ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH CHIẾT NẤM MEN LÊN KHẢ NĂNG TÍCH LUỸ CURCUMIN CỦA TẾ BÀO NGHỆ ĐEN (CURCUMA ZEDOARIA ROSCOE)

TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, TRƯỜNG ðH KHOA HỌC HUẾ TẬP 1, SỐ (2014) ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH CHIẾT NẤM MEN LÊN KHẢ NĂNG TÍCH LUỸ CURCUMIN CỦA TẾ BÀO NGHỆ ðEN (CURCUMA ZEDOARIA ROSCOE) Trần Vũ Ngọc Thi Khoa Sinh học, Trường ðại học Khoa học Huế Email: cengocthi@gmail.com TÓM TẮT Nuôi cấy tế bào huyền phù nghệ ñen có bổ sung chất kích kháng biện pháp có nhiều triển vọng việc tăng hiệu sản xuất cucumin Kết nghiên cứu bước ñầu cho thấy tế bào nghệ ñen sinh trưởng bình nuôi cấy huyền phù 250 mL ñạt sinh khối cực ñại sau 14 ngày nuôi cấy tăng 2,74 lần so với ban ñầu Dịch chiết nấm men nồng ñộ từ 0,5-4,0 g/L có tác dụng ức chế tích lũy sinh khối tế bào nghệ ñen nuôi cấy huyền phù bình 250 mL Sinh khối khô thấp nồng ñộ 4,0 g/L ñạt 6,2 g tươi (0,51 g khô), giảm 29,17% so với ñối chứng Hàm lượng curcumin tăng dần bổ sung từ 0,5-1,0 g/L dịch chiết nấm men vào môi trường nuôi cấy Hàm lượng curcumin tích lũy cao nồng ñộ dịch chiết nấm men 1,0 g/L, ñạt 31,69 µg/g khô, tăng 32,04 % so với ñối chứng Ở nồng ñộ cao 1,0 g/L, hàm lượng curcumin giảm dần Từ khóa: Curcumin, nghệ ñen, chất kích kháng, tế bào huyền phù MỞ ðẦU Sử dụng dược liệu có nguồn gốc thực vật ñể chữa bệnh ñã ñược ứng dụng rộng rãi từ lâu nhiều nơi giới Việt Nam Mặc dù ngày công nghiệp hóa dược phát triển mạnh giá trị dược liệu có nguồn gốc thực vật ñược nhiều nhà khoa học quan tâm Tuy nhiên, tác ñộng nhiều yếu tố khác mà nơi sống tự nhiên thuốc ngày bị thu hẹp Việc ñảm bảo nguồn nguyên liệu ñể tách chiết hợp chất thứ cấp dùng dược phẩm ngày khó khăn ðiều ñặt cho nhà khoa học nhà sản xuất nhiệm vụ tìm kiếm giải pháp ñể cung cấp nguyên liệu cho nguồn dược phẩm Công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật ñang phát triển mạnh trở thành phương thức hữu hiệu ñể giải vấn ñề Bằng nuôi cấy tế bào thực vật sản xuất hợp chất có giá trị dùng làm dược liệu, gia vị, hương liệu, màu nhuộm… mà chất sản xuất từ tế bào vi sinh vật tổng hợp ñường hóa học Nuôi cấy tế bào thực vật ñể sản xuất hợp chất thứ cấp ñạt ñược ñường nuôi cấy callus, nuôi cấy tế bào huyền phù bình tam giác máy lắc [1] Nuôi cấy tế bào huyền phù có bổ sung chất kích kháng thực vật biện pháp làm tăng hiệu suất tổng hợp hoạt chất sinh học tế bào, tăng hàm lượng hoạt chất sinh học cao, rút ngắn thời gian giảm chi phí sản xuất so với thu từ tự nhiên Các chất kích kháng thường ñược sử dụng nghiên cứu methyl jasmonate, acid 48 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, TRƯỜNG ðH KHOA HỌC HUẾ TẬP 1, SỐ (2014) salicylic, dịch chiết nấm men, ethrel… [6] Cây nghệ ñen (Curcuma zedoaria Roscoe) loài thân thảo ñược trồng phổ biến nhiều nước châu Á Ở Việt Nam, thường