ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG PHÁP ACID DINITROSALICYLIC (DNS)ĐỊNH LƯỢNG NITƠ TỔNG SỐ BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHLĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP BRADFORDPHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYMETÁCH CÁC SẮC TỐ QUANG HỢP BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ GIẤY HOẶC BẢN MỎNG
1 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG – THỰC PHẨM BÁO CÁO THỰC HÀNH HÓA SINH GVHD: ThS Trịnh Thị Lan Anh Nhóm 3- 14DSH04 Sinh Viên: Nguyễn Thanh Hiếu Nguyễn Thị Thu Thủy Trần Minh Nhi Trương Ngọc Phân Nguyễn Minh Luân Lê Huỳnh Phương Trúc MSSV: 1411100748 MSSV: 1411100788 MSSV: 1411100761 MSSV: 1411100733 MSSV: 1411100758 MSSV: 1411100738 BÀI 1: GIỚI THIỆU PHÒNG THÍ HÓA SINH, CÁCH PHA CHẾ CÁC DUNG DỊCH DÙNG TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH Lý thuyết Quy tắc làm việc phòng thí nghiệm hóa sinh I a An toàn làm việc với axit kiềm An toàn làm việc với axit - Phải làm việc tủ hút đun nóng axit thực phản ứng với axit tự - Khi pha loãng phải cho axit vào nước An toàn làm việc với kiềm - Kiềm làm cháy da - Mang găng tay , trang làm việc với dung dịch kiềm - Thao tác tủ hút, mang mặc nạ chống độc để phòng ngừa bụi kiềm b Quy tắc làm việc với hóa chất thí nghiệm Hóa chất thí nghiệm: - Các hóa chất dùng để phân tích, làm tiêu bản, tiến hành phản ứng, phòng thí nghiệm gọi hóa chất thí nghiệm Nhãn hiệu hóa chất : - Hóa chất bảo quản chai lọ, thủy tinh nhựa đóng kín có nhãn ghi tên hóa chất, công thức hóa hoc, mức độ sạch, tạp chất, khối lượng tịnh, khối lượng phân tử, nơi sản xuất , điều kiện bảo quản Cách sử dụng bảo quản hóa chất: - Khi làm việc với hóa chất , nhân viên phòng thí nghiệm sinh viên cần cẩn thận tráng gậy tai nạn đáng tiếc cho cho người khác - Bao đổ axit hay bazơ vào nước pha loãng - Không hút axit hay bazơ miệng mà phải dùng dụng cụ riệng như: ống bóp cao su II Cách pha chế dung dịch thí nghiệm hóa sinh: Dung dịch : - Dung dịch hỗn hợp hai hay nhiều chất tác động tương hổ với mặt vật lí hóa học Trong dung dịch gồm có chất hòa tan dung môi Các đơn vị nồng độ dung dịch: Nồng độ phần trăm, (% ) • Nồng độ phần trăm – khối lượng, % (w/w): số gam chất tan có 100g dung dịch • Nồng độ trăm khối lượng thể tích (w/v): số g chất tan có 100ml dung dịch • Nồng độ phần trăm thể tích – thể tích , % (v/v): số ml dung chất có 100ml dung dịch • Nồng độ gam – lít, (g/L): số g chất tan có lít dung dịch • Nồng độ phân tử g hay nồng độ mol, (mol/L): số phân tử g ( hay số mol) chất tan lít dung dịch • Nồng độ đương lượng (N); số đương lượng gam (đlg) chất tan có lít dung dịch Số đương lương chất tan = số mol (n) x hệ số đương lượng (z) - Hệ số đương lượng (z) : phụ thuộc vào chất chất phản ứng mà chất tham gia Nồng độ dung dịch bão hòa: nồng độ dung dịch tối đa chất hòa tan có mặt dung dịch Đơn vị nồng độ dùng phép phân tích vi lượng : - Nồng độ mg/mL : số mg chất tan 1mL dung dịch - Miligam phần trăm , mg% : mg chất tan 100g dung dịch - Phần nghìn ,0/00 : số gam chất hòa tan 1000g dung dịch - Phần triệu , ppn : số mg chất hòa tan 1kg hay lịt dung dịch - Phần tỷ , ppb : sồ µg chất hòa tan có 1kg hay lít dung dịch Cách pha dung dịch có nồng độ xác định a Pha dung dịch có nồng độ theo khối lượng ,% (w/w) - Chất tan chất rắn khan - Chất tan chất rắn ngậm nước ( CuS04.5H2O ) Khi pha dung dịch cần phải tính thêm lượng nước kết tinh có sẵn b Pha dung dịch loãng từ dung dịch đậm đặc c Pha dung dịch bão hòa : Lấy chất tan cần pha vào becher , thêm nước cất khuấy cho tan Nếu sau khuấy , chất tan không tan hết lắng xuống phần dung dịch phía dung dịch bão hòa Nếu chất tan tan hết , thêm chất tan tiếp tục khuấy , chất tan không tan d Pha dung dịch có nồng độ % theo thể tích : - Chất tan chất rắn khan Cân lượng chất tan cần thiết , chuyển sang bình định mức , dùng nước cất hòa tan định mức đến thể tích - Chất tan chất rắn ngậm nước Khi pha dung dịch ta cần phải tính lượng kết tinh có sẵn giống phần a - Chất tan dạng lỏng : số chất tan dạng lỏng HCl, H2S04… Ngày đa số dung dịch thí nghiệm pha chế theo nồng độ khới lượng- thể tích (w/v) i Pha dung dịch nồng độ phân tử gam: - Chất tan chất rắn khan : Muốn pha dung dịch nồng độ 1M chất , ta tính khối lượng phân tử chất theo đơn vị gam Cân xác lượng chất tan , qua phễu cho vào bình định mức có dung tích lít Cho vào lượng nước cất nhỏ , lắc để hòa tan hoàn toàn đưa nước cất tới mức Chuyển dunh dịch sang bình chứa, lác để trộn đồng Khi phải đun dung dịch để hòa tan, trình hòa tan có tỏa nhiệt phải chờ nhiệt độ trở lại bình thường (nhiệt độ không khí) thêm nước tới vạch định mức - Chất tan chất rắn ngậm nước : tính lượng chất tan cần cân phải tính khối lượng phân tử nước - Chất tan dạng lỏng: chất tan dung dịch, ta phải tính toán dựa vào nồng độ dung dịch Hiệu chỉnh nồng độ dung dịch a Dung dịch chuẩn Dung dịch chuẩn dung dịch chuẩn bị sẵn, đảm bảo xác dùng để định chuẩn dung dịch tự pha chế làm thí nghiệm Cách pha dung dịch từ ống chuẩn: - Dùng đinh thủy tinh chọc thủng ampun, hứng lên phểu vào bình định mức, dùng bình tia rửa chất tan có ampun vào bình định mức lit, vừa thêm nước cất vừa lắc đưa nước cất tới vạch mức - Đối với hợp chất bền vững, có thành phần không thay đổi NaCl, AgNO3, acid oxalic, pha dung dịch chuẩn trực tiếp cách cân xác chất cần pha, pha loãng định mức tới thể tích - Đối với chất NaOH, HCl, Na2S2O3, pha dung dịch chuẩn, chất thường không bền vững dễ thay đổi thành phần, sau pha phải hiệu chỉnh lại nồng độ b Phương pháp hiệu chỉnh nồng độ dung dịch Đối với chất dễ thay đổi thành phần dạng rắn, muốn pha dung dịch có nồng độ xác, ta pha dung dịch có nồng độ gần đúng, sau hiệu chỉnh nồng độ dung dịch dựa vào phản ứng với dung dịch chuẩn thích hợp Đối với dung dịch dễ thay đổi trình bảo quản, lần sử dụng lại phải xác định lại hệ số hiệu chỉnh nồng độ dung dịch Xét phản ứng trung hòa acid – base, ion gam H+ phản ứng với ion gam OH- Do đó: C1V1 =C2V2 Nếu gọi Cp nồng độ dung dịch định pha Ct nồng độ thực dung dịch ta có hệ số hiệu chỉnh K: K = Cp/Ct = Vp/Vt III Dung dịch đệm a Định nghĩa dung dịch đệm Dung dịch đệm dung dịch có pH không thay đổi nhiều lượng axit (H+ ) bazơ (OH-) Vậy, dung dịch đệm gồm cặp axit bazơ liên hợp ( axit yếu muối axit yếu bazơ yếu muối bazơ này) tỉ lệ chúng định pH dung dịch Trong thể sống, dung dịch đệm đóng vai trò quan trọng ví dụ ổn định pH máu hệ đệm cacbonat phosphat b Cách pha số dung dịch đệm thường dùng - Dung dịch đệm borat Dung dịch đệm citrate (pH = 3,0 – 3,6) Dung dịch đệm phosphate( pH = 5,7 – 8,0) Dung dịch