Báo cáo thực hành hóa sinh

ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG PHÁP ACID DINITROSALICYLIC (DNS)ĐỊNH LƯỢNG NITƠ TỔNG SỐ BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHLĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP BRADFORDPHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYMETÁCH CÁC SẮC TỐ QUANG HỢP BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ GIẤY HOẶC BẢN MỎNG

GVHD: ThS Trịnh Thị Lan Anh

Nhóm 3- 14DSH04

Sinh Viên: Nguyễn Thanh Hiếu MSSV: 1411100748

Nguyễn Thị Thu Thủy MSSV: 1411100788 Trần Minh Nhi MSSV: 1411100761 Trương Ngọc Phân MSSV: 1411100733 Nguyễn Minh Luân MSSV: 1411100758

Lê Huỳnh Phương Trúc MSSV: 1411100738

I Quy tắc làm việc trong phòng thí nghiệm hóa sinh

a An toàn khi làm việc với axit và kiềm

 An toàn khi làm việc với axit

- Phải làm việc trong tủ hút bất cứ khi nào đun nóng axit hoặc thực hiện phản ứngvới các axit tự do

- Khi pha loãng luôn phải cho axit vào nước

 An toàn khi làm việc với kiềm

- Kiềm có thể làm cháy da

- Mang găng tay , khẩu trang khi làm việc với dung dịch kiềm

- Thao tác trong tủ hút, mang mặc nạ chống độc để phòng ngừa bụi và hơi kiềm

b Quy tắc làm việc với hóa chất thí nghiệm

tử, nơi sản xuất , điều kiện bảo quản

 Cách sử dụng và bảo quản hóa chất:

- Khi làm việc với hóa chất , nhân viên phòng thí nghiệm cũng như sinh viên cần hếtsức cẩn thận tráng gậy những tai nạn đáng tiếc cho mình cũng như cho người khác

- Bao giờ cũng đổ axit hay bazơ vào nước khi pha loãng

- Không hút axit hay bazơ bằng miệng mà phải dùng các dụng cụ riệng như: ống bópcao su

II Cách pha chế các dung dịch trong thí nghiệm hóa sinh:

 Nồng độ trăm khối lượng thể tích (w/v): là số g chất tan có trong 100ml dung dịch

 Nồng độ phần trăm thể tích – thể tích , % (v/v): là số ml dung chất có trong 100mldung dịch

 Nồng độ gam – lít, (g/L): là số g chất tan có trong 1 lít dung dịch

 Nồng độ phân tử g hay nồng độ mol, (mol/L): là số phân tử g ( hay số mol) chất tantrong 1 lít dung dịch

 Nồng độ đương lượng (N); là số đương lượng gam (đlg) chất tan có trong 1 lítdung dịch

Số đương lương chất tan = số mol (n) x hệ số đương lượng (z)

- Hệ số đương lượng (z) : phụ thuộc vào bản chất của chất đó và phản ứng mà chất

đó tham gia

 Nồng độ dung dịch bão hòa: là nồng độ dung dịch khi tối đa chất hòa tan có mặt

trong dung dịch.

 Đơn vị nồng độ dùng trong các phép phân tích vi lượng :

- Nồng độ mg/mL : số mg chất tan trong 1mL dung dịch

- Miligam phần trăm , mg% : mg chất tan trong 100g dung dịch

- Phần nghìn ,0/

00 : số gam chất hòa tan trong 1000g dung dịch

- Phần triệu , ppn : số mg chất hòa tan trong 1kg hay 1 lịt dung dịch

- Phần tỷ , ppb : sồ µg chất hòa tan có trong 1kg hay 1 lít dung dịch

 Cách pha dung dịch có nồng độ xác định

a Pha dung dịch có nồng độ theo khối lượng ,% (w/w)

- Chất tan là chất rắn khan

- Chất tan là chất rắn ngậm nước ( CuS04.5H2O )

Khi pha dung dịch cần phải tính thêm lượng nước kết tinh có sẵn

b Pha dung dịch loãng từ một dung dịch đậm đặc hơn

c Pha dung dịch bão hòa :

Lấy chất tan cần pha vào becher , thêm một ít nước cất và khuấy cho tan Nếu saukhi khuấy , chất tan không tan hết lắng xuống thì phần dung dịch phía trên là dung dịch bão hòa Nếu chất tan tan hết , thêm chất tan và tiếp tục khuấy , cứ như thế cho đến khi chất tan không còn tan được nào

d Pha dung dịch có nồng độ % theo thể tích :

