Bài thuyết trình Báo cáo Thực hành Hóa sinh

Bài thuyết trình Báo cáo Thực hành Hóa sinh trình bày những bài thực hành về định tính protein & acid amin; hoạt động của enzyme; lipid, enzyme dịch vị & dịch tụy; xét nghiệm glucose, cholesterol & urea máu; xét nghiệm protein, bilirubine trong máu; xét nghiệm hóa sinh nước tiểu.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY ĐƠ • • KHOA  DƯỢC – ĐIỀU DƯỠNG – ĐH DƯỢC 9E BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH HĨA  SINH GVHD Dương Trương Dung **Nhóm 1                      **Nhóm 2     1. Huỳnh Tuyết Ngân Tâm                 6. Trương Tuấn Long     2. Nguyễn Thị Bảo Trân                                      7. Trần Hải Đăng     3. Nguyễn Quốc Huy                 8. Phạm Xuân Mai     4. Ký Lâm Vĩnh Phú      5. Đặng Tự Trọng                   9. Bùi Minh Quang               10. Trần Hoàng Trọng Hiếu TỔ MỤC LỤC Bài   Nội dung Trang ĐỊNH TÍNH PROTEIN & ACID AMIN Phản ứng Ninhydrin Phản ứng màu Biure Phản ứng tủa protein bởi nhiệt với mơi trường acid  yếu Phản ứng tủa bởi acid mạnh và khơng cần đun nóng Tìm Protein trong nước tiểu HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYME Phương pháp ENZYMATIC Phương pháp WOHLGEMUTH LIPID, ENZYME DỊCH VỊ & DỊCH TỤY Khảo sát tính hòa tan 10 Sự nhũ tương hóa 11 Tìm thể cetone trong nước tiểu 12 XÉT NGHIỆM GLUCOSE, CHOLESTEROL &  UREA MÁU Phương pháp ENZYMATIC 13 Định lượng cholesterol trong máu 14 XÉT NGHIỆM PROTEIN, BILIRUBINE TRONG  MÁU Định lượng ALBUMIN trong máu 15 Định lượng BILIRUBIN trong máu 16 XÉT NGHIỆM HĨA SINH NƯỚC TIỂU 17 BÀI 2: ĐỊNH TÍNH PROTEIN & ACID AMIN THÍ NGHIỆM 1: PHẢN ỨNG NINHYDRIN I Nguyên tắc : Aminoacid + Ninhydrin → phức màu xanh tím II. Tiến hành: Dung dịch Lòng trắng trứng Ống  1 1 ml Ống  2 Nước máy 1 ml III. Kết quả & Biện luận      ­  Ố+ Ninhydrin là m ng 1: dd có màu xanh tím         ột chất oxy       ­  Ống 2: khơng màu hóa nên có th ể tạo nên phản ứng  Carboxyl Oxy hóa của Acid amin  với nước, để cuối cùng cho ra  CO2, NH3, một Aldehyde ngắn  đi một C so với gốc Acid amin  ban đầu và Ninhydrin bị khử.          + Sau đó, Ninhydrin bị khử  tiếp tục tác dụng với NH3 vừa  phóng thích và kết hợp với một  phân tử Ninhydrin thứ hai tạo  thành sản phẩm ngưng kết có  màu xanh tím -1- Ninhydrin 0,2% Cho 1 ml vào mỗi  ống nghiệm THÍ NGHIỆM  2: PHẢN ỨNG  MÀU BIURET Dung dịch Ống Dd lòng trắng trứng ml Nước máy Ống ml Dd NaOH 40% 0.5 ml 0.5 ml Dd CuSO4 1% giọt giọt I. Nguyên tắc :              Protein +  CuSO4 + NaOH  →  phức  chất  màu  tím hồng   Lắc Quan sát tượn g dd có màu tím hồng -2- dd có màu xanh nhạt THÍ NGHIỆM 3: PHẢN ỨNG TỦA PROTEIN BỞI NHIỆT VỚI MÔI TRƯỜNG ACID YẾU I Ngun tắc: ­ Protein hòa tan trong nước hình thành dung dịch keo, trong đó các tiểu  phân  protein  tích  điện  cùng  dấu  và  mang  lớp  áo  nước  (hydrat  hóa).  