gặp nghệ ñen mọc tự nhiên nhiều ñịa phương miền núi trung du phía Bắc (Hà Giang, Lào Cai, Yên Bái…) số tỉnh miền Trung [2] Từ xưa, nghệ ñen ñược dùng loại dược liệu có giá trị cao ñể chữa nhiều bệnh ñau dày, ñiều kinh, nôn mửa, tích máu tử cung [2]… Curcumin hoạt chất sinh học nghệ ñen Curcumin có tác dụng chống ñông máu hạ huyết áp, sodium curcuminate có tác dụng chống co thắt ruột, curcuminoide secquiterpen có tác dụng chống viêm nhiễm Ngoài ra, curcumin có khả chống oxy hóa bảo vệ tế bào, kìm hãm phát sinh khối u số dạng ung thư chuột ung thư ruột kết, ung thư dày, ung thư vú ung thư buồng trứng, có tác dụng kháng khuẩn [4] Việc thu hồi hoạt chất từ nghệ ñen thiên nhiên gặp nhiều trở ngại loài có hệ số nhân thấp chịu nhiều tác ñộng ñiều kiện tự nhiên không thuận lợi, thời gian ñến tuổi thu hoạch dài, suất phụ thuộc vào mùa vụ, chi phí công lao ñộng ngày tăng… Vì vậy, nghiên cứu nuôi cấy tế bào huyền phù nghệ ñen có bổ sung chất kích kháng nhằm tăng hiệu suất thu hồi hoạt chất sinh học có tế bào nghệ ñen cần thiết có ý nghĩa Tuy nhiên, cho ñến chưa có nghiên cứu ñề cập ñến ảnh hưởng việc bổ sung chất kích kháng thực vật lên khả tích lũy curcumin ñối tượng tế bào nghệ ñen Xuất phát từ sở trên, khuôn khổ báo trình bày kết nghiên cứu “Ảnh hưởng dịch chiết nấm men lên khả tích lũy curcumin tế bào nghệ ñen (Curcuma zedoaria Roscoe)” ñể làm sở khoa học cho việc sản xuất có hiệu curcumin phương pháp nuôi cấy tế bào huyền phù, góp phần ñịnh hướng cho việc sản xuất hoạt chất thực tế ðỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ðối tượng nguyên liệu ðối tượng nghiên cứu nghệ ñen (Curcuma zedoaria Roscoe), thuộc họ Gừng (Zingiberaceae), Gừng (Zingiberales) Nguyên liệu: Tế bào callus nghệ ñen ñược cung cấp Phòng thí nghiệm Hợp chất thứ cấp, Viện Tài nguyên, Môi trường Công nghệ sinh học, ðại học Huế (nay Trung tâm Ươm tạo chuyển giao công nghệ ðại học Huế) 2.2 Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu ñược tiến hành từ tháng 2/2011 ñến tháng 5/2011 Phòng thí nghiệm Hợp chất thứ cấp, Viện Tài nguyên, Môi trường Công nghệ sinh học, ðại học Huế 49 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, TRƯỜNG ðH KHOA HỌC HUẾ TẬP 1, SỐ (2014) Tóm tắt sơ ñồ thí nghiệm Callus nghệ ñen Nhân callus Nuôi cấy tế bào huyền phù có bổ sung dịch chiết nấm men Thu sinh khối tế bào Tách chiết curcumin toàn phần ðịnh lượng curcumin 2.2.1 Nuôi cấy callus Tế bào callus ñược nuôi cấy môi trường MS (Murashige and Skoog 1962) có 30 g/L saccharose, g/L agar, bổ sung 0,5 mg/L benzyladenine (BA) 0,5 mg/L 2,4-dichlorophenoxyacetic (2,4-D), pH môi trường 5,8 ðiều kiện nuôi cấy: nhiệt ñộ 25-27oC, cường ñộ chiếu sáng 2000-3000 lux, thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày 2.2.2 Nuôi cấy tế bào huyền phù Sử dụng g callus 8-10 ngày tuổi nuôi cấy bình tam giác 250 mL chứa 50 mL môi trường MS có 30 g/L saccharose, bổ sung 0,5 mg/L BA 0,5 mg/L 2,4-D, pH môi trường 5,8 Sau 10 ngày nuôi cấy, g tế bào ñược chuyển sang môi trường có thành phần giống môi trường ban ñầu nuôi ñiều kiện cho ñến thu ñược dịch tế bào huyền phù ñồng ðiều kiện nuôi cấy: nuôi cấy máy lắc với tốc ñộ 120 vòng/phút, nhiệt ñộ 2527 C, cường ñộ chiếu sáng 500 lux, thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày o 2.2.3 Thăm dò ảnh hưởng dịch chiết nấm men lên khả tích lũy curcumin Sử dụng g callus 8-10 ngày tuổi ñược nuôi cấy bình tam giác 250 mL chứa 50 mL môi trường MS có 30 g/L saccharose, bổ sung 0,5 mg/L BA 1,5 mg/L 2,4-D, pH môi trường 5,8 Bổ sung thêm dịch chiết nấm men nồng ñộ từ 0,5-4 mg/L vào môi trường nuôi cấy huyền phù tế bào nghệ ñen ðiều kiện nuôi cấy: nuôi cấy máy lắc với tốc ñộ 120 vòng/phút, nhiệt ñộ 2527 C, cường ñộ chiếu sáng 500 lux, thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày o 50 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, TRƯỜNG ðH KHOA HỌC HUẾ TẬP 1, SỐ (2014) 2.2.4 Xác ñịnh sinh khối tế bào Tiến hành thu sinh khối tế bào từ ngày nuôi cấy thứ ñến ngày thứ 16, cách ngày, ñể xác ñịnh khối lượng tươi khô tế bào Khối lượng tươi: Dịch huyền phù tế bào ñược lọc chân không giấy lọc, rửa sinh khối tế bào nước cất từ 2-3 lần, cân ñể xác ñịnh khối lượng tươi Khối lượng khô: Khối lượng tươi tế bào ñược sấy khô 50oC ñến khối lượng không ñổi, cân ñể xác ñịnh khối lượng khô Chỉ số sinh trưởng: ñược tính tỷ lệ khối lượng tươi sau thời gian nuôi cấy (g) khối lượng tươi lúc ñưa vào nuôi cấy (g) 2.2.5 Xác ñịnh hàm lượng curcumin HPLC Tách chiết curcumin: hòa tan g bột mịn tế bào nghệ ñen 20 mL dung môi ethanol 70% Hỗn hợp ñược phá sóng siêu âm máy T700/H (Elma, ðức) 30 phút 30oC Sau ñó, thể ñược lọc giấy Whatman, bã ñược chiết lại với dung môi hết hoàn toàn (dịch chiết cuối không màu) Dịch chiết nhiều lần ñược trộn lại làm giàu máy cô quay chân không (Heidolph, ðức) Mẫu sau cô ñược hòa tan với ethanol 70% ñến 10 mL, lọc màng Milipore 0,25 µm (Sartorius, ðức) pha loãng dịch chiết 2,5 lần Phân tích HPLC: ñược thực máy HPLC Spectra System (Thermo Electron, Mỹ) chường trình ChromQuest (ver 4.2.34) Tất dung môi ñạt tiêu chuẩn phân tích ñược mua từ hãng Sigma (Mỹ) Merck (ðức) Hòa tan curcumin chuẩn (≥94%) ethanol 70% nồng ñộ từ 1-20 µg/mL ñể dựng ñường chuẩn Lấy 20 µL dịch chiết ñược ñưa vào máy HPLC Hamilton syringe ðiều kiện chạy HPLC nhiệt ñộ phòng, cột Vertisep GES C18 (5 µm; 4,6×150 mm), tốc ñộ chạy 1,2 mL/phút, thời gian chạy 10 phút, detector ñọc bước sóng 420 nm, pha tĩnh silica gel pha ñộng acetic acid 2%: acetonitrile (10:90, v/v) Hàm lượng curcumin (% khối lượng khô) tế bào ñược tính theo phương trình ñường chuẩn y = 155072 x (R2 = 0,993) 2.2.6 Xử lý thống kê Mỗi thí nghiệm ñược lặp lại lần (n≥30) ñể tính trung bình mẫu phân tích Duncan’s test (p