NGHIÊN CỨU ĐIỀU TRỊ THỰC NGHIỆM BỆNH MẠCH VÀNH BẰNG CẤY GHÉP TẾ BÀO GỐC TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT

Với sự phát triển của khoa học hiện nay, đặc biệt là việc phát hiện ra tế bào gốc, phương pháp mới sử dụng tế bào gốc để điều trị bệnh mạch vành được nghĩ đến và đã có một số nghiên cứu

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Họ tên NCS: PHẠM LÊ BỬU TRÚC

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU ĐIỀU TRỊ THỰC NGHIỆM BỆNH MẠCH VÀNH BẰNG CẤY GHÉP TẾ BÀO GỐC

TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT

Chuyên ngành: SINH LÝ HỌC NGƯỜI VÀ ĐỘNG VẬT

Cán bộ hướng dẫn : PGS TS PHẠM THÀNH HỔ

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh mạch vành là một loại bệnh tim thường gặp nhất, nguyên nhân do động mạch vành

xơ vữa làm tim bị thiếu máu cục bộ, gây suy tim và đột quỵ có thể dẫn đến tử vong ở bệnh nhân Theo Tổ chức Y tế Thế giới, mỗi năm có khoảng 17 triệu người trên hành tinh chết vì bệnh tim mạch, con số này được dự đoán sẽ tăng lên 25 triệu vào năm 2020 Tại Việt Nam, theo thống kê của Viện Tim mạch Việt Nam, hàng năm có đến hàng triệu người bị bệnh mạch vành và khoảng 10% trong số bệnh nhân này tử vong do nhồi máu cơ tim Hiện nay, có nhiều phương pháp điều trị bệnh mạch vành như điều chỉnh lối sống, dùng thuốc, can thiệp động mạch vành qua da hay

mổ bắc cầu nối động mạch vành Các phương pháp điều trị này gây xâm lấn và buộc bệnh nhân phải sử dụng thuốc suốt đời Với sự phát triển của khoa học hiện nay, đặc biệt là việc phát hiện

ra tế bào gốc, phương pháp mới sử dụng tế bào gốc để điều trị bệnh mạch vành được nghĩ đến và

đã có một số nghiên cứu ứng dụng tế bào trong điều trị bệnh mạch vành Tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa có kết quả nghiên cứu nào về việc sử dụng tế bào gốc trung mô/nội mô từ máu cuống rốn điều trị bệnh mạch vành được công bố trên các Tạp chí Khoa học chuyên ngành, cũng như chưa có nghiên cứu nào về việc đánh giá, theo dõi sự tồn tại của tế bào gốc khi ghép hay vai trò

của tế bào gốc trong cấy ghép Do đó, việc tiến hành đề tài “Nghiên cứu điều trị thực nghiệm bệnh mạch vành bằng cấy ghép tế bào gốc trên mô hình chuột” là phù hợp với xu thế Thế giới cũng như định hướng của nước ta trong việc điều trị bệnh mạch vành

2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

- Chuẩn hóa được các kĩ thuật thu nhận tế bào gốc trung mô, tế bào gốc nội mô từ máu cuống rốn người và biệt hóa thành công tế bào gốc trung mô máu cuống rốn người thành tế bào giống tế bào cơ tim

- Khảo sát và đánh giá được tác động của việc ghép tế bào giống cơ tim được biệt hóa từ tế bào gốc trung mô, hay tế bào gốc nội mô từ máu cuống rốn người hoặc kết hợp 2 nguồn tế bào này lên sự phục hồi bệnh mạch vành thực nghiệm

3 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU

3.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Các bệnh về động mạch nói chung đã được nghiên cứu nhiều trên mô hình động vật bao gồm các bệnh suy tim, thiếu máu cục bộ cơ tim, tắt nghẽn động mạch vành, thiếu máu cục bộ chi… Nhiều đối tượng tế bào được thử nghiệm điều trị bệnh tim mạch như tế bào gốc phôi, tế bào gốc trung mô, tế bào gốc tạo máu, tế bào gốc nội mô Murohara phân lập các tế bào đơn nhân từ máu cuống rốn và ngoại vi, chọn lọc tế bào CD34+

, sau đó cấy ghép các tế bào này vào

mô hình chuột thiếu máu chi Kết quả cho thấy có đáp ứng hình thành mạch máu mới cũng như

sự biểu hiện tăng dòng chảy của máu và tăng mật độ mao mạch ở vùng cách xa vùng động mạch đùi đã thắt [20, 81, 108] Nghiên cứu tương tự của Botta hướng tới việc thu nhận các tế bào CD34+/KDR được phân lập từ máu cuống rốn, sau đó tiêm vào cơ tim chuột NOD/SCID ngay sau khi thắt động mạch vành trước Kết quả cho thấy có sự cải thiện động học máu trong suốt khoảng thời gian 5 tháng và có sự định vị của các nhân tế bào người được nhuộm miễn dịch trong cơ tim của chuột Tuy nhiên chưa xác định được liệu các tế bào cấy ghép có dung hợp hay biệt hóa thành tế bào cơ tim hay không.[27]Việc ứng dụng tế bào gốc nội mô máu cuống rốn người (CD34+/CD133+) lên mô hình chuột thiếu máu cục bộ ở chi chưa được công bố (theo kết quả tìm kiếm trên Cơ sơ Dữ liệu Sinh học NCBI đến tháng 6/2009) Như vậy, các công bố sử dụng 4 nguồn tế bào trên cho điều trị bệnh này đều cho thấy có dấu hiệu tốt trên mô hình chuột, đặc biệt có sự xuất hiện, hình thành nhiều mạch máu mới [101, 102, 103]