Khi pha dung dịch ta cần phải tính lượng kết tinh có sẵn giống như phần a

- Chất tan dạng lỏng : một số chất tan ở dạng lỏng như HCl, H2S04…

Ngày nay đa số các dung dịch thí nghiệm được pha chế theo nồng độ khới lượng- thểtích (w/v)

- Chất tan là chất rắn khan :

Muốn pha dung dịch nồng độ 1M của một chất nào đó , ta tính khối lượng phân tử chất

đó theo đơn vị gam Cân chính xác lượng chất tan , qua phễu cho vào bình định mức có dung tích 1 lít Cho vào từng lượng nước cất nhỏ , lắc để hòa tan hoàn toàn và đưa nước cất tới mức Chuyển dunh dịch sang bình chứa, lác để trộn đều đồng nhất

Khi phải đun dung dịch để hòa tan, hoặc quá trình hòa tan có tỏa nhiệt thì phải chờ nhiệt độ trở lại bình thường (nhiệt độ không khí) rồi mới thêm nước tới vạch định mức

- Chất tan là chất rắn ngậm nước : khi tính lượng chất tan cần cân phải tính luôn cảkhối lượng các phân tử nước

- Chất tan dạng lỏng: nếu chất tan là dung dịch, ta phải tính toán dựa vào nồng độdung dịch đó

 Hiệu chỉnh nồng độ dung dịch.

a Dung dịch chuẩn.

Dung dịch chuẩn là các dung dịch được chuẩn bị sẵn, đảm bảo chính xác và đượcdùng để định chuẩn các dung dịch tự pha chế khi làm thí nghiệm

 Cách pha dung dịch từ ống chuẩn:

- Dùng đinh thủy tinh chọc thủng ampun, hứng lên phểu vào bình định mức, dùng bình tia rửa sạch chất tan có trong ampun vào bình định mức 1 lit, vừa thêm nước cất vừalắc và đưa nước cất tới vạch mức

- Đối với các hợp chất bền vững, có thành phần không thay đổi như NaCl, AgNO3,acid oxalic, có thể pha dung dịch chuẩn trực tiếp bằng cách cân chính xác chất cần pha,pha loãng và định mức tới thể tích đúng

- Đối với các chất như NaOH, HCl, Na2S2O3, không thể pha ngay được dung dịchchuẩn, do các chất này thường không bền vững và dễ thay đổi thành phần, vì vậy sau khipha phải hiệu chỉnh lại nồng độ

b Phương pháp hiệu chỉnh nồng độ dung dịch

Đối với các chất dễ thay đổi thành phần khi ở dạng rắn, nếu muốn pha dung dịch cónồng độ chính xác, ta pha dung dịch có nồng độ gần đúng, sau đó hiệu chỉnh nồng độ củadung dịch dựa vào phản ứng với một dung dịch chuẩn thích hợp.

Đối với các dung dịch dễ thay đổi trong quá trình bảo quản, mỗi lần sử dụng lạiphải xác định lại hệ số hiệu chỉnh nồng độ dung dịch

Xét một phản ứng trung hòa acid – base, 1 ion gam H+ sẽ phản ứng với 1 ion gamOH- Do đó:

Câu 1 :

CÂU HỎI ÔN TẬP

Pha 1L dung dịch NaOH 40% (w/v): cân X=(40x1000)/100=400(g) NaOH khô

Câu 2:

Nồng độ mol của H2SO4 đđ là:

CM = (10.d.C%)/M = (10x97x1.84)/98 = 18.2 (mol)Thể tích H2SO4 cần sử dụng là:

- Lượng NaOH cần để pha dung dịch 10% là: X= ( 10x500)/100 = 50 (g)

- Lượng dung dịch NaOH 40% cần dùng là: Y = (100x50)/40 = 125 (g)

- Lượng nước cất thêm vào: 500 – 125 = 375 (g)

BÀI 2 : ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG

1 Chiết xuất đường trong thực vật

- Chuẩn bị mẫu thơm 20g

2 Dựng đường chuẩn và xác định hàm lượng đường

Hóa chất Ống ĐC Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Ống 5 Mẫu 1 Mẫu 2Glucose

f(x) = 0.86 x + 0 R² = 1

Đường chuẩn glucose

Phương trình hồi quy tuyến tính: y = 0.855x + 0.0034, với hệ số tương quan r2 = 0.9998Thay OD của mẫu vào phương trình ta được ymẫu = 0.215