đệm Na2HPO4 – KH2PO4 (Ph = 5,0 – 8,0) Dung dịch đệm glycine – HCl (pH = 2,2 – 3,6) Dung dịch đệm Glycine – NaOH (pH = 8,6 – 10,6) Dung dịch đệm axetat (pH = 3,6 – 5,6) Dung dịch đệm vạn 0.1 M CÂU HỎI ÔN TẬP Câu 1: Pha 1L dung dịch NaOH 40% (w/v): cân X=(40x1000)/100=400(g) NaOH khô Câu 2: Nồng độ mol H2SO4 đđ là: CM = (10.d.C%)/M = (10x97x1.84)/98 = 18.2 (mol) Thể tích H2SO4 cần sử dụng là: VH2SO4 = (VH2SO4 2M CMH2SO4)/CMH2SO4 đđ = (2x500)/18.2 = 54.91(ml) Lượng nước cần bổ sung là: 500 – 54.91 = 445.09 (ml) Câu 3: Pha 250ml dung dịch CuSO4 1M, cân m = n.M = 0.25 x 250 = 62.5 (g) CuSO4.5H2O Câu 4:H2SO4 2M = H2SO4 4N C1.V1 = C2.V2 V2 = (1000 x 0.1)/4 = 25 (ml) Câu 5: - Lượng NaOH cần để pha dung dịch 10% là: X= ( 10x500)/100 = 50 (g) - Lượng dung dịch NaOH 40% cần dùng là: Y = (100x50)/40 = 125 (g) - Lượng nước cất thêm vào: 500 – 125 = 375 (g) Câu 6: - Lượng HCl cần để pha dung dịch 2% là: X = (2x500)/100 =10 (g) - Lượng dung dịch HCl 37% cần dùng là: Y = (100 * 10)/37 = 27.03 (g) => 27.03 /1.19 = 22.71 (ml) - Lượng nước cất thêm vào : 500 – 22.71 = 477.29 (ml) BÀI : ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG PHÁP ACID DINITRO-SALICYLIC (DNS) LÝ THUYẾT Nguyên tắc Phương pháp dựa sở phản ứng tạo màu đường khử với thuốc thử acid dinitrosalicylic (DNS) Cường độ màu hỗn hợp phản tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử phạm vi định THỰC HÀNH I Dụng cụ -Hóa chất: Dụng cụ - Máy đo màu - Cuvette d = cm, V = 4ml - Ống nghiệm có nắp dụng cụ thủy tinh khác - Bếp điện Hóa chất - Mẫu rau chứa đường (dứa) - -Thuốc thử DNS - -Dung dịch glucose chuẩn 1mg/ml (bảo quản lạnh) II Tiến hành Chiết xuất đường thực vật - Chuẩn bị mẫu thơm 20g - Giã nhỏ - Vắt lấy nước cho vào bình định mức - Thêm nước cất đủ 100ml - Pha loãng mẫu hệ số n (20,50,100,200 lần) Dựng đường chuẩn xác định hàm lượng đường Hóa chất Ống ĐC Ống Ống Ống Ống Ống Mẫu Mẫu Glucose 10mg/ml (ml) Nước cất (ml) 1 1 1 1 Nồng độ (mg/ml) 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 DNS (ml) 3 3 3 Pha loãng 100 lần 3 OD540nm 0.172 0.346 0.522 0.684 0.858 0.248 - Đo bước sóng 540nm - CHÚ Ý : tiến hành mẫu dựng đường chuẩn thí nghiệm đồng thời Phương trình hồi quy tuyến tính: y = 0.855x + 0.0034, với hệ số tương quan r2 = 0.9998 Thay OD mẫu vào phương trình ta ymẫu = 0.215 Vậy với tỉ lệ pha loãng 100 lần ta nồng độ đường khử mẫu chưa pha loãng là: [đường khử]mẫu = 0.215*100 = 21.5 mg/ml CÂU HỎI ÔN TẬP Câu 1: Đường khử đường chứa nhóm aldehyde (-CHO) ketone (-CO) glucose , fructose ,arabinose , maltose , lactose (saccharose , trehalose đường khử Câu 2: Áp dụng phương pháp đo đường khử trường hợp phân tích nồng độ đường khử dung dịch Câu : Sai số hệ thống lý do: - Hóa chất chuẩn bị cho thí nghiệm không chuẩn Do vận chuyển mẫu không cách Thao tác đo không xác Ghi không xác số Ở dụng cụ cuvete đo OD Ống nghiệm Nước cất, ml Albumin chuẩn (0,1 mg/ml), ml 1 0.9 0.1 0.8 0.2 0.7 0.3 0.6 0.4 0.5 0.5 TT Bradford, ml Nồng độ Albumin (µg/ml) OD595nm 5 10 20 30 40 50 0.09 0.17 0.24 0.31 0.37 X Thay albumin chuẩn mẫu pha loãng 100 lần 0.003 - Tính thời gian ống 20 phút, tiến hành đo độ hấp thu dung dịch bước sóng 595 nm Ta có giá trị OD0, thời điểm 21 phút đo ống (OD1), tương tự cách phút đo cho hết ống Ghi lại giá trị OD Tính kết quả: - Vẽ đường tuyến tính nồng độ protein (µg/ml) với mật độ quang OD595nm - Dựa vào phương trình đường tuyến tính nồng độ protein (µg/ml) với mật độ OD quang OD595 ta tính hàm lượng protein P mẫu phân tích X 595nm 20 Y = 10,514X + 0.0015 ⇒X= Y − 0,0015 0,045 − 0,0015 10,514 10,514 = = 4,14 10−3 � = X n = 4,14 10−3 25 = 0,1035 Để tính tóan hàm lượng protein 1g mẫu cân: Protein (µg/g) = � ∗ � � = 0,1035 ∗ 10 100 = 1.035 CÂU HỎI ÔN TẬP: Giải thích ý nghĩa bước thí nghiệm - Pha loãng mẫu với hệ số pha loãng n lần để mẫu phân tích → Phải giảm bớt nồng độ protein mẫu, để đo nồng độ quang không bị vượt giới hạn cho phép - Lập loạt ống theo số thứ tự 0, 1, 2, 3, 4, ống nghiệm chứa mẫu cần phân tích X → Phải pha nồng độ khác để lập đường chuẩn Để xác định protein mẫu - Dùng đồng hồ bấm giây, canh thời gian phút cho 5ml thuốc thử vào ống nghiệm 0, lắc để yên Ở thời điểm phút cho 5ml thuốc thử vào ống nghiệm 1, lắc để yên, tiếp tục hết → Phương pháp dựa thay đổi bước sóng hấp thu cực đại thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue tạo phức hợp với protein - Tính thời gian ống 20 phút, tiến hành đo độ hấp thu dung dịch bước sóng 595 nm Ta có giá trị OD 0, thời điểm 21 phút đo ống (OD 1), tương tự cách phút đo cho hết ống Ghi lại giá trị OD → Trong 20 phút thuốc nhuộm kết hợp với protein thuốc nhuộm hấp thu cực đại bước sóng 595 nm 23 Thảo luận yếu tố dẫn đến sai số Do sai thao tác tiến hành thí nghiệm Mẫu protein chuẩn bị không chuẩn Hóa chất chuẩn bị cho thí nghiệm không chuẩn Do vận chuyển mẫu không cách Lấy mẫu không theo thể tích yêu cầu Ghi không xác số Thao tác đo không xác Máy đo OD không chuẩn Áp dụng phương pháp bradford cho trường hợp Phương pháp dựa thay đổi bước sóng hấp thu cực đại thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue tạo phức hợp với protein.Hình thành hợp chất màu có khả hấp thu ánh sáng bước sóng 595nm, cường độ màu tỷ lệ với nồng độ protein dung dịch Tiết kiệm thời gian dễ thực Cường độ màu tỉ lệ nồng độ protein dung dịch nồng độ cao màu xanh đậm không phụ thuộc nồng độ acid amin dung dịch Phương pháp có độ nhạy cao cho phép phát phát tới vài protein 5-200 µg/ ml Nhạy phường pháp Lowry gấp lần Ít bị ảnh hưởng chất thường gặp tế bào gặp chẳng hạn muối Trường hợp mẫu thể rắn cần phải xử lý mẫu nào? Cân m = 5-10g mẫu rắn nghiền nhỏ, cho vào bình nón dung tích 250ml, bổ sung 50ml nước cất 10ml dung dich đệm phosphat pH = 4,9 Giữ hỗn hợp nhiệt độ 30oC thời gian có khuấy đảo định kỳ Lọc, rửa thu hồi dung dịch cho V = 100ml Bảo quản dung dịch gốc – 4oC thời gian ngày BÀI 5: PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME LÝ THUYẾT: I Enzyme đơn vị đo hoạt tính enzyme a Định nghĩa Enzyme chất xúc tác sinh học có chất protein có tính đặc hiệu cao Mỗi enzyme có khả xúc tác cho phản ứng định Hoạt động hay hoạt tính enzyme mạnh lượng chất chuyển hóa lượng sản phẩm tạo thành đơn vị thời gian lớn Vì đánh giá hoạt tính xúc tác enzyme cách xác định tốc độ chuyển hóa chất tốc độ tích lũy sản phẩm phản ứng Về nguyên tắc hai nhóm phương pháp sau: Đo lượng chất bị hay lượng sản phẩm tạo thành thời gian định ứng với nồng độ enzyme xác định Đo thời gian cần thiết để thu lượng biến thiên định chất hay sản phẩm tương ứng với nồng độ enzyme xác định Để thực mục đích trên, nhiều phương pháp phân tích khác sử dụng: phương pháp đo quang phổ, đo độ phân cực, áp suất, độ nhớt, phương pháp sắc ký phương pháp hóa học Mục đích xác định hoạt tính enzyme xác định số đơn vị hoạt tính Một đơn vị họat tính enzyme định nghĩa theo nhiều phương pháp b Đơn vị hoạt tính enzyme: Đơn vị đơn vị quốc tế (Enzyme Unit, viết tắt U) Do Hiệp hội Hóa sinh Quốc tế (International Union of Biochemistry – IUB) định nghĩa: Một đơn vị chuẩn enzyme (1 U) lượng enzyme xúc tác chuyển hóa �mol chất sau phút điều kiện tiêu chuẩn U = �mol sản phẩm = �mol chất (10-6 mol)/phút Katal: Năm 1979, Hội đồng Danh pháp IUB khuyến cáo nên sử dụng Katal làm đơn vị hoạt tính enzyme Một Katal lượng enzyme xúc tác chuyển hóa mol chất sau giây điều kiện tiêu chuẩn Kat = mol chất/ giây = 60 mol/ phút = 60 x 106 �mol/ phút = x 107 U U = 1/60 x 10-6 Kat = 16,67 nKat (nanokatal) Đơn vị Katal khuyến cáo nằm hệ đơn vị đo lường Quốc tế (SI) Đơn vị tự đặt: đơn vị hoạt tính dựa vào thay đổi đặc tính hỗn hợp phản ứng, ví dụ thay đổi độ đục, độ nhớt đơn vị thời gian Trường hợp chất sản phẩm hỗn hợp phức tạp áp dụng đơn vị hoạt tính II Hoạt tính riêng enzyme Hoạt tính riêng chế phẩm enzyme đăc trưng cho độ tinh chế phẩm enzyme Hoạt tính riêng biểu thị số đơn vị enzyme/mg protein ( U/mg protein) (Kat/kg protein), hàm lượng protein xác dịnh phương pháp Lowry Bradford III Phương pháp xác định hoạt tính enzyme Chú ý: - Cần trách yếu tố biến tính protein enzyme - Các thông số nhiệt độ , pH, nồng độ ion thành phần dung dịch đệm ảnh hưởng lên hoạt tính enzyme Thử hoạt tính enzyme phải tiến hành điều kiện thích hợp điều kiện sinh lý, đk tồn trữ thực phẩm đk mà hoạt lực đạt tối ưu - Với enzyme cần có chất hoạt hóa chất ổn định phải cho chất vào enzyme trước cho chất vào hỗn hợp phản ứng - Nồng độ chất giới hạn thích hợp, đủ thừa để bão hòa enzyme, không cao để kìm hãm enzyme, chất chuyển hóa 20%-30% - Thởi gian xác định hoạt tính thường 5-30 phút - Khi xác định hoạt tính phải làm mẫu đối chứng( enzyme bị bất hoạt trước tiếp xúc với chất) song song với thí nghiệm IV Enzyme amylase phương pháp xác định hoạt tính a Khái enzyme amylase b Các phương pháp đo hoạt tính enzyme amylase - Nguyên tắc chung dựa sở thủy phân tinh bột enzyme dd enzyme nghiên cứu thành dextrin có phân tử lượng khác Đo cường độ màu tạo thành tinh bột sản phẩm thủy phân với iod máy so màu tính hoạt tính enzyme - Đơn vị amylase (theo Smith Roe) lượn enzyme cần thiết để thủy phân hoàn toàn 10 mg tinh bột sau thời gian phản ứng 30 phút điều kiện thí nghiệm THỰC HÀNH: Dụng cụ - hóa chất: a Dụng cụ - Máy lắc - Máy đo quang phổ, cuvette dày 1cm - Bể điều khiển - Bình định mức - Ống nghiệm - Pipette 5ml, 1ml - Đồng hồ bấm giây - Giấy thấm - Giá để ống nghiệm - Bình tia đựng cồn b Hóa chất: Dung dịch đệm - Dung dịch đệm - Dung dịch đệm acetate pH= 4,7 (xác định hoạt tính enzyme nấm mốc): trộn thể tích CH 3COOH 1N với thể tích CH 3COONa 1N Kiểm tra pH - Dung dịch đệm phosphate pH= 4,9 (xác định hoạt tính enzyme malt): trộn 10 ml dung dịch Na 2HPO 1/15 M với 990 ml dung dịch KH 2PO 1/15 M nhận l dung dịch đệm phosphate pH = 4,94 Kiểm tra pH - Dung dịch đệm glycine – NaOH 0,1 M pH = 10 (dùng đ ể xác định hoạt tính � −amylase kiềm - Dung dịch HCl 0,1N Dung dịch iod: hòa tan 30 mg KI mg I2 v ới lượng nhỏ nước cất Lắc nhẹ hỗn hợp để hòa tan hoàn toàn, sau chuyển dung dịch sang b ình định mức 1000 ml, bổ sung nước cất đến vạch mức Bảo quản dung dịch b ình màu nâu để chỗ tối - Dung dịch tinh bột 1%: h òa tan g tinh b ột (theo chất khô tuyệt đối) với 50 ml nước cất bình định mức 100 ml, lắc Đặt v bếp cách thủy sôi, lắc li ên tục tinh bột tan ho àn toàn Sau làm ngu ội bổ sung 10 ml đệm acetate pH = 4,7 (hoặc 10 ml dung dịch đệm phosphate pH = 4,9) bổ sung n ước cất đến vạch mức, lắc Dung dịch đ ược chuẩn bị ngày sử dụng - Dung dịch enzyme gốc Trích ly enzyme: Enzyme trích ly từ chế phẩm hay tế bào, mô động thực vật dd đệm có pH thích hợp - Trích ly enzyme từ vi khuẩn: Cân m= 0,1g chế phẩm dùng đũa thủy tinh chà nhẹ chế phẩm cốc dt 50ml cho vào bình định mức 100ml + H2O cất lọc trích ly enzyme bảo quản 2-4°C / ngày - Trích ly enzyme nấm mốc: Cân m=5g chế phẩm dùng đũa thủy tinh chà nhẹ chế phẩm cốc dt 50ml cho vào bình định mức 100ml + H2O cất +dd đệm Acetate pH=4,7 giữ nhiệt độ 30°� lọc, rửa, trích ly lấy enzyme V= 100ml bảo quản 2-4°� / ngày - Trích ly enzyme từ malt: Cân m=5-10g chế phẩm xay nhỏ cho vào bình định mức 100ml + H2O cất +dd đệm phosphase pH=4,9 lọc, rửa, trích ly lấy enzyme V= 100ml bảo quản 2-4°� / ngày Pha loãng enzyme: Hệ số pha loãng : n= 50,100,200 Xác định hoạt tính thí nghiệm: Hóa chất Thí nghiệm Đối chứng Mẫu trắng Dd Tinh bột 1% ml ml Nước cất 0 2ml Đệm 1ml 1ml 1ml Dd NaCl 3% 0,5ml 0,5ml 0,5ml ủ 40 °C , 10 phút để đạt điều kiện enzyme hoạt động tốt Dd enzyme 1ml 0 ủ 40 °C , 30 phút để xảy phản ứng HCl 1N 1ml 1ml 1ml Dd enzyme 1ml 1ml Chuyển sang bình định mức 100ml Nước cất Đến vạch Đến vạch Đến vạch Iod 0,5ml 0,5ml 0,5ml Tính kết quả: Số mg tinh bột bị thủy phân � = 1,841 ( OD0-OD) 0D0 = (0.717-0,651) × 20 = 0,717 = 901,1 Hoạt tính ( đơn vị hoạt tính/g) === 92,05 Họat tính riêng (đơn vị họat tính/mg protein) = họat tính toàn phần/mg protein (Bradford) Trong : n = hệ số pha loãng V= thể tích dịch trích ly, ml m= khối lượng enzyme đem trích ly, g CÂU HỎI ÔN TẬP Câu 1: Phân biệt dạng enzyme amylase nguồn thu chúng Có dạng chính: -α-amylase (Endo α-1,4-glucanase; EC 3.2.1.1) có nước bọt, hạt hòa thảo nảy mầm, tụy tạng, nấm mốc, vi khuẩn -β-amylase (Exo α-1,4-glucanase; EC 3.2.1.2) có nhiều thực vật (hạt củ) -Glucoamylase Câu 2: Bản chất hoạt tính enzyme gì? Nêu phương pháp đo hoạt tính enzyme Bản chất: hoạt tính enzyme mạnh lượng chất chuyển hóa lượng sản phẩm tạo thành đơn vị thời gian lớn Hai nhóm phương pháp sau: - Đo lượng chất bị hay lượng sản phẩm tạo thành thời gian định ứng với nồng độ enzyme xác định - Đo thời gian cần thiết để thu lượng biến thiên định chất hay sản phẩm tương ứng với nồng độ enzyme xác định Câu 3: Cơ chất sản phẩm enzyme α-amylase gì? Dựa pp người ta chọn pp xác định hoạt tính thí nghiệm? Cơ chất enzyme α-amylase tinh bột Enzyme phân giải liên kết 1,4- glycoside chuỗi polysaccharide (hoạt tính endoamylase) tạo thành maltose, dextrin phân tử thấp Nguyên tắc chung dựa sở thủy phân tinh bột enzyme dung dịch enzyme nghiên cứu thành dextrin có phân tử lượng khác Đo cường độ màu tạo thành tinh bột sản phẩm thủy phân với iode máy so màu tính hoạt tính enzyme Câu 4: Có thể sử dụng pp đo đường khử DNS acid để đo hoạt tính enzyme αamylase không? Tại sao? Vì DNS tạo màu với đường khử đo hoạt tính enzyme α-amylase tinh bột tạo màu với lugol Câu 5: Cho biết định nghĩa đơn vị hoạt tính theo Smith Roe Đơn vị có giống đơn vị quốc tế không? Ta chuyển đơn vị Smith Roe thành đơn vị quốc tế không giữ nguyên pp xác định Đơn vị amylase (theo Smith Roe) lượng enzyme cần thiết để thủy phân hoàn toàn 10 mg tinh bột sau thời gian phản ứng 30 phút điều kiện thí nghiệm Đơn vị không giống đơn vị quốc tế BÀI :TÁCH CÁC SẮC TỐ QUANG HỢP BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ GIẤY HOẶC BẢN MỎNG I LÝ THUYẾT NGUYÊN TẮC Hổn hợp phân tử sắc tố phân tách thành đơn chất phương pháp sắc ký , sắc ký giấy sắc ký mỏng đơn giản Các phương pháp dựa vào khả tương tác khác phân tử sắc tố với phân tử pha tĩnh khả lôi kéo dung môi DỤNG CỤ -HÓA CHẤT - Dụng cụ - Phễu lọc - Giấy lọc - Bản mỏng nhôm phủ silica gel G254 - Bình tam giác 250ml - Ống nghiệm có nắp hay bình chứa dung môi sắc ký - Mao quản chấm mẫu hay micropipette đầu típ 100 - nguyên liệu hóa chất - Lá rau cải bó xôi hay loại rau xanh khác - Ethanol 96 % - Acetone - Ether dầu hỏa - Cồn 95% II TIẾN HÀNH - Nghiền 10g 10ml ethanol 95% đun sôi phút - Lọc - Cắt giấy lọc thành dải có đầu nhọn kẻ vạch tiếp mẩu vạch dừng - Thấm mẫu lên vạch micropipette - Nhúng giấy lọc dung môi - Để dung môi chạy lên vạch dừng - Đánh dấu vệt sắc tố bút chì - Đo khoảng cách từ vạch sắc tố đến vạch thấm mẫu - Mao quản chấm mẫu hay micropipette đầu típ 100 - nguyên liệu hóa chất - Lá rau cải bó xôi hay loại rau xanh khác - Ethanol 96 % - Acetone - Ether dầu hỏa - Cồn 95% III TIẾN HÀNH - Nghiền 10g 10ml ethanol 95% đun sôi phút - Lọc - Cắt giấy lọc thành dải có đầu nhọn kẻ vạch tiếp mẩu vạch dừng - Thấm mẫu lên vạch micropipette - Nhúng giấy lọc dung môi - Để dung môi chạy lên vạch dừng - Đánh dấu vệt sắc tố bút chì - Đo khoảng cách từ vạch sắc tố đến vạch thấm mẫu 31 TÍNH KẾT QUẢ Rf= Đoạn đường sắc tố chạy/ Đoạn đường dung môi chạy RfBeta caroten = 11/11 = 1.000 RfXantophin = 9/11 = 0.818 RfChlorophyll A = 7/11 = 0.636 RfChlorophyll B = 4/11 = 0.364 31 TRẢ LỜI CÂU HỎI Câu1 :Độ phân cực dạng sắc tố quang hợp hình 6.1 làcholorophyll A cholorophyll b có độ phân cực lớn b-carotene , b-carotene có độ phân cực thấp , zeaxanthin có độ phân cực lớn b-carotenen nhõ cholorophyll A cholorophyll B Câu2 :Phải dùng ethan 95% để trích ly sắc tố mà không dùng nước sắc tố tan dung môi hữu , không tan trongnước Câu3 :Giá trị Rf sắc tố 7,5/8 Tên sắc tố có giá trị Rf = 7,5/8 zeaxanthin [...]... tắc: a) Vô cơ hóa mẫu - Trước tiên mẫu được vô cơ hóa bằng H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao và có chất xúc tác Các phản ứng của quá trình vô cơ hóa xảy ra như sau: 2H2SO4 2H20 + 2SO2 + O2 - Oxi tạo thành trong phản ứng lại oxi hóa các nguyên tố khác Các phân tử chứa nito dưới tác dụng của H2SO4 tạo thành NH3 Ví dụ các protein bị thủy phân thành amini acid, cacbon và hidro của acid amine tạo thành CO2 và H2O,... đã được vô cơ hóa và phản ứng với NaOH, phía dưới là bình tan giác chứa H2SO4 để cố định NH3 sinh ra - Hình 2: các bình tam giác chứa H2SO4 - Hình 3: bình tam giác sau khi thực hiện quá trình Kjendahl, chứa muối (NH4)2SO4 - Hình 4: bình tam giác sau khi chuẩn độ chuyển sang màu xanh nhạt hơn CÂU HỎI ÔN TẬP Câu 1) Giải thích ý nghĩa các bước trong thí nghiệm a) Vô cơ hóa mẫu - Oxi tạo thành trong phản... tố có thể biến tính protein enzyme - Các thông số nhiệt độ , pH, nồng độ ion và thành phần dung dịch đệm ảnh hưởng lên hoạt tính enzyme Thử hoạt tính enzyme phải được tiến hành trong điều kiện thích hợp như điều kiện sinh lý, đk tồn trữ thực phẩm hoặc đk mà hoạt lực có thể đạt tối ưu - Với những enzyme cần có chất hoạt hóa hoặc chất ổn định thì phải cho các chất này vào enzyme trước khi cho cơ chất... dd enzyme nghiên cứu thành các dextrin có phân tử lượng khác nhau Đo cường độ màu tạo thành giữa tinh bột và các sản phẩm thủy phân của nó với iod bằng máy so màu sẽ tính được hoạt tính của enzyme - Đơn vị amylase (theo Smith và Roe) là lượn enzyme cần thiết để thủy phân hoàn toàn 10 mg tinh bột sau thời gian phản ứng 30 phút trong điều kiện thí nghiệm THỰC HÀNH: 1 Dụng cụ - hóa chất: a Dụng cụ - Máy... hóa mẫu - Oxi tạo thành trong phản ứng lại oxi hóa các nguyên tố khác Các phân tử chứa nito dưới tác dụng của H2SO4 tạo thành NH3.NH3 kết hợp với H2SO4 dư tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch 2NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4 b) Chưng cất đạm: - Đuổi NH3 ra khỏi dung dịch bằng NaOH - (NH4)2SO4 + 2NaOH Na2SO4 + H2O + 2NH3 - NH3 bay ra được làm lạnh biến đổi thành NH4OH rơi vào bình hứng, bình hứng chứa H2SO4... Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein và có tính đặc hiệu cao Mỗi enzyme có khả năng xúc tác cho một hoặc một số phản ứng nhất định Hoạt động hay hoạt tính của enzyme càng mạnh thì lượng cơ chất được chuyển hóa hoặc lượng sản phẩm tạo thành trên một đơn vị thời gian càng lớn Vì vậy có thể đánh giá hoạt tính xúc tác của enzyme bằng cách xác định tốc độ chuyển hóa cơ chất hoặc tốc độ... vị quốc tế (Enzyme Unit, viết tắt U) Do Hiệp hội Hóa sinh Quốc tế (International Union of Biochemistry – IUB) định nghĩa: Một đơn vị chuẩn của enzyme (1 U) là lượng enzyme xúc tác chuyển hóa được 1 �mol cơ chất sau 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn 1 U = 1 �mol sản phẩm = 1 �mol cơ chất (10-6 mol)/phút Katal: Năm 1979, Hội đồng Danh pháp của IUB khuyến cáo nên sử dụng Katal làm đơn vị cơ bản của hoạt... mẫu khi vô cơ hóa mẫu để đưa vào chưng cất 3.2 Tiến hành - - B1: Lấy 4ml mẫu + 0,5g xúc tác (K2SO4, CuSO4.5H2O = 3:1) + 10ml dung dịch H2SO4 đđ to dung dịch có màu trắng +H2O định mức đến 50ml B2: Chưng cất đạm Cho 50ml mẫu B + 3 giọt Tashiro + 50ml NaOH 40% vào bình cất đạm, cho 30ml H2SO4 0,1 vào erlen + 3 giọt tashiro → lắp đặt hệ thống Kjeldahl và vận hành cho đến khi không còn NH4OH sinh ra B3:...- Hút hóa chất không chính xác Câu 4 : Khi đo OD máy báo over là do mẫu quá đậm đặc cần phải pha loãng lại Gía trị OD nằm trong khoảng từ 1 đến 5 Vì nếu cao quá hoặc thấp quá đường chuẩn sẽ bị lệch Câu 5: Trong bài thực hành chọn đường glucose để dựng đường chuẩn điều này không luôn đúng vì đường khử có nhiều loại... EC 3.2.1.2) có nhiều ở thực vật (hạt củ) -Glucoamylase Câu 2: Bản chất của hoạt tính enzyme là gì? Nêu các phương pháp đo hoạt tính của enzyme Bản chất: hoạt tính của enzyme càng mạnh thì lượng cơ chất được chuyển hóa hoặc lượng sản phẩm tạo thành trên một đơn vị thời gian càng lớn Hai nhóm phương pháp chính sau: - Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong một thời gian