Nhờ  tích  điện  cùng  dấu  nên  các  tiểu phân  protein  đẩy  nhau  và  nhờ  có  lớp  áo  nước nên chúng ngăn cách nhau, vì vậy dung dịch keo protein bền vững Ống     ­ Nếu làm mất 2 yếu tố trên thì các ti ểu phân protein do chuyển động sẽ  Dung Dịch gặp nhau, dính vào nhau thành những h1ạt to và kết tủa Lòng trắng trứng thẩm II Tiến hành ml ml tích Dd CH3COOH 1% giọt Dd CH3COOH 10% ml ml 5 giọt giọt giọt ml NaCl bão hòa NaOH 10% giọt Đun sơi cách thủy ống III Kết & Biện luận -3- Ống nghiệm Hiện tượng Giải thích dd có màu trắng trong, không tủa Do tiểu phân tử protein bị lớp áo nước bao bên tích điện dd có kết tủa trắng đục Vì mơi trường axit yếu, nhóm (COO-) bị ức chế phân ly, tiểu phân tử protein điện tích pH mơi trường đạt gần tới điểm đẳng điện dd suốt, khơng tủa Do tính háo nước axit mơi trường axit mạnh có nhiều ion H+ nên protein bị khử nước Các nhóm -COO- trung hòa nhóm NH3+ khơng trung hòa Phân tử protein tích điện dương Do khơng tạo kết tủa Kết tủa trắng Vì CH3COOH 10% + NaCl bão hòa tạo nên mơi trường trung hòa điện Khơng tủa Do NaOH 10% gây mơi trường kiềm Nhóm NH3+ trung hòa Vì vậy, đun sôi điện tử âm tiểu phân tử protein Protein tích điện âm khơng tạo tủa   **Kết luận:            + Phần lớn protein bị đong tụ khi đun trong mơi trường trung tính  hay axit yếu           + Trong mơi trường kiềm mạnh hay axit mạnh, protein còn tích  điện nên khơng tạo tủa           + Protein dễ dàng tạo tủa khi pH mơi trường đạt điểm đẳng điện ­4­ THÍ NGHIỆM 4: PHẢN ỨNG TỦA BỞI ACID MẠNH VÀ KHƠNG ĐUN NĨNG I Ngun tắc:         Các acid vơ cơ mạnh (HNO3, H2SO4, HCl,…) và các acid hữu cơ  (acid Trichloracetic, acid Sulfosalicylic) có tác dụng làm biến tính và kết  tủa đại đa số protein Acid vơ cơ II Tiến hành: Ống 1 Dd lòng trắng trứng 2 ml Nước máy HNO3 đậm đặc Ống 2 Acid hữu cơ Ống 3 Ống 4 2 ml 2 ml  2 ml Cho mỗi ống 1 ml Cho mỗi ống 1 ml Acid sulfosalicylic 3% Trộn đều Quan  sát  hiện  tượng Ống 1: kết tủa màu vàng.  Ống 3: kết tủa trắng  đục Biện  luận       Nhóm               của một số gốc  amino axit trong protein đã phản ứng  với HNO3 cho hợp chất mới mang  nhóm NO2 có màu vàng, đồng thời  protein bị đơng tụ bởi HNO3 thành kết  tủa       Khi cho các acid hữu  cơ vào dd lòng trắng  trứng sẽ tạo nên mt acid  yếu, có khả năng gây tủa III Kết -5- THÍ NGHIỆM 5: TÌM PROTEIN TRONG NƯỚC TIỂU I Nguyên tắc         Các acid vơ cơ mạnh (HNO3, H2SO4, HCl,…) và các acid  hữu cơ (acid Trichloracetic, acid Sulfosalicylic) có tác dụng làm  biến tính và kết tủa đại đa số protein II Tiến hành & kết Ống 1 Nước tiểu (hủ 1) Ống 2 2 ml Nước tiểu (hủ 2) 2 ml 5 giọt Acid sulfosalicylic 5 giọt Quan sát  hiện tượng khơng tủa kết tủa trắng đục  Giải thích có protein trong nước tiểu  **Thường gặp ở các bệnh lý: viêm thận, hội chứng thận hư, … ­6­ BÀI 3: HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYME PHƯƠNG PHÁP ENZYMATIC ( U.V Test ) I Nguyên tắc GOT                    xảy ra theo phản ứng sau đây : GPT        α. cetooglutarate + L. Aspartate     GOT        L. Glutamate  +  Oxaloacetate          Oxaloacetate  +  NaDH +  H+         MDH         L. Malate   +  NAD+ U Thuảốy ra  theo ph c pha sẵn (Reagent 2 pha trong Reagent 1)                  x ản ứng sau đây:   ml Huyết thanh (hay huyết tương ) 0.1 ml        α. cetooglutarate  +   L. Alanin       GPT         L. Glutamate  +  Pyruvate           Pyruvate   +   NaDH   +   H+         MDH            L. Lactate  +  NAD+  II Tiến hành III Kết TRỊ SỐ BÌNH THƯỜNG Nam -7- Nữ GOT GPT < 37 UI/L < 40 UI/L < 31 UI/L XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘNG AMYLAZA TRONG NƯỚC TIỂU  ( Phương pháp WOHLGEMUTH ) I. Ngun tắc         Dùng phương pháp pha lỗng dần nước tiểu để tìm lượng enzym tối  thiểu phân hủy hết 2ml dd hồ tinh bột 1% ở 37oC/30 phút         Kiểm sốt độ phân hủy của hồ tinh bột bằng iode. Tính hoạt độ của  Amylaz theo đơn vị Wholgemuth II. Tiến hành Dd NaCl 9% Nước tiểu  Hút 1 ml của ống 1 cho sang ống 2. Hút 1 ml của ống 2 sang ống 3.  Tiếp tục làm như vậy đến ống 7.Đến ống số 7 hút ra 1 ml bỏ đi Tỷ lệ 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 Thêm vào mỗi ống đúng 2 ml hồ tinh bột 1%, lắc đều Đun cách thủy 37oC/30 phút Lấy ra, cho vào mỗi ống 1 giọt dd Iode N/50. Lắc đều III. Kết quả -8- IV. Biện luận       ♠ Các ống 1,2,3 hồ tinh bột bị thủy phân hoàn toàn thành maltose,  glucose nên khơng màu       ♠ Ống 4 tinh bột bị thủy phân dỡ dang nên dextrin có màu trung gian       ♠ Ống 5,6,7,8 còn tinh bột nên có màu xanh dương ** Ống 5 là ống xuất hiện màu xanh dương đầu tiên →  Chọn ống 4 làm ống biểu diễn kết quả.  (Ống 4 có độ pha lỗng  nước tiểu là 1/16 mL)    Suy ra:   Hoạt độ Amylase/NT = 16 x 2 = 32 đ/v  **Kết luận:  Bình thường Wohlgemuth.  Chú ý: Hoạt độ Amylase cao thường gặp ở người bị viêm tụy cấp, quai  bị v v -9- BÀI 4: LIPID – ENZYME DỊCH VỊ & DỊCH TỤY THÍ NGHIỆM 1: KHẢO SÁT TÍNH HỊA TAN I Ngun tắc        Lipid thuộc nhóm các hợp chất khơng tan hoặc it tan trong nước &  dung mơi phân cực, dễ tan trong các dung mơi hữu cơ (khơng phân cực)  như: Cloroform, methanol, ether, benzene Ống Ống Dầu ăn II. Tiến hành giọt Nước máy giọt ml Alcol ml Lắc mạnh – Để yên 10 phút  ­ Ống 1: không tan, tách lớp         + Do dầu không tan trong  nước cất         + Sức căng bề mặt của dầu  nhỏ hơn của nước.          + Khi dầu rơi vào mặt  nướế c, n ướảc co l ết m III. K t qu  & Biạệi h n lu ậnức nên  kéo dầu dãn ra thành một màng  mỏng nổi bên trên.          + Tỷ trọng dầu nhỏ hơn  nước rất nhiều, nên dù có khuấy  thế nào, thì màng dầu vẫn nổi  trên mặt nước và khơng hòa tan       ­ Ống 2: Tan là do alcol là  dung mơi khơng phân cực -10- THÍ NGHIỆM 2: SỰ NHŨ TƯƠNG HĨA I Ngun tắc        Nhũ tương dầu trong nước là một nhũ tương khơng bền, khi cho  thêm 1 chất nhũ tương hóa như: xà phòng, muối mật, protein… sẽ được  nhũ tương bền II Tiến hành Nước Ống nghiệm máy 10 ml 10 ml 10 ml Dầu ăn giọt Na2CO 10% Xà phòn g 10 giọt Lắc mạnh – Để 10 yên giọt giọt phút giọt + Ống 1,2  không tách lớp → nhũ tương  bền III.Quan  Kết & Biện luận sát  hiện  + Ống 3  không bền  → tách lớp tượng Giải thích    + Ống 1&2: Vì Na2CO3 và xà phòng  là những chất hoạt động bề  mặt nó sẽ làm tăng độ bền nhũ tương bằng cách ngăn cản sự hợp  lại và tách hỗn hợp ra từng phần riêng lẽ nên nhũ tương bền.     + Ống 3: Vì nhũ tương dầu trong nước là nhũ tương khơng bền  nên có hiện tượng tách lớp -11- THÍ NGHIỆM 3: TÌM THỂ CETONE TRONG NƯỚC TIỂU I. Ngun tắc        Sodium nitroprussiat tác dụng với chất ceton cho phức chất màu tím,  phản ứng này xảy ra trong mơi trường kiềm               OH­               Cetone + Na Nitroprussiat           kiềm             phức chất màu tím       *Chú ý: các thể ceton bao gồm: + Acid aceto acetic + Acid β­hydroxy butyric + Aceteon II. Tiến hành Nước tiểu (hủ 1) Ống 1 20 giọt Nước tiểu (hủ 2) Acid acetic đậm đặc Sodium nitroprussiat 10% NH4OH đậm đặc    **Ống 1: xuất hiện vòng màu tím  → có thể ceton trong nước tiểu. Vì  trong nước tiểu có ceton nên khi  cho sodium nitroprussiat vào sẽ cho  phức màu tím III. K ết qu  & biườ ện lu    ­ Kết lu ận: ảCác tr ng hậ ợnp bệnh  lý thường gặp như         + Bệnh tiểu đường nặng hoặc  điều trị bằng insulin khơng đủ liều,  bệnh nhân đe dọa bị hơn mê         + Nhịn đói lâu ngày, nơn nhiều         + Vận động cơ nhiều,         Cushing,…      **Ống 2: khơng xuất hiện vòng  màu tím   khơng có thể ceton trong nước  tiểu     ­ Kết luận: bình thường Ống 2 20 giọt 4 giọt 2 giọt 0,5 ml 4 giọt 2 giọt 0,5 ml BÀI 5: XÉT NGHIỆM GLUCOSE – CHOLESTEROL – UREA TRONG MÁU ĐỊNH LỰỢNG GLUCOSE ( PHƯƠNG PHÁP ENZYMATIC ) I Ngun tắc       Glucose trong huyết thanh bị oxy hóa bởi phân hóa tố Glucose Oxydase  cho ra Gluconic Acid và H2O2 sẽ kết hợp với Phenol và 4 – aminoantipyrine có sự hiện diện của Peroxidase sẽ cho ra 1 màu đỏ tím        Phản ứng được tóm tắt như sau :         Glucose  +  O2  +  H2O      Glucose Oxydase      Gluconic acid  +  H2O2 U S Working Reagent ( R1 pha Peroxidase     Red quinone + 4      H2O2 + Phenol + 4 ­ aminoantipyrine     1000 µl 1000 µl R2) H2O Huyết 10 µl II Tiến hành Glucose standard 10 µl Trộn - Ủ 37oC/10 phút – Đo đọc kết máy - Kết luận:      + GLU conc = 210. 57  mmol/L → tăng quá cao  trong máu     + Một số trường hợp  bệnh lý thường gặp: Tiểu  đường tụy,   III Kết & Biện luận     + Rối loạn nội tiết trong  các trường hợp : cường  tuyến giáp, u tủy thượng  thận, cường tiền não thùy ĐỊNH LƯỢNG CHOLESTEROL TRONG MÁU ( PHƯƠNG PHÁP ENZYMATIC & POINT ) I Nguyên tắc        Cholesterol ester + H2O          Cho. Esterase           Cholesterol + Acid  béo                Cholesterol + O2              Cho. Oxdase                 Cholesterol – 3 – one  U + H2O2 S Reagent 1000 µl 1000 µl    2H2O2+ Phenol + 4­aminoantipyrin   Peroxidase       Red quinoneimin +  Huyết 10 µl 4H2O Standard cholesterol 10 µl II. Tiến hành thí nghiệm Trộn - Ủ 37oC/10 phút – Đo đọc kết máy III. Kết quả C U S 1817 200 6525 BÀI 6: XÉT NGHIỆM PROTEIN – BILIRUBIN TRONG MÁU ĐỊNH LỰỢNG ALBUMIN TRONG MÁU I Tiến hành thí nghiệm S U Reagent 1000 µl 1000 µl Standard 10 µl Huyết 10 µl Trộn - Ủ 37oC/10 phút – Đo đọc kết máy II Kết ĐỊNH LƯỢNG BILIRUBIN TRONG MÁU I Tiến hành thí nghiệm Bilirubin tồn phần SB Bilirubin trực tiếp U SB U R1 500µl 1000 µl 1000 µl R2 500µl 20 µl R3 1000 µl Huyết 100µl 100µl 100 µl 100 µl Lắc - Ủ 10 phút - Đo đọc kết máy II Kết TRỊ SỐ BÌNH THƯỜNG TBIL 0.2 – mg% (