Ở người, việc thử nghiệm điều trị các bệnh động mạch ngoại biên được thử nghiệm với nhiều kết quả rất khác nhau Đến nay, có 2 nguồn tế bào được cho ghép sử dụng trên người: nguyên bào cơ xương và tế bào gốc tủy xương hay tế bào gốc huy động từ máu ngoại vi Bệnh nhân đầu tiên ứng dụng liệu pháp này được tiêm tế bào trực tiếp vào màng ngoài tim Trong thử nghiệm này, Menasche và cộng sự đã tiêm các nguyên bào cơ xương tự thân vào cơ tim nhồi máu không còn sống, không tạo mạch cho 10 bệnh nhân bị suy tim nhồi máu Vào cuối tháng 11, thử nghiệm cho thấy có sự cải thiện chức năng tim và có sự gia tăng sức sống của mô xơ ở tất cả các bệnh nhân Không có trường hợp tử vong ngay sau khi phẫu thuật, chỉ có một trường hợp chết muộn xảy ra do đột quỵ sau hơn 1 năm cấy ghép Điều đáng ghi nhận trong các thử nghiệm này là sự cải thiện sức đập cơ tim đáng kể ở 4 bệnh nhân.[78,82] Nghiên cứu của Orlic và cộng

sự cũng cho kết quả tương tự về sự cải thiện chức năng tim sau 3 tháng tiêm tế bào vào 12 bệnh nhân nhồi máu cơ tim Trong 12 bệnh nhân này chỉ có 1 bệnh nhân không cho thấy sự cải thiện chức năng của tim [90] Tương tự, Ballard và cộng sự đã thử nghiệm tiêm các tế bào đơn nhân tự thân từ tủy xương vào 5 năm bệnh nhân Một năm sau khi tiêm, 3 trong 5 bệnh nhân cho thấy có

sự cải thiện sức bơm trong vùng tổn thương.[116] Trong một thí nghiệm khác, Strauer tiến hành truyền các tế bào đơn nhân tủy xương tự thân cho 10 bệnh nhân, trong khi Assmus đánh giá việc

sử dụng các tế bào tiền thân thu từ tủy xương và máu ngoại vi ở 20 bệnh nhân Tất cả các bệnh nhân này được theo dõi trong 3-4 tháng sau khi truyền và được so sánh với các bệnh nhân làm đối chứng Kết quả cho thấy việc truyền tế bào làm kích thích vùng nhồi máu và cải thiện sức tống máu của tim và sức co cục bộ và toàn bộ tim.[22, 29, 106] Sự thành công của các thử nghiệm ban đầu đã kích thích Wollert và cộng sự tiến hành thử nghiệm để kiểm tra tính an toàn

và hiệu quả của liệu pháp tế bào trên bệnh nhân thiếu máu cơ tim Sáu mươi bệnh nhân được truyền các tế bào tủy xương tự thân vào mạch vành Sau 6 tháng, không có tác động phụ nào được báo cáo.[79, 120, 121] Sau đó, Cheng và cộng sự cũng tiến hành thử nghiệm tương tự trên

69 bệnh nhân và cũng cho thấy sau 3 tháng, các bệnh nhân nhận tế bào có sự cải thiện đáng kể về sức bơm cơ tim [83] Tuy việc sử dụng các nguồn tế bào tự thân như nguyên bào cơ xương, tế bào gốc từ tủy xương, máu ngoại vi cho kết quả tốt nhưng liệu pháp này cũng gặp nhiều hạn chế

vì lượng tế bào gốc từ các nguồn này ít và giảm theo tuổi bệnh nhân Do đó, nhiều nhà nghiên cứu cho rằng máu cuống rốn là nguồn tế bào gốc hữu hiệu trong việc điều trị các bệnh này vì chúng dồi dào, dễ thu nhận và luôn tươi mới [127]

3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Theo cơ sở dữ liệu khoa học của Trung tâm Thông tin và Khoa học Công nghệ Quốc gia (đến tháng 6/2009) vẫn chưa có bài báo hay công trình nghiên cứu nào công bố về các vấn đề liên quan đến việc sử dụng tế bào gốc nội mô/trung mô trong điều trị nghẽn động mạch hay thử nghiệm tác động tăng sinh mạch máu mới của tế bào gốc

Một số phương pháp điều trị thiếu máu cục bộ được sử dụng trên người đã được khảo sát

như laser nội mạch (Nguyễn Trọng Lưu, 2005), sử dụng các kĩ thuật lấy huyết khối, giải phẫu

(Trần Công Quyền, 2006; Đoàn Quốc Hưng, 2006)…

Việc thu nhận và biệt hóa tế bào gốc được tiến hành bởi một số nhóm nghiên cứu ở Phòng thí nghiệm Tế bào Gốc, Đại học Khoa học Tự nhiên Tp.HCM [10-12]

Các thử nghiệm ghép tế bào lâm sàng được thực hiện trên bệnh nhân bạch cầu mạn dòng

tủy, bệnh nhân thalasemia (Trần Văn Bé, 1995), bệnh nhân bạch cầu cấp dòng lympho (Trần

Văn Bé, 2002), bệnh nhân khớp giả thân xương chày (Nguyễn Mạnh Khánh, 2007)

4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Nội dung 1: Nghiên cứu tạo và đánh giá mô hình chuột bệnh mạch vành [122]

Mô hình chuột tắc nghẽn mạch vành được tạo bằng cách thắt động mạch vành cung cấp

máu nuôi tim (theo phương pháp 1)

Chuột sau khi gây mô hình được đánh giá dựa trên các tiêu chí (theo phương pháp 8):

(1) Sự thay đổi sinh lí tuần hoàn

o Sự tăng huyết áp và rối loạn hoạt động chức năng của tim

o Đo kích thước vùng nhồi máu và vùng hư hại

(2) Đánh giá sự thay đổi ở mức gen, protein và tế bào

o Thay đổi sự biểu hiện gen, xơ hóa và sự chết các tế bào cơ tim

o Hoạt hóa các nhân tố tự tiết và cận tiết bao gồm sự giải phóng các nhân tố tăng trưởng và cytokine

Kết quả: Mô hình chuột tắc nghẽn mạch vành đạt yêu cầu cho nghiên cứu cấy ghép điều trị

Nội dung 2: Nghiên cứu thu nhận và tăng sinh tế bào gốc nội mô và tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn người

2.1 Nghiên cứu phân lập và tăng sinh tế bào gốc nội mô từ máu cuống rốn người (theo

phương pháp 4) [20, 123]

Tế bào gốc nội mô từ máu cuống rốn người được tiến hành thu nhận theo các phương pháp của Xiao Wu và cộng sự (2007) Quần thể tế bào gốc nội mô có khả năng tái tạo mạch máu mới được thu nhận dựa vào chọn lọc marker CD34+/CD133+

Máu cuống rốn được được làm giàu tế bào có nhân bằng phương pháp li tâm trên gradient Ficoll Tế bào đơn nhân được làm giàu và nuôi cấy chọn lọc tế bào CD34+/CD133+ bằng cách nuôi cấy trên môi trường chuyên biệt EGM-2 Sau đó, quần thể tế bào gốc nội mô được nuôi cấy tăng sinh và thu nhận Quần thể tế bào này được đánh giá 1ại sự biểu hiện marker CD34+/CD133+ bằng kĩ thuật flow cytometry Quần thể tế bào với 90% CD34+/CD133+ được

sử dụng cho cấy ghép ở Nội dung 3

Kết quả: Quy trình thu nhận và nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc nội mô và quần thể tế bào gốc nội

mô đạt độ tinh sạch từ 90% trở lên

2.2 Nghiên cứu thu nhận và tăng sinh tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn người

(theo phương pháp 3)

Tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn người được tiến hành thu nhận theo các phương pháp của Oscar và cộng sự (2004) Tế bào gốc trung mô được chọn lọc dựa trên các marker bề mặt, khả năng tự làm mới và khả năng biệt hóa

Máu cuống rốn được làm giàu tế bào có nhân bằng phương pháp li tâm trên gradient Ficoll,

quần thể tế bào đơn nhân được nuôi cấy trong môi trường IMDM dành cho tế bào bám dính Quần thể tế bào bám dính được đánh giá marker bề mặt: CD13, CD14, CD34, CD44, CD45, CD73, CD90, CD105, CD106, CD117, CD166, HLA-DR, khả năng tự làm mới và khả năng biệt hóa Quần thể tế bào biểu hiện marker đặc trưng ở độ tinh sạch 90% trở lên sẽ được sử dụng cho Nôi dung 4

Kết quả: Quy trình thu nhận và nuôi cấy tế bào gốc trung mô Dòng tế bào trung mô từ máu

cuống rốn người đạt độ tinh sạch từ 90% trở lên

Nội dung 3: Đánh giá hiệu quả điều trị và vai trò của tế bào gốc nội mô trong cấy ghép điều trị bệnh mạch vành trên mô hình chuột

3.1 Đánh giá hiệu quả điều trị của tế bào gốc nội mô

Tế bào gốc nội mô CD34+/CD133+ từ máu cuống rốn có khả năng hình mạch máu mới

trong mô hình chuột suy giảm miễn dịch Tế bào gốc này vừa có khả năng biệt hóa thành tế bào máu, vừa có khả năng hình thành tế bào nội mô mạch máu

Để đánh giá hiệu quả điều trị, tế bào gốc nội mô được ghép theo các phác đồ (nghiệm thức) khác nhau, được tiến hành theo phương pháp biến đổi từ phương pháp của Chen và cs [18]:

 Nghiệm thức 1: Ghép 1.000.000 tế bào/30 μl/con (chuột 25 g) vào vùng tim thiếu máu

 Nghiệm thức 2: Ghép 10.000.000 tế bào/30 μl/con (chuột 25 g) vào vùng tim thiếu máu

 Nghiệm thức đối chứng 1: tiêm PBS vào vùng tim thiếu máu

 Nghiệm thức đối chứng 2: chuột bị bệnh mạch vành

Việc ghép được tiến hành theo cách ghép tế bào vào vùng tim thiếu máu (phương pháp 7) Hiệu quả ghép được đánh giá theo các tiêu chí sinh lí sinh hóa (phương pháp 8) Mỗi nghiệm

thức tiến hành trên 30 chuột mô hình Hiệu quả điều trị giữa các nghiệm thức được so sánh để chọn phác đồ tốt nhất trong các phác đồ khảo sát