Vậy với tỉ lệ pha loãng 100 lần ta được nồng độ đường khử trong mẫu chưa pha loãng là: [đường khử]mẫu = 0.215*100 = 21.5 mg/ml

CÂU HỎI ÔN TẬP

Câu 1: Đường khử là các đường chứa nhóm aldehyde (-CHO) hoặc ketone (-CO) như

glucose , fructose ,arabinose , maltose , lactose (saccharose , trehalose không phải đườngkhử

Câu 2: Áp dụng phương pháp đo đường khử trong trường hợp phân tích nồng độ

đường khử trong dung dịch

Câu 3 : Sai số hệ thống do những lý do:

- Hóa chất chuẩn bị cho thí nghiệm không được chuẩn

- Do vận chuyển mẫu không đúng cách

- Thao tác đo không chính xác

- Ghi không chính xác chỉ số

- Ở dụng cụ cuvete khi đo OD

- Hút hóa chất không chính xác

Câu 4 : Khi đo OD máy báo over là do mẫu quá đậm đặc cần phải pha loãng lại.

Gía trị OD nằm trong khoảng từ 1 đến 5 Vì nếu cao quá hoặc thấp quá đường chuẩn sẽ

bị lệch

Câu 5: Trong bài thực hành chọn đường glucose để dựng đường chuẩn điều này

không luôn đúng vì đường khử có nhiều loại như fructose, maltose…

Nitơ tổng số = Nitơ protein + Nitơ phi protein

- Đạm tổng số hay protein tổng số là nitơ tổng số nhân với hệ số chuyển đổi Hệ số này phụ thuộc vào hàm lượng nito trong protein Thông thường nito chiếm 16% proteinnên hệ số chuyển đổi thường sử dụng là 100/16 = 6.25

- Đạm tổng số = Nito tổng số X hệ số chuyển đổi

- Bảng dưới đây biểu diễn hệ số chuyển đổi cụ thể cho nhiều đối tượng mẫu khácnhau

MẪU HỆ SỐ CHUYỂN ĐỔINguồn gốc động vật 6.25

Hạt bông 5.30Đậu phộng 5.46Đậu nành 5.71Hạt hướng dương 5.3Cơm dừa 5.3Hạt mè 5.3

Lúa mì 5.83

2 Nguyên tắc:

a) Vô cơ hóa mẫu.

- Trước tiên mẫu được vô cơ hóa bằng H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao và có chất xúc tác.Các phản ứng của quá trình vô cơ hóa xảy ra như sau:

2H2SO4  2H20 + 2SO2 + O2

- Oxi tạo thành trong phản ứng lại oxi hóa các nguyên tố khác Các phân tử chứa nito dưới tác dụng của H2SO4 tạo thành NH3 Ví dụ các protein bị thủy phân thành amini acid, cacbon và hidro của acid amine tạo thành CO2 và H2O, còn nito được giải phóng dưới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 dư tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch.2NH3 + H2SO4  (NH4)2SO4

- Các nguyên tố P, K, Ca, Mg,……chuyển thành dạng oxide: P2O5, K2O, CaO,MgO,……

- m: số gam mẫu hay ml mẫu sau khi chuẩn độ lại

- n: hệ số pha loãng mẫu khi vô cơ hóa mẫu để đưa vào chưng cất

3.2 Tiến hành

- B1: Lấy 4ml mẫu + 0,5g xúc tác (K2SO4, CuSO4.5H2O = 3:1) + 10ml dung dịch

H2SO4 đđ to dung dịch có màu trắng +H2O định mức đến 50ml

- B2: Chưng cất đạm

- Cho 50ml mẫu B + 3 giọt Tashiro + 50ml NaOH 40% vào bình cất đạm, cho 30ml

H2SO4 0,1 vào erlen + 3 giọt tashiro → lắp đặt hệ thống Kjeldahl và vận hành cho đến khi không còn NH4OH sinh ra

- B3: Chuẩn độ H2SO4 0,1N dư trong Erlen bằng NaOH 0,1N

Tính kết quả:

Hình 1: hệ thống Kjendahl có mẫu đã được vô cơ hóa và phản ứng với NaOH, phía dưới

là bình tan giác chứa H2SO4 để cố định NH3 sinh ra

- Hình 2: các bình tam giác chứa H2SO4

- Hình 3: bình tam giác sau khi thực hiện quá trình Kjendahl, chứa muối (NH4)2SO4

- Hình 4: bình tam giác sau khi chuẩn độ chuyển sang màu xanh nhạt hơn

CÂU HỎI ÔN TẬP

Câu 1) Giải thích ý nghĩa các bước trong thí nghiệm

a) Vô cơ hóa mẫu

- Oxi tạo thành trong phản ứng lại oxi hóa các nguyên tố khác Các phân tử chứanito dưới tác dụng của H2SO4 tạo thành NH3.NH3 kết hợp với H2SO4 dư tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch

 Sai số của máy chưng cất

Câu 3 Vì sao phải bảo đảm NaOH trong bình chưng cất đạm dư?

Vì NaOH dư thì sẽ chuyển tất cả (NH4)2SO4 thành NH3

Câu 4 Nếu thay H2SO4 trong bình hứng bằng acid boric (H3BO3) thì kết quả có thay đổi gì không?

Ta có: 0.1N H2SO4 = 0.05M H2SO4

Ta chuyển qua phương trình và 1.42 là hệ số nito, cứ 1ml H2SO4 dùng để trung hòa

NH4OH thì tương đương với 1.42mg nito Vì lấy 1ml nên nhân thêm cho 10-3

Vì vậy nếu thay thành acid boric thì hệ số sẽ là 2.13

Câu 5 Nếu chuẩn độ bằng NaOH 0.05N thì kết quả N tổng số thay đổi thế

nào? Áp dụng công thức: C1V1 = C2V2

V1, C1 cố định và V2 phải chuẩn độ

Mà C2 giảm 1 nữa thì V2 tăng thể tích gấp đôi  Công thức thay đổi

BÀI 4 ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP

Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với dungdịch protein chuẩn đã biết trước nồng độ Dung dịch protein chuẩn thường là bovineserum albumin (BSA) Sau khi cho dung dịch protein vào dung dịch thuốc nhuộm, màu

sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1 giờ Tiến hành đo dung dịch bằng máy quang phổ kế

ta được ODx, độ hấp thụ sẽ tỷ lệ với lượng trong mẫu Thực hiện một đối chứng với nướccất (OD0) Lấy giá trị OD = ODx - OD0 Lượng protein mẫu trong dung dịch đo được xácđịnh bằng cách chấm trên đường chuẩn theo OD, lấy giá trị của điểm đó trên trục hoành

Đó chính là lượng protein mẫu trong dung dịch đo

Công thức phân tử của Coomasie Brilliant Blue G-250

- Dung dịch thuốc thử Bradford: dd thuốc thử có thành phần trong 100ml như sau: Coomassie Brilliant Blue: 0,005g

Methanol: 4,7g

Phosphoric acid 85%: 8,5g

Phẩm màu Coomasie Brilliant Blue được làm tan trong ethanol trong một chai đựng màu tối có nắp Bổ sung phosphoric acid và chỉnh tới 100ml bằng nước cất Lắc đều, giữ ở 4 0 C

- Dung dịch cần xác định hàm lượng protein (phòng thí nghiệm cung cấp)

2 Tiến hành

- Thu dịch trích ly protein như trong bài enzyme (5 g malt trích ly bằng nước thuđược V = 100 ml) Pha loãng mẫu với hệ số pha loãng n lần để được mẫu phân tích (mẫuX)

- Lập một loạt 6 ống theo số thứ tự 0, 1, 2, 3, 4, 5 và 1 ống nghiệm chứa mẫu cần phân tích X

- Dùng đồng hồ bấm giây, canh thời gian 0 phút cho 5ml thuốc thử vào ống nghiệm

0, lắc đều để yên Ở thời điểm 1 phút cho 5ml thuốc thử vào ống nghiệm 1, lắc đều để yên, cứ tiếp tục cho đến hết

0.37 0

0.003

- Tính thời gian ống 0 được 20 phút, tiến hành đo độ hấp thu của dung dịch ở bướcsóng 595 nm Ta có giá trị OD0, ở thời điểm 21 phút đo ống 1 (OD1), tương tự cứcách một phút đo cho hết các ống Ghi lại giá trị OD

Y = 10,514X + 0.0015  X

=

Y − 0,001510,514

=

0,045 − 0,001510,514 = 4,14 10

CÂU HỎI ÔN TẬP:

1 Giải thích ý nghĩa các bước trong thí nghiệm

- Pha loãng mẫu với hệ số pha loãng n lần để được mẫu phân tích

 Phải giảm bớt nồng độ protein trong mẫu, để khi đo nồng độ quang không bị vượt quá giới hạn cho phép

- Lập một loạt 6 ống theo số thứ tự 0, 1, 2, 3, 4, 5 và 1 ống nghiệm chứa mẫucần phân tích X

 Phải pha các nồng độ khác nhau để lập đường chuẩn Để xác định protein trong mẫu

- Dùng đồng hồ bấm giây, canh thời gian 0 phút cho 5ml thuốc thử vào ốngnghiệm 0, lắc đều để yên Ở thời điểm 1 phút cho 5ml thuốc thử vào ốngnghiệm 1, lắc đều để yên, cứ tiếp tục cho đến hết

 Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein

- Tính thời gian ống 0 được 20 phút, tiến hành đo độ hấp thu của dung dịch ởbước sóng 595 nm Ta có giá trị OD0, ở thời điểm 21 phút đo ống 1 (OD1), tương tự cứ cách một phút đo cho hết các ống Ghi lại giá trị OD

 Trong 20 phút thuốc nhuộm kết hợp với protein khi đó thuốc nhuộm hấp thu cực đại ở bước sóng 595 nm

2 Thảo luận các yếu tố dẫn đến sai số

 Do sai thao tác trong tiến hành thí nghiệm

 Mẫu protein chuẩn bị không được chuẩn

 Hóa chất chuẩn bị cho thí nghiệm không được chuẩn

 Do vận chuyển mẫu không đúng cách

 Lấy mẫu không đúng theo thể tích yêu cầu

 Ghi không chính xác chỉ số

 Thao tác đo không chính xác

 Máy đo OD không chuẩn

3 Áp dụng phương pháp bradford cho trường hợp nào

 Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốcnhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein.Hình thành hợpchất màu có khả năng hấp thu ánh sáng ở bước sóng 595nm, cường độ màu tỷ lệvới nồng độ protein trong dung dịch

 Tiết kiệm thời gian và dễ thực hiện

 Cường độ màu tỉ lệ nồng độ protein trong dung dịch nồng độ càng cao thì

màu xanh càng đậm không phụ thuộc nồng độ acid amin của dung dịch

 Phương pháp có độ nhạy cao cho phép phát phát hiện tới vài protein 5-200 µg/

ml Nhạy hơn phường pháp Lowry gấp 4 lần

 Ít bị ảnh hưởng bởi các chất thường gặp trong tế bào gặp chẳng hạn như muối

4 Trường hợp mẫu ở thể rắn cần phải xử lý mẫu như thế nào?

Cân m = 5-10g mẫu rắn đã nghiền nhỏ, cho vào bình nón dung tích 250ml, bổ sung 50ml nước cất và 10ml dung dich đệm phosphat pH = 4,9 Giữ hỗn hợp ở nhiệt độ 30oC trong thời gian 1 giờ có khuấy đảo định kỳ Lọc, rửa thu hồi dung dịch sao cho V = 100ml Bảoquản dung dịch gốc ở 2 – 4oC trong thời gian một ngày

BÀI 5: PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME

 Về nguyên tắc có thể hai nhóm phương pháp chính sau:

Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong một thời gian nhất định ứng với một nồng độ enzyme xác định

Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản phẩm tương ứng với một nồng độ enzyme xác định

Để thực hiện được mục đích trên, nhiều phương pháp phân tích khác nhau được sử dụng: phương pháp đo quang phổ, đo độ phân cực, áp suất, độ nhớt, phương pháp sắc ký

và phương pháp hóa học

Mục đích xác định hoạt tính enzyme là xác định số đơn vị hoạt tính Một đơn vị họattính enzyme được định nghĩa theo nhiều phương pháp.

b Đơn vị hoạt tính của enzyme:

Đơn vị đơn vị quốc tế (Enzyme Unit, viết tắt U)

Do Hiệp hội Hóa sinh Quốc tế (International Union of Biochemistry – IUB) địnhnghĩa:

Một đơn vị chuẩn của enzyme (1 U) là lượng enzyme xúc tác chuyển hóa được

 1 𝜇mol cơ chất sau 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn