Nghiên cứu điều trị thực nghiệm bệnh xơ gan trên mô hình chuột bị xơ gan sử dụng liệu pháp tế bào gốc

Ở Việt Nam, chưa có nhiều nghiên cứu về liệu pháp tế bào gốc trong điều trị xơ gan, do đó việc phát triển liệu pháp mới ứng dụng tế bào gốc trong điều trị xơ gan là rất cấp thiết và sẽ m

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM

TRƯỜNG ĐH KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRƯƠNG HẢI NHUNG

NGHIÊN CỨU ĐIỀU TRỊ THỰC NGHIỆM BỆNH XƠ GAN TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT BỊ XƠ GAN SỬ DỤNG

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án họp tại

vào lúc giờ ngày tháng năm

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

- Thư viện Khoa học Tổng hợp Tp.HCM

- Thư viện Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên

MỞ ĐẦU

Gan là cơ quan có khả năng tái sinh nhưng trong các trường hợp tổn thương mạn tính khả năng tự tái tạo của gan không còn và sau đó dẫn đến tình trạng xơ hóa Hiện nay, xơ gan được xếp vào danh sách 25 căn bệnh gây tử vong cao nhất trên toàn thế giới Việt Nam là nước có tỷ lệ viêm gan và xơ gan rất cao (~20%) so với nhiều nước trên Thế giới Các biện pháp điều trị xơ gan hiện tại chưa thực sự mang lại kết quả như mong đợi

Hiện nay, ghép gan được cho là phương pháp điều trị hiệu quả và là lựa chọn tốt nhất cho các bệnh nhân mắc bệnh gan giai đoạn cuối Rào cản lớn nhất của ghép gan là sự khan hiếm nguồn tạng Ngoài ra, ghép gan trên bệnh nhân xơ gan có nhiều rủi ro liên quan đến quá trình phẫu thuật

Với các kiến thức nền tảng và chuyên sâu về tế bào gốc và y học tái tạo, các nhà khoa học có thể đặt niềm tin vào việc sử dụng tế bào gốc trong tái tạo mô gan ở các bệnh nhân xơ gan Liệu pháp sử dụng tế bào gốc trưởng thành có nhiều ưu điểm như: nguồn thu nhận dồi dào, có thể ghép tự thân, vượt qua rào cản về đạo lí Nhiều nghiên cứu lâm sàng và cận lâm sàng trên thế giới, đã cho thấy những phát hiện đáng chú ý về hiệu quả và vai trò của tế bào gốc

Ở Việt Nam, chưa có nhiều nghiên cứu về liệu pháp tế bào gốc trong điều trị xơ gan, do đó việc phát triển liệu pháp mới ứng dụng tế bào gốc trong điều trị xơ gan là rất cấp thiết và sẽ mở ra hướng mới trong điều trị xơ gan nói riêng và các bệnh về thoái hoá tế bào nói chung Từ cơ sở

phân tích và nhận định, chúng tôi đề xuất đề tài “Nghiên cứu điều trị thực nghiệm bệnh xơ gan trên mô hình chuột bị xơ gan sử dụng liệu pháp tế bào gốc” nhằm đánh giá hiệu quả và vai trò điều trị của tế bào gốc trung

mô từ mô mỡ tự thân trên mô hình chuột xơ gan

MỤC TIÊU CỦA LUẬN ÁN

Luận án được tiến hành với mục tiêu chung là nghiên cứu điều trị thực nghiệm chuột bệnh xơ gan bằng tế bào gốc Mục tiêu cụ thể như sau:

- Thu nhận được tế bào gốc trung mô từ mô mỡ chuột (mADSC) xơ gan

- Gây tạo được mô hình bệnh xơ gan trên chuột bằng CCl4

- Phân tích và đánh giá hiệu quả điều trị thực nghiệm của tế bào gốc

mô mỡ trên chuột bệnh xơ gan

- Phân tích và đánh giá vai trò điều trị của tế bào gốc trung mô từ mô

mỡ trên mô hình chuột thực nghiệm

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU LUẬN ÁN:

Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA LUẬN ÁN:

Nghiên cứu này sử dụng nguồn tế bào gốc trưởng thành được thu nhận từ nguồn mẫu không gây tranh cãi về mặt đạo lí Mô hình chuột bị xơ gan bằng CCL4, đây là mô hình kinh điển, dễ tiếp cận, hiệu quả của liệu pháp

dễ dàng đánh giá và có độ tin cậy cao Kết quả nghiên cứu của luận án rút

ra được một số kết luận có ý nghĩa khoa học như sau:

- mADSC thu nhận từ chuột xơ gan có biểu hiện cao các gen liên quan đến tế bào gan mADSC biểu hiện dương tính mạnh CYP1A1

và HGF

- CCl4 1ml/kg (phác đồ uống 3 lần/tuần mỗi 02 ngày và kéo dài trong 11 tuần) là liều tối ưu để gây tạo mô hình chuột xơ gan trên giống chuột đực Swiss

- Phác đồ mADSC (5.105 tế bào/con) tự thân cho hiệu quả cải thiện các chỉ tiêu liên quan đến xơ hoá trên chuột 100% chuột sau điều trị mADSC kết hợp với huyết tương giàu tiểu cầu (PRP) cho hiệu quả điều trị vượt trội hơn so với sử dụng mADSC riêng lẻ

- Khi được nuôi cấy trong môi trường chứa dịch chiết gan xơ, mADSC biến đổi theo chiều hướng biệt hoá thành tế bào gan sau

21 ngày cảm ứng Sau khi ghép vào cơ thể chuột (truyền toàn thân), mADSC có khả năng: 1 Di cư và “homing” về gan; 2 Ức chế các

tế bào bạch cầu hạt; 3 Kích thích sự biểu hiện các gen tan xơ hoá;

4 Biệt hoá in vivo thành tế bào gan sau 21 ngày cấy ghép

BỐ CỤC CỦA LUẬN ÁN:

Luận án có 169 trang với 24 Bảng và 52 Hình

Ngoài phần mở đầu (3 trang), kết luận – kiến nghị (2 trang), danh mục công

bố (2 trang) và tài liệu tham khảo (22 trang) luận án được chia thành các chương như sau

Chương 1: Tổng quan (38 trang)

Chương 2: Vật liệu - phương pháp (38 trang)

Chương 3: Kết quả - biện luận (52 trang)

ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN:

1 Đã nghiên cứu và đánh giá được mức độ biểu hiện các gen/protein liên quan đến tế bào gan trên mADSC Kết quả cho thấy: mADSC biểu hiện cao các gen liên quan đến tế bào gan như ALB, CK18, CK19, TNF, c-met, CYP1A1, AFP, MUC1 và LDL receptor

mADSC không biểu hiện HNF4α mADSC biểu hiện dương tính mạnh với các protein liên quan đến tế bào gan như CYP1A1 và HGF; dương tính trung bình với các protein anfa-fetoprotein, AAT

và Albumin Kết quả thu được không chỉ mang tính chất tham khảo

mà còn cung cấp thêm cơ sở khoa học cho đề xuất ứng dụng ADSC trong điều trị xơ gan

2 Đã nghiên cứu thử nghiệm điều trị thành công chuột bệnh xơ gan

do CCl4 bằng liệu pháp cấy ghép mADSC có và không có kết hợp với PRP Liệu pháp điều trị an toàn, 100% chuột sống và cải thiện các chỉ tiêu sau ghép Hiện tại, đã có các công bố trên thế giới về việc ứng dụng ADSC và PRP trong điều trị xơ gan Tuy nhiên, nghiên cứu kết hợp 2 thành phần này thì vẫn chưa được công bố

3 Đã nghiên cứu và phân tích được vai trò điều trị của mADSC trên chuột xơ gan Kết quả cho thấy mADSC có khả năng di cư và

“homing” về gan, số lượng tế bào tồn tại ở gan đạt cực đại sau 3 ngày ghép (70%) Việc ghép mADSC giúp giảm tế bào viêm và kích thích tăng biểu hiện các gen tan xơ Trong giới hạn nghiên cứu

này, mADSC đã biệt hoá thành tế bào gan trong điều kiện in vitro (dịch chiết gan xơ) và in vivo sau 21 ngày

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:

Sử dụng các phương pháp phân lập và nuôi cấy tế bào để tăng sinh

Sử dụng máy phân tích tế bào theo dòng chảy (flow cytometer) để đánh giá kiểu hình miễn dịch, phân tích máu ngoại vi và đánh giá sự di cư của tế bào

Sử dụng phương pháp xử lý thống kê Student's t-Tests (độ tin cậy

là 0.05) trong phân tích số liệu

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1 Kết quả nội dung 1: Thu nhận, nuôi cấy tăng sinh và xác định đặc điểm của tế bào gốc trung mô từ mô mỡ chuột

CCl4

Kết quả thu nhận tế bào từ mô mỡ chuột xơ gan (cỡ mẫu = 5) cho thấy các

tế bào sau khi phân tách có tỷ lệ sống khoảng 85% (Bảng 3.1), tế bào sau khi thu nhận được nuôi cấy để tăng sinh số lượng tế bào gốc trung mô ứng viên phục vụ cho các đánh giá tiếp theo

Bảng 3 1 Kết quả thu nhận tế bào đơn từ mô mỡ chuột xơ gan

Hình thái tế bào sau nuôi cấy

mADSC là tế bào có khả năng bám dính, dạng hình thoi, thuôn dài hai đầu đặc trưng của tế bào gốc trung mô Sau 72 giờ, tế bào gốc trung mô bắt đầu trải trên bề mặt bình nuôi, có hình dạng đặc trưng (Hình 3.1) Các tế bào sau cấy chuyền lần đầu có tốc độ tăng trưởng nhanh hơn khi so với các tế bào sơ cấp, sau một tuần các tế bào sẽ đạt mật độ 70-80% diện tích bề mặt nuôi cấy, hình dạng các tế bào tương đối đồng nhất, hình dạng giống nguyên bào sợi

Hình 3 1 Hình thái tế bào sau nuôi cấy A Thời điểm 0 giờ; B Thời điểm

72 giờ; C Sau cấy chuyền lần 3; D Sau cấy chuyền lần 10

3.1.2 Đánh giá kiểu hình miễn dịch, khả năng biệt hoá thành

tế bào mỡ của mADSC

Tế bào gốc ở các thế hệ thứ 3, 5, và 10 được đánh giá kiểu hình miễn dịch bằng phương pháp flow cytometry (dòng chảy tế bào) (bảng 3.2)

Nhận xét:

mADSC thu nhận được có kiểu hình miễn dịch như sau: CD14-/CD34/CD45-/CD44+/CD90+/CD105+, đây là kiểu hình đặc trưng của tế bào gốc trung mô Kiểu hình này duy trì qua nhiều thế hệ nuôi cấy (từ P3-P10)

-Bảng 3 2 Tổng kết phần trăm biểu hiện marker của mADSC ở các thế hệ

3.1.3 Kết quả đánh giá khả năng biệt hoá thành tế bào mỡ

Các mADSC được cảm ứng trong môi trường biệt hoá thành mỡ đã chuyển dạng và tích luỹ các giọt mỡ trong tế bào chất Nhuộm Oil Red O cho kết quả dương tính (Hình 3.2)

Hình 3 2 mADSC sau 21 ngày biệt hoá thành tế bào mỡ A Tế bào chứa giọt mỡ bên trong tế bào chất; B Tế bào mỡ dương tính với thuốc nhuộm Oil red O (màu đỏ)

Theo các tiêu chí đã đặt ra, chúng tôi kết luận rằng mADSC phân lập được theo quy trình này là phù hợp cho các nghiên cứu tiếp theo Kết quả này tương tự với các nghiên cứu khác [141, 252]

3.2 Kết quả nội dung 2: Nghiên cứu tiềm năng của ADSCs trong trị liệu bệnh gan thông qua đánh giá sự biểu hiện gen liên quan

đến dòng tế bào gan và khả năng biệt hoá thành tế bào gan in

vitro của mADSC

3.2.1 Kết quả đánh giá sự biểu hiện các gen: HGF, HNF4α, CK18, CK19, c-met, CYP1A1, ALB, AFP và SDF-1 của mADSC P3

Kết quả cho thấy mADSC gần như không biểu hiện HNF4α Ngược lại, mADSC biểu hiện một lượng cao xấp xỉ các gen đặc trưng cho tế bào gan (ALB, CK18, CK19, c-met, CYP1A1, MUC1 và LDL receptor), trong đó ALB và LDL biểu hiện ở mức thấp hơn so với các gen còn lại Điều này gợi ý cho tiềm năng điều trị các bệnh về gan của nguồn tế bào gốc này Kết quả phân tích FCM một số protein liên quan đến gan trên mADSC P3 như trình bày ở Bảng 3 3

Hình 3 3 Kết quả đánh giá sự biểu hiện các protein liên quan đến tế bào gan

Bảng 3 3 Kết quả phân tích phần trăm dương tính các protein liên quan đến tế bào gan trên dòng mADSC P3

Nhận xét: mADSC ở thế hệ P3 biểu hiện mạnh các protein HGF và CYP1A1, biểu hiện ở mức trung bình yếu (từ 30-50%) các marker như anfa – FP, AAT và ALB Kết quả này củng cố thêm cho kết quả đánh giá

sự biểu hiện gen đã nêu trên Việc biểu hiện mạnh HGF chỉ ra khả năng tiết yếu tố HGF, nhân tố quan trọng trong quá trình tái tạo gan

3.2.2 Thử nghiệm cảm ứng mADSC thành tế bào gan sử dụng môi trường bổ sung yếu tố tăng trưởng và các chất cảm ứng khác

Sự thay đổi hình thái tế bào sau khi cảm ứng bằng môi trường

Tại thời điểm 10 ngày sau cảm ứng, mADSC vẫn duy trì hình dạng giống nguyên bào sợi Từ ngày 14 đến ngày thứ 21, mADSC thay đổi thành dạng

tế bào hình oval và hình tròn với vùng nhân lõm và dễ quan sát (Hình 3.4)

Kết quả này tương tự nghiên cứu của Yoshihiro Kamada et al (2009)

Hình 3 4 Sự thay đổi hình dạng của mADSC khi nuôi trong môi trường biệt hoá gan A mADSC chưa biệt hoá; B Tế bào HepG2; C Sau 14 ngày cảm ứng; D Sau 21 ngày cảm ứng Mũi tên đen: tế bào hình đa giác; Mũi tên trắng: tế bào hình sỏi, nhân lõm và đa nhân

Sự thay đổi biểu hiện các protein

Hình 3 5 Kết quả nhuộm kháng thể kháng AAT và ALB sau biệt hoá bằng hoá chất

Kết quả đánh giá sự biểu hiện protein AAT và ALB cho thấy, thời điểm ngày 14, tế bào biểu hiện ít 02 protein này Tuy nhiên đến thời điểm 21 ngày, chúng tôi ghi nhận mADSC dương tính mạnh với AAT và ALB

(Hình 3.5) Kết quả này khác biệt với mẫu chứng âm (mADSC không biệt hoá) và tương đồng với mẫu chứng dương là HepG2

Sự thay đổi khả năng dự trữ glycogen

Kết quả nhuộm PAS cho thấy mADSC 21 ngày sau biệt hoá dương tính với thuốc nhuộm (có màu đỏ, Hình 3.6) Kết quả này khác biệt với mẫu chứng

âm (mADSC không biệt hoá) và tương đồng với mẫu chứng dương là HepG2

Hình 3 6 Kết quả nhuộm PAS sau 21 ngày cảm ứng, sử dụng HepG2 là chứng dương và mADSC nuôi trong môi trường bổ sung nhân tố biệt hoá làm chứng âm

CCl4 (1.0 ml/kg) gây ra sự giảm khối lượng cơ thể và tỷ lệ chết trên chuột sau 8 tuần

Vào tuần thứ 4, khối lượng cơ thể của chuột ở lô cho uống CCl4 giảm so với nhóm đối chứng Nhóm II (1,0 ml/kg) giảm khối lượng từ tuần

0 đến tuần 8 (27,91 ± 2,2 xuống 23,90 ± 2,51g), kết quả giảm khối lượng tương tự được ghi nhận ở nhóm III (1,2 ml/kg) Trong khi đó, nhóm đối chứng và nhóm I (0,8 ml/kg) vẫn tăng trọng sau 8 tuần thí nghiệm

Sau 8 tuần, chúng tôi ghi nhận chuột tử vong vào ngày đầu tiên của tuần 1 ở tất cả các lô xử lý với CCl4 Trong thời gian 7 tuần tiếp theo không

có ghi nhận thêm trường hợp tử vong ở các lô

Sự thay đổi các men AST/ALT sau 8 tuần xử lý CCl4

Lô ĐC: các men gan này ở mức bình thường, kết quả này tương đồng với

công bố của Domitrovic, R và cs (2009) [61]

Lô I không có sự khác biệt về hoạt độ ALT/AST giữa tuần 0 và tuần 8

Lô II, lô III có sự khác biệt ở cả 2 men AST, ALT giữa tuần 0 với tuần 8 Ở tuần thứ 8 cả men AST và ALT đều cao hơn so với tuần 0 kết quả này

tương tự của Chia-Fang Tsai và cộng sự (2009) [230]

Sự thay đổi biểu hiện một số gen liên quan đến xơ hoá

Sau 8 tuần xử lý với CCl4, fibronectin biểu hiện ở nhóm II, III và không biểu hiện ở nhóm I và nhóm đối chứng Procollagen anfa 1 biểu hiện nhiều hơn ở nhóm thí nghiệm khi so sánh với nhóm đối chứng (Hình 3.11)

Hình 3 7 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR

Sự thay đổi hình thái và mô học

Lô ĐC: bề mặt gan nhẵn bóng, gan màu đỏ tươi, kích thước gan bình thường Lô I: bề mặt gan có nhiều nốt sần, màu gan đậm màu, gan săn lại không có sự thay đổi rõ về kích thước gan Lô II, Lô III bề mặt gan có nhiều nốt sần, màu gan nhạt hơn gan bình thường, gan săn lại không có sự

thay đổi rõ về kích thước gan

Kết quả cho thấy CCl4 đã tác động đến tế bào gan, gây các tổn thương và làm thay đổi đến hình thái bên ngoài của gan chuột

Nhận xét về mô học và mức độ xơ hoá

Hình 3.8 Kết quả nhuộm HE A Đối

chứng; B, C, D Nhóm I, II, III

Bảng 3.4 Mức độ viêm và xơ gan được đọc theo hệ thống tính điểm Knodell-Ishak

Nhóm đối chứng có mức độ viêm là 1/18 và không có thay đổi về cấu trúc mạch máu, ống mật

Ngược lại, nhóm thí nghiệm có các biểu hiện chung là sự hoại tử ở một số vùng trong tiểu thùy, quanh khoảng cửa và quanh tĩnh mạch trung tâm Nhân tế bào phân mảnh, có sự xuất hiện các dãy tế bào lympho và các dãy xơ, mô gan được thay thế bằng mô liên kết, tất cả các mẫu được ghi nhận là xơ gan từ 3-5/6 (theo hệ thống tính đểm của HAI) (Bảng 3.4, Hình 3.8) Từ các kết quả ghi nhận được, chúng tôi chọn CCl4 liều 1.0 ml/kg là liều tối ưu để xây dựng mô hình chuột Swiss xơ gan

3.3.2 Kết quả gây tạo mô hình xơ gan với liều CCl4 đã chuẩn hoá

Sự thay đổi khối lượng và men gan

Khối lượng cơ thể chuột thay đổi rõ rệt sau 11 tuần cảm ứng với CCl4 (1.00 ml/kg) Sự tăng AST và ALT trong máu cho thấy hiệu quả gây độc của CCl4 trên gan chuột Ngoài ra, sự thay đổi bilirubin trực tiếp và albmin cũng chỉ ra sự thay đổi chức năng gan sau khi xử lý với CCl4 (Bảng 3.5) Kết quả này tương tự với nghiên cứu của Ohashi và cs (2012)[170]

Hơn nữa, tỉ lệ AST/ALT trong nhóm mô hình nhỏ hơn 1 đã chỉ ra tình trạng viêm cấp tính trên nhóm chuột uống CCl4 [228] Tuy nhiên, để khẳng định mức độ xơ gan thì việc đánh giá các chỉ tiêu về phân tử và mô học là cần thiết

Sự thay đổi mức độ biểu hiện các gen xơ hoá

Kết quả cho thấy mức độ biểu hiện gen của fibronectin, TGF-β1, integrin, nt5e, và procollagen thay đổi so với nhóm chứng Integrin, fibronectin và procollagen tăng đáng kể trên nhóm mô hình TGF-β1 và nt5e tăng nhẹ so với nhóm chứng (Hình 3.9)

Sự thay đổi cấu trúc mô học và chỉ số xơ gan

Cấu trúc vi thể cho thấy sự khác biệt rõ rệt giữa nhóm mô hình và nhóm chứng Trên nhóm mô hình (CCl4 1 ml/kg, 11 tuần), các tế bào gan bị hoại

tử nhiều, tại vị trí xung quanh mạch máu và ống mật xuất hiện các dãy sợi collagen Sợi collagen chiếm phần lớn cấu trúc gan (Hình 3.10) 100% chuột được ghi nhận ở các mức độ xơ 3-5/6

Bảng 3.5 Chỉ số các loại men gan

Hình 3.9 Biểu đồ so sánh mức độ biểu hiện các gen giữa nhóm thí nghiệm