3.2 Đánh giá vai trò của tế bào gốc nội mô

Các tế bào trước khi ghép được đánh dấu với PKH26 hay Vybrant Dil để thuận lợi cho việc

khảo sát sự tồn tại và di cư của tế bào sau khi ghép (theo phương pháp 7)

3.2.1 Đánh giá ở mức độ sinh lí (theo nội dung 1)

3.2.1 Đánh giá ở mức độ tế bào và phân tử

Khảo sát sự tồn tại của tế bào ghép đã đánh dấu ở các thời điểm là: 6 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 48 giờ,

3, 7, 15 và 30 ngày sau khi ghép tế bào dựa vào sự tồn tại của các tế bào mang dấu bằng kĩ thuật

hóa mô miễn dịch (theo phương pháp 6)

Các tế bào trong các mô khảo sát được phân lập theo kĩ thuật tách bằng hoạt hóa huỳnh

quang (FACS) hoặc kĩ thuật vi thao tác dựa vào sự phát quang của dấu lưu (theo phương pháp 9) Những tế bào này được kiểm tra để đánh giá sự biểu hiện của các gen quan trọng như VEGF

(Vascular endothelial growth factor), HGF (hepatocyte growth factor), Ang-1 (angiopoietin-1), eNOS (endothelial nitric oxide synthase), G-CSF (granulocyte colony-stimulating factor), GM-CSF (Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, SDF-1 (stromal cell-derived factor 1), IGF-1 (insulin-like growth factor-1), Statins (droxy-3-methylglutaryl coenzyme-A reductase

inhibitors) và xác định sự biệt hóa của tế bào cho sự biểu hiện gen 2 marker CD34/CD133 (theo phương pháp 5)bằng kĩ thuật RT-PCR [96]

Nội dung 4: Đánh giá hiệu quả điều trị và vai trò của tế bào cơ tim được biệt hóa từ tế bào gốc trung mô trong cấy ghép điều trị bệnh tim thiếu máu cục bộ

4.1 Đánh giá hiệu quả điều trị

Tế bào gốc trung mô máu cuống rốn được biệt hóa thành tế bào giống cơ tim bằng hóa chất 5-azacytidine (theo phương pháp 4) [24] Tế bào giống cơ tim được ghép theo các phác đồ

(nghiệm thức) khác nhau :

 Nghiệm thức 3: Ghép 1.000.000 tế bào/30 μl/con (chuột 25 g) vào vùng tim thiếu máu

 Nghiệm thức 4: Ghép 10.000.000 tế bào/30 μl/con (chuột 25 g) vào vùng tim thiếu máu

 Nghiệm thức đối chứng 3: tiêm PBS vào vùng tim thiếu máu

 Nghiệm thức đối chứng 4: chuột bị bệnh mạch vành

Sau khi ghép, hiệu quả điều trị được đánh giá theo các tiêu chí sinh lý và sinh hóa (theo phương pháp 8) Mỗi nghiệm thức tiến hành trên 30 chuột mô hình Hiệu quả điều trị giữa các

nghiệm thức được so sánh để chọn phác đồ tốt nhất trong các phác đồ khảo sát

4.2 Đánh giá vai trò của tế bào cơ tim được biệt hóa từ tế bào gốc trung mô [76]

Các tế bào trước khi ghép được đánh dấu với PKH26 hay Vybrant Dil để thuận lợi cho việc khảo

sát sự tồn tại và di cư của tế bào sau khi ghép (theo phương pháp 7)

4.2.1 Đánh giá ở mức độ sinh lí (theo nội dung 1)

4.2.1 Đánh giá ở mức độ tế bào và phân tử

Khảo sát sự tồn tại của tế bào ghép đã đánh dấu ở các thời điểm là: 6 giờ, 12 giờ, 24 giờ, 48 giờ,

3, 7, 15 và 30 ngày sau khi ghép tế bào dựa vào sự tồn tại của các tế bào mang dấu bằng kĩ thuật

hóa mô miễn dịch (theo phương pháp 6)

Các tế bào trong các mô khảo sát được phân lập theo kĩ thuật tách bằng hoạt hóa huỳnh

quang (FACS) hoặc kĩ thuật vi thao tác dựa vào sự phát quang của dấu lưu (theo phương pháp 9) Những tế bào này được kiểm tra để đánh giá sự biểu hiện của các gen quan trọng như VEGF

(Vascular endothelial growth factor), HGF (hepatocyte growth factor), Ang-1 (angiopoietin-1), eNOS (endothelial nitric oxide synthase), G-CSF (granulocyte colony-stimulating factor), GM-CSF (Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, SDF-1 (stromal cell-derived factor 1), IGF-1 (insulin-like growth factor-1), Statins (droxy-3-methylglutaryl coenzyme-A reductase inhibitors) và xác định sự biệt hóa của tế bào cho sự biểu hiện gen các marker CD44, CD73,

CD90, CD105, CD106 và HLA-DR (theo phương pháp 5) bằng kĩ thuật RT-PCR.[69,107,118,]

GACACCACGTCATACTCATCC-

TG-5'-ATGCGGCCGC TGTCGAGC TAGCGAATTC-3'

5'-TTCAGGAGTACCTGGAGAA

A-3'

ACTGAACCTGACCGTACACCTAACACTGGT-3'

5’-CCTCCTCGCATCTCTTCTACCTGC-3’

TGCTGGAGCCATACCCTGTG-3’

5’-CTCCGGACACCATGGACAA

GT-3’

CTCTTCTTATGCTATAACCT

5′-GA-3

Nội dung 5: Nghiên cứu điều trị phối hợp bệnh mạch vành

Bênh mạch vành kéo dài sẽ dẫn đến hệ quả tất yếu là suy tim kéo dài Việc đưa ra được một

phác đồ điều trị bệnh mạch vành kết hợp hồi phục các chức năng của tim nhằm làm chậm tiến trình suy tim là một việc hết sức ý nghĩa trong nghiên cứu và điều trị Trên cơ sở đó, nội dung nghiên cứu này nhằm phối hợp 2 loại tế bào gốc nội mô và tế bào cơ tim được biệt hóa từ tế bào gốc trung mô trong điều trị bệnh mạch vành Tế bào gốc có khả năng kích thích quá trình tăng sinh mạch máu mới, tiết các chất kích thích mạch và tim, tế bào cơ tim vai trò hỗ trợ kích thích lên tế bào tim và tăng sinh mạch

Việc ghép phối hợp 2 dạng tế bào này được tiến hành theo 1 phác đồ duy nhất

 Nghiệm thức 5: Ghép 1 liều duy nhất (chứa 2 loại tế bào với phác đồ tốt nhất được đánh giá ở Nội dung 3 và 4)

 Nghiệm thức đối chứng 5: tiêm PBS vào vị trí tương ứng với lô thí nghiệm

 Nghiệm thức đối chứng 6: chuột bị bệnh mạch vành

Sau khi ghép, hiệu quả điều trị được đánh giá theo các tiêu chí sinh lý và sinh hóa Mỗi

nghiệm thức tiến hành trên 30 chuột mô hình

5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Cách tiếp cận

- Dựa vào nhu cầu của xã hội

- Học hỏi, tham khảo ý kiến của các chuyên gia đầu ngành

- Tham khảo các tài liệu trong và ngoài nước có liên quan đến đề tài

Phương pháp nghiên cứu

1 Phương pháp 1: tạo mô hình chuột bệnh mạch vành (quy trình 1, 14, 15, 16, 17)

2 Phương pháp 2: phân lập, tăng sinh tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn người (quy trình 2, 3, 4, 5, 6, 10 và 11)

3 Phương pháp 3: phân lập, tăng sinh tế bào tiền thân nội mô từ máu cuống rốn người (quy trình 2, 5, 6, 7, 8)

4 Phương pháp 4: biệt hóa tế bào gốc (quy trình 9,10,11)

5 Phương pháp 5: đánh giá sự biểu hiện gen ở mức phiên mã (quy trình 10, 11)

6 Phương pháp 6: hóa mô/hóa mô miễn dịch (quy trình 15)

7 Phương pháp 7: cấy ghép tế bào (quy trình 12, 13)

8 Phương pháp 8: đánh giá các chỉ tiêu sinh lý sinh hóa (quy trình 10,11,12, 16, 17)

9 Phương pháp 9: thu nhận tế bào lưu dấu sau khi ghép (quy trình 18,19)

Quy trình 1 : Phẫu thuật tạo mô hình chuột tắc nghẽn động mạch vành [92, 128]

- Đặt ống thở : chuột được gây mê bằng ketamine

- Làm sạch lông vùng ngực (từ cổ đến qua giữa ngực)

- Chuột được đặt nằm ngửa và nằm trên tấm làm ấm toàn cơ thể

- Sử dụng dây chằng vắt ngang qua miệng chuột ở vùng răng hàm hình chữ S nhằm giữ cho phần cổ và ngực thẳng Dùng kẹp cong kéo lưỡi chuột qua một bên và nhẹ nhàng luồng ống thở oxy vào vỏ trong khí quản, sử dụng ống dẫn PE 90 Ống thông vào vùng

vỏ trong khí quản được nối với máy phụ thở ở nhịp là 125-150 nhịp/phút, thể tích 0,3ml

1 Sát trùng vùng phẫu thuật bằng betadine 70% ethanol (lặp lại 3 lần)

- Để tránh sự lây nhiễm, sử dụng tấm phẫu thuật che phủ các phần còn lại của chuột, chỉ phơi vùng phẫu thuật dưới đèn soi của kính hiển vi soi nổi

- Tạo vết mổ từ gần chóp lồng ngực đến xương sườn thứ 2, sử dụng banh vết mổ để giữ vết

mổ

- Kẹp đầu cong 400 được sử dụng để mở vùng giáp và tách mô mỡ đến vùng mạch vành

- Sử dụng chỉ lụa 0,6 và kim cong gauge 271/2 để thắt mạch, tạo hai vết thắt hờ tại hai vị trí gần nhau trên mạch

- Lấy cái banh vết mổ ra, đồng thời thắt nhíp thở ra tại ổng thở 2 lần nhằm bơm căng lồng ngực

- Khâu vết mổ vùng cơ với chỉ prolene 6,0

- Khâu vùng da mổ với chỉ prolene 6,0

- Sau khi khâu vết thương, giảm đau cho chuột bằng buprenorphine (0,1 mg/kg) vào vùng bụng Nếu quan sát thấy có sự mất nước, bổ sung bằng nước mối sinh lý bằng cách tiêm vào vùng bụng

- Sự phục hồi trình trạng gây mê được giảm dần bằng cách cho chuột nằm sấp và nhẹ nhàng rút ống thở ra khi thấy có sự thở bình thường tự nhiên được phục hồi

- Chuột được đặt nằm ngửa trở lại và đặt vào buồng nhiệt

Quy trình 2: Thu nhận tế bào đơn nhân bằng Ficoll từ máu cuống rốn [48]

- Pha loãng máu cuống rốn với PBSA với tỉ lệ 1:1

- Hút 5 ml Ficoll-Hypaque vào ống li tâm 15 ml

- Nhẹ nhàng đặt 10 ml hỗn hợp PBSA và máu cuống rốn lên trên lớp Ficoll-Hypaque (1,077 g/ml)

- Li tâm ở 450 g trong 20-30 phút ở nhiệt độ phòng

- Sau khi li tâm, xuất hiện một lớp tế bào đơn nhân nằm tại lớp giữa, ngay trên lớp mặt của Ficoll-Hypaque

- Sử dụng pipette Pasteur chuyển lớp giữa chứa tế bào đơn nhân vào ống li tâm mới

- Rửa tế bào với PBSA và li tâm ở tốc độ 200 g trong 10 phút

- Đổ bỏ dịch nổi, tái huyền phù cặn tế bào trong PBSA và lặp lại quy trình rửa

- Cuối cùng, tái huyền phù tế bào trong một thể tích môi trường

Quy trình 3: Nuôi cấy chọn lọc và tăng sinh tế bào bám dính [109]

- Tế bào đơn nhân được nuôi trong môi trường IMDM, với 2 mM L-glutamine, bổ sung với 20% FBS, 1% Antibiotic-antimycotic 100X ở mật độ 106 tế bào/cm2, 370C, 5% CO2 trong tủ ấm

- Thay môi trường mỗi 7 ngày đến khi tế bào có hình dạng như nguyên bào sợi và đạt mật

độ khoảng 60-70%

- Tiến hành cấy chuyền tế bào, nuôi tế bào ở bình mới với mật độ 105 tế bào/bình nuôi

Quy trình 4: Biệt hóa tế bào bám dính [95]

Biệt hóa thành tế bào xương:

- Tế bào được nuôi cấy trong môi trường DMEM có bổ sung Dexamethazone: 50 μM, Acid ascorbic: 50 μM, β- glycerophosphate: 10 mM, 10% FBS và 1 % antibiotic

- Môi trường biệt hóa được thay 2 lần trong một tuần và tiến hành nuôi cấy trong 2 tuần

- Sau đó, các tế bào biệt hóa được cố định bằng methanol trong 10 phút ở nhiệt độ phòng và nhuộm với Alizarin red trong 5 phút ở nhiệt độ phòng

Biệt hóa thành tế bào mỡ:

- Tế bào được cảm ứng bằng môi trường cảm ứng biệt hóa mỡ DMEM bổ sung Dexamethazone: 10 μM, Insulin: 10 μg/ ml, Indomethacine: 200 μM, Isobutyl-metylxanthane: 0.5 mM, 10 % FBS

- Môi trường biệt hóa được thay 2 lần trong một tuần Thời gian tiến hành cảm ứng biệt hóa là 1 tuần

- Các tế bào này được cố định bằng methanol trong 45 phút ở nhiệt độ phòng và tiến hành nhuộm với thuốc nhuộm Oil Red

Quy trình 5: Xác định marker bề mặt của tế bào gốc trung mô bằng kĩ thuật flow cytometry [93]

- Các tế bào gốc trung mô ứng viên sau 3 lần cấy chuyền được xác định sự biểu hiện các marker bề mặt CD13, CD14, CD34, CD44, CD45, CD73, CD90, CD117, CD105, CD106, CD166, HLA-DR

- Các tế bào sau khi phát triển phủ kín chừng 70% bề mặt bình nuôi được xử lí với trypsin/EDTA 0,25% và thu nhận tế bào đơn

- Cứ mỗi 106 tế bào được sử dụng để nhuộm với kháng thể trong 30 phút, trong tối, ở 40

C

- Sau đó, tế bào được rửa 2 lần bằng FACSflow để loại bỏ kháng thể thừa và tái huyền phù

tế bào trong 500 µl FACSflow

- Mẫu được phân tích bằng máy FacsCalibur (BD Bioscience) Tất cả các dữ liệu được phân tích bằng phần mềm CellQuest Pro ở 30.000 tế bào

Quy trình 6: Xác định khả năng tự làm mới của tế bào gốc trung mô bằng kĩ thuật colony assay

- 100 tế bào được nuôi trong đĩa nuôi cấy tế bào 35 mm trong 7 ngày

- Sau đó, đĩa nuôi được tiến hành nhuộm với thuốc nhuộm Crytal violet trong 10 phút với methanol

- Các colony được đếm

- Thử nghiệm này được lặp lại 3 lần

Quy trình 7: Nuôi cấy chọn lọc và tăng sinh tế bào tiền thân nội mô [88, 94]

- Tế bào đơn nhân được nuôi trong môi trường EBM, bổ sung với 10% FBS, 1% Antibiotic- mycobiotic 100X, mật độ 106 tế bào/cm2, 370C, 5% CO2 trong tủ ấm

- Sau 2 ngày, quần thể tế bào không bám nổi lên được thu nhận, li tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút để thu cặn tế bào

- Cặn tế bào được tái huyền phù và được nuôi cấy tăng sinh trong môi trường tăng trưởng cEGM-2 (EGM-2 được bổ sung với Bulletkit nhân tố tăng trưởng toàn bộ, 10% FBS, 1% penicillin (10.000 U/ml), streptomycin (10000 ug/ml), am photericin (25 ug/ml), với chế

độ thay môi trường ½ trong 4 ngày

- Các tế bào sau khi phát triển phủ kín chừng 70% bề mặt bình nuôi được xử lí với trypsin/EDTA 0,25% và thu nhận tế bào đơn

- Cứ mỗi 106 tế bào được sử dụng để nhuộm với kháng thể trong 30 phút, trong điều kiện tối, 40

C

- Sau đó, tế bào được rửa 2 lần bằng FACSflow để loại bỏ kháng thể thừa và tái huyền phù

tế bào trong 500 µl FACSflow

- Mẫu được phân tích bằng máy FacsCalibur (BD Bioscience) Tất cả các dữ liệu được phân tích bằng phần mềm CellQuest Pro ở 30.000 tế bào

- Tế bào gốc nội mô phải dương tính với cả 2 marker CD34+/CD133+

Quy trình 9: Biệt hóa thành tế bào giống cơ tim [68]

- Tế bào sau 3 lần cấy chuyền được tiền cảm ứng biệt hóa ở mật độ 50.000 tế bào/cm2

bằng môi trường cảm ứng biệt hóa bổ sung 10 μM 5-azacytidine

- Các tế bào được cảm ứng trong 24 giờ Sau đó, chúng được thay bằng môi trường không

bổ sung tác nhân cảm ứng biệt hóa nuôi trong 7 ngày và tiến hành tái cảm ứng tế bào trong 24 giờ

- Sau 2 lần cảm ứng, tế bào được nuôi trong môi trường nuôi, đến ngày 35 thu nhận tế bào

để phân tích biểu hiện gen

Quy trình 10: Tách RNA tổng số [74, 79]

Quy trình tách RNA tổng số được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất Sigma

- Thu toàn bộ huyền phù tế bào cho vào eppendorf 1,5 ml, Ly tâm thu cặn

- Hòa lẫn với 0,25 ml nước có xử lý DEPC

- Cho 0,75 ml Trizol vào (5-10 x 106 tế bào cho mỗi 0,75 ml Trizol)

- Ly tâm 12,000 g 10 phút ở 4oC Thu phần dịch nổi

- Mẫu có thể trữ lạnh trong ethanol ở 4oC trong 1 tuần và 1 năm ở -20oC

 Hòa tan RNA

- Làm khô nhanh cặn RNA trong 5-10 phút để khô tự nhiên hay bằng chân không Không

để khô hoàn toàn vì như vậy sẽ rất khó hoà tan

- Hoà tan bằng nước DEPC để nóng 55-60oC trong 10-15 phút rồi cho vào đá 5 phút

- Primer xuôi 1,5 μl (100 pmol)

- Primer ngược: 1,5 μl (100 pmol)

Quy trình 12: Đánh dấu tế bào với PKH26 hay Vybrant Dil [103]

- Tế bào tiền cảm ứng với 5 azacytidine/tế bào nội mô được đánh dấu bằng kĩ thuật đánh dấu trên màng tế bào với một chất phát huỳnh quang đỏ PKH26 (Kit MINI26 cell linker) hay Vybrant Dil trước khi tiến hành cấy ghép

- Tế bào được tiền xử lý bằng dung dịch Diluent C, sau đó tiến hành nhuộm với PKH26/Vybrant Dil ở 25oC trong 5 phút Sau đó tế bào được rửa lại bằng FBS 1 lần và môi trường 3 lần

- Các tế bào đã được đánh dấu được kiểm tra bằng kính hiển vi huỳnh quang xác định mật

độ trước khi tiến hành cấy ghép trên mô hình chuột suy tim

Quy trình 13: Ghép tế bào vào vùng tim thiếu máu [22, 26, 27]

- Sử dụng phác đồ cyclosporine A 3 mg/kg/ngày tiêm vào tĩnh mạch đuôi 1 tuần trước khi ghép và phác đồ 3 mg/kg cách 2 ngày 1 lần trong suốt thời gian khảo sát

- Tế bào đã đánh dấu được huyền phù trong PBS ở thể tích tiêm là 30 µl/lần tiêm với mật

độ cần thiết /lần tiêm/con

- Phương pháp ghép: ghép tế bào trực tiếp vào vùng bệnh lý

Quy trình 14: Sự tăng huyết áp và rối loạn hoạt động chức năng của tim [67, 82]

- Điện tâm đồ được đo ở vùng ngực trước khi tiến hành cảm ứng bằng thuốc và mỗi tháng sau khi xử lý thuốc

- Chuột được gây mê với 1,5% isofluorane cho tới khi nhịp tim ổn định ở 400-500 nhịp/phút

- Sử dụng hệ thống vi siêu âm độ phân giải cao (Vevo770, VisualSonics Inc, Toronto, Canada, 40 MHz probe) để quan sát hình ảnh tim

Quy trình 15: Đo kích thước vùng nhồi máu và vùng hư hại [83, 110, 126]

- Chuột được tiêm 100 U heparin theo đường bụng 20 phút sau tiêm thêm sodium pentobarbitone (300 mg/kg) theo đường tĩnh mạch Khi chuột đã hoàn toàn bị mê, phẫu thuật mở ngực

- Quá trình phẫu thuật được thực biện bằng cách rạch qua màng và tới trục giữa của 2 bên xương sườn trong suốt quá trình này, chuột được cung cấp oxy qua ống thở Đặt chỉ ở ngay dưới động mạch chủ Thắt động mạch chủ trước lại Đặt ống thông theo vào động mạch và thắt lại cho chắc Sau đó thu nhận quả tim

- Thêm 20 ml đệm heparine theo đường ống thông để rửa và loại máu trong tim Tiếp tục thêm 5 ml 1% triphenyltetrazolium chloride (TTC) trong dung dịch đệm phosphate (Na2PO4 45,1 mM, NaH2PO4 3,3 mM, pH 7,8) theo đường ống thông Đặt quả tim trong ống Falcon 50 ml chứa sẵn 5 ml TTC, ủ ở 370C Sau 10 phút lấy tim ra

- Mối thắt LAD được làm ướt lại nhờ phần ống thông PE-10 Để giới hạn vùng hư hại, 5

ml dung dịch 1% Evan Blue trong 0,9% muối được sử dụng để làm đầy thông qua ống thông trong khoảng 1-2 phút Trong suốt quá trình làm ướt, muối được rửa khắp mặt trong của tim để cản bề mặt nhuộm Tim sau đó được đặt ngập trong 1 ml muối đệm trước khi loại bỏ ống thông Sau khi làm khô điểm, cân tim và đông lạnh ở -800C để cắt

- Việc giải đông tim được tiến hành bằng cách cắt thành các miếng 100 Am sau khi cố định trong 2,5% gluteraldehyde và nhận chìm trong dung dịch 5% agarose Sau đó cố định trong 10% formaldehyde trong 1 giờ và rửa lại với PBS

- TTC được nhỏ xuống để đánh dấu vùng nhồi máu Quan sát sự có mặt của thuốc nhuộm TTC trong vùng không nhồi máu dưới đèn UV

Quy trình 16: Đánh giá quá trình apoptosis các tế bào cơ tim [29, 36]

Quá trình apoptosis của tế bào cơ tim được đánh giá bằng bộ kit annexin V-FitC apoptosis detection của nhà sản xuất Sigma

- Tế bào cơ tim được thu nhận và tách thành tế bào đơn sử dụng trypsin/EDTA 0,25%

- Rửa tế bào 2 lần với PBS

- Tái huyền phù tế bào trong 1X dung dịch đệm ở mật độ 1 x 106

tế bào/ml

- Thêm 500 μl huyền phù tế bào vào ống test

- thêm 5 μl annexin C-FITC và 10 l propidium iodide vào mỗi huyền phù tế bào

- ủ ống ở nhiệt độ phòng trong đúng 10 phút, tránh ánh sáng

- Xác định sự phát huỳnh quang của tế bào được đánh giá trực tiếp bằng hệ thống flow cytometer Các tế bào ở trạng thái apoptosis chỉ bắt màu với annexin V-FITC Các tế bào sống sẽ không nhuộm với cả annexin và V-FITC lẫn propidium iodide Các tế bào necrosis sẽ nhuộm màu cả 2

Quy trình 17: Đánh giá sự hoạt hóa các nhân tố tự tiết và cận tiết bao gồm sự giải phóng các nhân tố tăng trưởng và cytokine bằng kĩ thuật ELISA [33, 34, 39, 87]

- Đĩa 96 giếng được phủ bằng kháng nguyên nồng độ 40 μg/mL đã được pha loãng 1/100 trong dung dịch đệm phủ đĩa với thể tích 100 μL/giếng và được ủ qua đêm ở nhiệt độ phòng Đĩa được rửa 3 lần bằng dung dịch rửa

- Tiếp đó, khóa đĩa bằng dung dịch đệm khóa đĩa với thể tích 150 μL/giếng và ủ đĩa 1 giờ ở nhiệt độ phòng

- Tiếp tục rửa đĩa 3 lần bằng dung dịch rửa Huyết thanh chuột nhắt trắng được pha loãng

từ 1/100, 1/200 1/6400 và cho vào các giếng, mỗi giếng 100 μL

- Đĩa được ủ 1 giờ ở nhiệt độ phòng trước khi được rửa 3 lần bằng dung dịch rửa

- Sau đó, dung dịch cộng hợp (kháng thể kháng IgG chuột có gắn men peroxidase) đã được pha loãng 1/5000 trong dung dịch đệm PBS tiếp tục được bổ sung vào các giếng với thể tích 100 μL/giếng

- Ủ đĩa trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng trước khi rửa đĩa 5 lần bằng dung dịch rửa Tiếp đó,

cơ chất TMB được bổ sung vào đĩa với thể tích 100 μL/giếng trong tối

- Sau 10 phút, ngừng phản ứng bằng dung dịch H2SO4 1M với thể tích 50 μL/ giếng trước khi tiến hành đo màu bằng máy quang phổ trắc quang ở bước sóng 450 nm

Quy trình 18: Tách tế bào lưu dấu bằng kĩ thuật FACS [61, 72]

- Vùng mô cơ tim của chuột sau khi ghép ở các mốc thời gian sẽ được thu nhận, phân tách