm phân lập, tinh hợp chất có hoạt tính ức chế protease HIV-1 3.2 TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ N NG ỨC CHẾ PROTEASE HIV-1 CỦA HỢP CHẤT TỪ DỊCH CHIẾT LÁ CÂY ỔI (PSIDIUM GUAJAVA L.) Khi tiến hành khảo sát cao phân đoạn Hx EtOAc Ổi sắc ký mỏng nhận thấy vết hai phân đoạn hợp chất (màu vàng, Rf = 0,7) Dựa vào đặc điểm hợp chất mỏng tham khảo tài liệu thành phần hoá học Ổi, nhóm hợp chất dự đoán triterpen Khảo sát nhiều hệ dung môi khác cho thấy vết cao phân đoạn Hx từ Ổi phân tách rõ ràng vết cao chiết EtOAc đặc biệt vết không bị chồng lặp với vết khác Do đó, cao phân đoạn Hx lựa chọn cho nghiên cứu phân lập chất ức chế protease HIV-1 3.2.1 Kết tách phân đoạn đánh giá hoạt tính ức chế pepsin/protease HIV-1 từ cao Hx Ổi Cao phân đoạn Hx từ dịch chiết ethanol tổng số Ổi chạy qua cột sắc ký silica gel, rửa giải hệ dung môi dicloromethan/methanol với tỷ lệ methanol tăng dần từ đến 100% Dịch rửa giải chia thành phân đoạn ký hiệu là: PĐ1; PĐ2; PĐ3; PĐ4 PĐ5 Kết kiểm tra khả ức chế pepsin phân đoạn cho thấy, PĐ2 có khả ức chế pepsin mạnh Để khẳng định chắn dịch chiết phân đoạn Ổi ức chế pepsin ức chế protease HIV-1, tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng PĐ2 lên hoạt tính phân giải chất peptide protease HIV-1 Kết cho thấy, nồng độ 4,5 µg/mL, PĐ2 ức chế 70% hoạt tính protease HIV-1 20 Để khảo sát thành phần hợp chất có mặt PĐ2 tiến hành phân tích phân đoạn sắc ký lớp mỏng (silica gel pha thường, hệ dung môi n-hexan/ethyl acetate; 1/2) Kết cho thấy, PĐ2 có vết (màu vàng, Rf = 0,7) Đây hợp chất triterpen có cao phân đoạn Hx EtOAc Chính vậy, định hướng phân lập hợp chất 3.2.2 Kết tinh đánh giá hoạt tính ức chế pepsin/protease HIV-1 hợp chất LO-I PĐ2 tiếp tục đưa lên cột silica gel rửa giải gradient với hệ dung môi n-hexan/ethyl acetate (4/1; 2/1; 1/1) thu hợp chất, ký hiệu LO-I Kết thử khả ức chế cho thấy: LO-I có hoạt tính ức chế pepsin rõ rệt Khi tăng dần nồng độ LO-I từ đến 50 mg/ml, đường kính vòng phân giải giảm dần hay hoạt tính ức chế pepsin LO-I tăng dần LO-I nồng độ 50 mg/ml ức chế pepsin gần tương đương với pepstatin A µM Kiểm tra hoạt tính ức chế protease HIV-1 với chất đặc hiệu thấy LO-I ức chế 70% hoạt tính protease HIV-1 nồng độ 2,5 µg/ml Khi so sánh khả ức chế protease HIV-1 LO-I PĐ2 thấy, hợp chất LO-I ức chế protease HIV-1 mạnh PĐ2 1,8 lần Như vậy, khẳng định LO-I hoạt chất có khả ức chế protease HIV-1 quan tâm 3.2.3 Xác định cấu trúc hợp chất LO-I Kết phân tích hợp chất LO-I cho thấy: Hợp chất LO-I thu dạng bột vô định hình màu trắng, nhiệt độ nóng chảy: 260-262 oC Phổ UV (MeOH) λmax: 202 nm Phổ IR (cm-1): 3424; 2926; 1690 Phổ ESI-MS (m/z) =455 [M-H] Phổ 1H-NMR (CD3OD+CDCl3; 500 MHz): 5,14(1H, t, 4,0, H-12), 3,07 (1H, dd, 4,5; 11,0, H-3), 2,11 (1H, d, 11,5, H-18), 1,01; 0,87; 0,86; 0,75; 0,68 (tín hiệu 3H, s, H-27; 23; 25; 26; 24), 0,89 (3H, d, 6,5, H-29), 0,79 (3H, d, 6,5, H-30) Phổ 13C-NMR (CD3OD+CDCl3; 125 MHz): 39,5 (C-1), 27,6 (C-2), 21 79,4 (C-3), 39,7 (C-4), 56,3 (C-5), 19,2 (C-6), 28,6 (C-7), 40,4 (C-8), 48,5 (C9), 37,7 (C-10), 24,1 (C-11), 126,5 (C-12), 139,2 (C-13), 42,9 (C-14), 34,0 (C15), 25,1 (C-16), 48,5 (C-17), 53,9 (C-18), 39,9 (C-19), 40,1 (C-20), 31,5 (C21), 37,8 (C-22), 28,9 (C-23), 17,5 (C-24), 16,2 (C-25), 15,9 (C-26), 24,1 (C27), 181,4 (C-28), 17,6 (C-29), 21,5 (C-30) Phổ IR cho biết phân tử LO-I có nhóm chức OH (dải hấp thụ có đỉnh 3424 cm-1) nhóm C=O (đỉnh 1690 cm-1) Phổ 1H-NMR cho biết có proton olefin có δH 5,14 ppm; có tín hiệu proton của nhóm methyl xuất dạng đỉnh đơn độ chuyển dịch từ 0,68 ppm đến 1,01ppm, hai tín hiệu nhóm CH3 xuất dạng đỉnh kép với số ghép cặp J=6,5 Hz Các phổ 13C-NMR DEPT cho biết có tổng cộng 30 tín hiệu cacbon cấu trúc hợp chất LO-I, bao gồm nhóm methyl (CH3), nhóm methylen (CH2), nhóm methin (CH), cacbon bậc (C) Trong có tín hiệu cacbon carbonyl (C=O; δc 181,4 ppm) hai cacbon olefin (δc 126,5 139,2 ppm) Dựa tất kiện phổ, chất số LO-I dự đoán triterpen khung ursan Phổ ESI-MS có đỉnh ion m/z 455 [M-H]- (negative) cho biết công thức phân tử LO-I C30H48O3 (M=456,7) Từ việc phân tích liệu phổ, kết hợp với tài liệu tham khảo hợp chất LO-I xác định acid ursolic (3β-hydroxy-urs-12-ene-28-oic-acid) 3.3 NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA ACID URSOLIC 3.3.1 Hoạt tính ức chế đặc hiệu protease HIV-1của acid ursolic Nghiên cứu ảnh hưởng acid ursolic lên hoạt độ protease HIV1 cho thấy acid ursolic ức chế mạnh protease HIV-1 với nồng độ chất 50% protease hoạt động (IC 50) 3,5 µM Tại nồng độ 20 µM acid ursolic, hoạt tính protease HIV-1 gần bị ức chế hoàn toàn Bên cạnh đó, sử dụng phương pháp Anson cải tiến ống nghiệm, thấy acid ursolic ức chế hoạt động pepsin với IC 50 2,5 mM Như 22 vậy, acid ursolic ức chế protease HIV-1 mạnh 700 lần so với ức chế pepsin, chứng tỏ chất ức chế đặc hiệu cao với protease HIV-1 Tuy nhiên, chất dùng cho protease HIV-1 dùng cho pepsin ngược lại nên khác chất làm gia tăng khác biệt mức độ ức chế hai enzyme acid ursolic 3.3.2 Cơ chế ức chế protease HIV-1 acid ursolic Nghiên cứu kiểu ức chế acid ursolic protease HIV-1 xác định sở thay đổi giá trị K m Vmax protease HIV-1 điều kiện chất ức chế acid ursolic (chỉ có dung môi DMSO hoà tan acid ursolic) so với có mặt acid ursolic nồng độ 1,5 20 µM Trong đó, Km Vmax xác định thuỷ phân chất đặc hiệu protease HIV-1 với nồng độ tăng dần dựa theo phương trình Lineweaver – Burk Kết cho thấy, có mặt acid ursolic, giá trị Km Vmax protease HIV-1 giảm Do đó, acid ursolic ức chế protease HIV-1 theo kiểu không cạnh tranh (uncompetitive) Acid ursolic triterpenoid vòng năm cạnh có công thức phân tử C30H48O3 phân lập từ Táo (Malus domestica Borkh.) vào năm 1920 Khả ức chế protease HIV-1 acid ursolic với số acid triterpen khác tinh từ dịch chiết loài thực vật Geum japonicum, họ Hoa hồng (Rosaceae) phát từ sớm Acid ursolic phân lập từ Ổi có hoạt tính thúc đẩy tăng sinh, biệt hoá hấp thụ glucose tế bào hay chống viêm, chống oxy hoá Trong nghiên cứu này, acid ursolic phân lập từ Ổi có hoạt tính ức chế protease HIV-1 với nồng độ IC50 3,5 µM tốt acid ursolic phân lập từ nấm Toả dương (Cynomorium songaricum Rupr.) thực vật khác Các kết nghiên cứu gợi ý khả phát triển sử dụng Ổi hoạt chất acid ursolic điều trị HIV 23 3.3.3 Dạng chế phẩm phù hợp acid ursolic Sau có hoạt chất, phần lớn nghiên cứu thường tìm dạng chế phẩm có hiệu sử dụng cao nhất: tăng khả hòa tan nước, tăng cường sinh khả dụng Để xác định dạng chế phẩm bảo quản phù hợp cho acid ursolic, trước tiên, tiến hành kiểm tra khả hoà tan acid ursolic dung môi khác Nồng độ thử nghiệm mg chất/300 µl dung môi hòa tan Kết cho thấy acid ursolic tan tốt (dung dịch suốt) DMSO ethanol; không tan tốt (xuất vẩn đục dù sau siêu âm) ethyl acetate nước Đối với trường hợp sử dụng dung môi hòa tan acetone, acid uroslic không tan hoàn toàn Tuy nhiên, sau siêu âm phút thu dung dịch suốt Từ kết trên, lựa chọn mẫu chế phẩm hòa tan DMSO, ethanol, acetone mẫu chế phẩm dạng bột (khi thử nghiệm hòa tan DMSO) để đánh giá tác dụng ức chế enzyme protease HIV-1 Tiếp theo, tiến hành đánh giá khả ức chế protease HIV-1 acid ursolic dạng chế phẩm khác Dạng 1: dạng bột, hòa tan dung môi DMSO trước thử phản ứng; Dạng 2,3 dạng dung dịch, hòa tan dung môi DMSO, acetone ethanol Kết cho thấy, acid ursolic dạng 1, 2, ức chế protease HIV-1 với giá trị IC50 tương ứng là: 2,0 µg/mL, 2,3 µg/mL, 4,2 µg/mL 3,9 µg/mL Như vậy, dạng dung dịch, acid ursolic hoà tan DMSO có hoạt tính ức chế protease HIV-1 cao gấp tương ứng 1,7 lần gần lần so với hoà tan acetone ethanol So sánh dạng bột, hoà DMSO trước tiến hành thí nghiệm dạng dung dịch acid ursolic bảo quản dung dịch DMSO giá trị IC 50 dạng thấp dạng Sự chênh lệch chưa đáng kể, nhiên chế phẩm bảo quản dạng bột thường ổn định không cần yêu cầu nhiệt độ khắt khe bảo quản lâu dài dạng dung dịch nên việc tạo chế phẩm acid ursolic để bảo quản dạng bột s lựa chọn 24 KẾT LUẬN Từ kết thu trình nghiên cứu, rút số kết luận sau: Đã xác định khả năng, mức độ ức chế dịch chiết phân đoạn Thạch châu, Ổi Ma hoàng lên hoạt tính phân giải chất pepsin Các phân đoạn Ổi có khả ức chế pepsin mạnh lựa chọn cho nghiên cứu cứu phân lập tinh hợp chất có hoạt tính ức chế pepsin/protease HIV-1 Đã phân lập, tinh xác định acid ursolic (3β-hydroxy-urs-12ene-28-oic-acid) từ dịch chiết ethanol Ổi có hoạt tính ức chế pepsin/protease HIV-1 mạnh Acid ursolic có hoạt tính ức chế đặc hiệu protease HIV-1 với IC50 3,5 µM theo chế không cạnh tranh Dạng chế phẩm phù hợp acid ursolic dạng bột, trước sử dụng tiến hành hoà tan hoạt chất DMSO KIẾN NGHỊ Từ trình nghiên cứu thực tế đưa số kiến nghị sau: Tối ưu hoá quy trình phân đoạn tinh acid ursolic từ Ổi Xác định số tiêu chuẩn sở chế phẩm acid ursolic (nhiệt độ nóng chảy, độ tinh sạch…) 25 [...]... EtOAc và Hx từ lá Ổi Như vậy, bước đầu chúng tôi có thể kết luận hoạt tính ức chế pepsin của các dịch chiết từ lá Ổi 19 tốt hơn dịch chiết từ lá Thạch châu và cây Ma hoàng Từ kết quả này, lá cây Ổi được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm phân lập, tinh sạch hợp chất có hoạt tính ức chế protease HIV- 1 3.2 TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ N NG ỨC CHẾ PROTEASE HIV- 1 CỦA HỢP CHẤT TỪ DỊCH CHIẾT LÁ CÂY ỔI (PSIDIUM... năng, mức độ ức chế của các dịch chiết và phân đoạn lá cây Thạch châu, lá cây Ổi và cây Ma hoàng lên hoạt tính phân giải cơ chất của pepsin Các phân đoạn lá cây Ổi có khả năng ức chế pepsin mạnh nhất được lựa chọn cho các nghiên cứu cứu phân lập và tinh sạch hợp chất có hoạt tính ức chế pepsin /protease HIV- 1 2 Đã phân lập, tinh sạch và xác định được acid ursolic (3β-hydroxy-urs-12ene-28-oic-acid) từ dịch. .. giải giảm dần hay hoạt tính ức chế pepsin của LO-I tăng dần LO-I tại nồng độ 50 mg/ml ức chế pepsin gần tương đương với pepstatin A 5 µM Kiểm tra hoạt tính ức chế protease HIV- 1 với cơ chất đặc hiệu chúng tôi thấy LO-I ức chế hơn 70% hoạt tính protease HIV- 1 tại nồng độ 2,5 µg/ml Khi so sánh khả năng ức chế protease HIV- 1 giữa LO-I và PĐ2 chúng tôi thấy, hợp chất LO-I ức chế protease HIV- 1 mạnh hơn PĐ2... Pyrenaria jonqueriana Pierre (Theaceae), lá cây Ổi Psidium guajava L (Myrtaceae) và cây Ma hoàng Ephedra distachya L (Ephedraceae) để tiếp tục phân lập, tinh sạch chất ức chế tiềm năng protease HIV- 1 và nghiên cứu tính chất của các hoạt chất thu được 3.1.1 Khả năng ức chế pepsin của của các dịch chiết và phân đoạn từ lá cây Thạch châu (Pyrenaria jonqueriana Pierre.) Cây Thạch châu Pyrenaria jonqueriana Pierre... (M=456,7) Từ việc phân tích các dữ liệu phổ, kết hợp với tài liệu tham khảo hợp chất LO-I được xác định là acid ursolic (3β-hydroxy-urs-12-ene-28-oic-acid) 3.3 NGHIÊN CỨU MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA ACID URSOLIC 3.3.1 Hoạt tính ức chế đặc hiệu protease HIV- 1của acid ursolic Nghiên cứu ảnh hưởng của acid ursolic lên hoạt độ của protease HIV1 cho thấy acid ursolic ức chế mạnh protease HIV- 1 với nồng độ cơ chất tại... với protease HIV- 1 Tuy nhiên, do cơ chất dùng cho protease HIV- 1 không thể dùng cho pepsin và ngược lại nên sự khác nhau về cơ chất có thể làm gia tăng sự khác biệt về mức độ ức chế hai enzyme này bởi acid ursolic 3.3.2 Cơ chế ức chế protease HIV- 1 của acid ursolic Nghiên cứu kiểu ức chế của acid ursolic đối với protease HIV- 1 được xác định trên cơ sở sự thay đổi các giá trị K m và Vmax của protease HIV- 1... các galloyl glucose phân lập từ cây Chiêu Liêu (Terminalia chebula) và camellia-tannin H phân lập từ cây Trà My (Camellia japonica) lần lượt thể hiện hoạt tính ức chế intergrase và protease HIV- 1 mạnh Các curcumin phân lập từ dịch chiết ethyl acetate của thân rễ cây Nghệ (Curcuma longa) cũng cho thấy hoạt tính kháng protease HIV- 1 và 10 HIV- 2 Từ dịch chiết chloroform quả thể của nấm G colossum ở Việt... Ổi phân tách rõ ràng hơn các vết của cao chiết EtOAc và đặc biệt là vết chính không bị chồng lặp với các vết khác Do đó, cao phân đoạn Hx được lựa chọn cho các nghiên cứu phân lập chất ức chế protease HIV- 1 tiếp theo 3.2.1 Kết quả tách phân đoạn và đánh giá hoạt tính ức chế pepsin /protease HIV- 1 từ cao Hx của lá Ổi Cao phân đoạn Hx từ dịch chiết ethanol tổng số của lá cây Ổi được chạy qua cột sắc ký... (3β-hydroxy-urs-12ene-28-oic-acid) từ dịch chiết ethanol của lá cây Ổi có hoạt tính ức chế pepsin /protease HIV- 1 mạnh nhất 3 Acid ursolic có hoạt tính ức chế đặc hiệu protease HIV- 1 với IC50 là 3,5 µM theo cơ chế không cạnh tranh Dạng chế phẩm phù hợp của acid ursolic là dạng bột, trước khi sử dụng tiến hành hoà tan hoạt chất trong DMSO KIẾN NGHỊ Từ quá trình nghiên cứu thực tế chúng tôi đưa ra một số kiến... đó 50% protease còn hoạt động (IC 50) là 3,5 µM Tại nồng độ 20 µM của acid ursolic, hoạt tính của protease HIV- 1 gần như bị ức chế hoàn toàn Bên cạnh đó, khi sử dụng phương pháp Anson cải tiến trong ống nghiệm, chúng tôi thấy acid ursolic ức chế hoạt động của pepsin với IC 50 là 2,5 mM Như 22 vậy, acid ursolic đã ức chế protease HIV- 1 mạnh hơn 700 lần so với ức chế pepsin, chứng tỏ chất ức chế này