Báo cáo thực hành phương pháp phân tích vi sinh

CÁC QUY TẮC AN TOÀN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT, CÁC PHƯƠNG PHÁP THU, BẢO QUẢN MẪU NƯỚC VÀ THỰC PHẨM, ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI SINH VẬT HIẾU KHÍ (TPC) BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỔ ĐĨA, ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS TỔNG SỐ BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỔ ĐĨA, ĐỊNH LƯỢNG STAPHYLOCOCCUS AUREUS BẰNG PHƯƠNG PHÁP CẤY TRANG, XÁC ĐỊNH SỰ HIỆN DIỆN CỦA E.COLI TRONG THỰC PHẨM, XÁC ĐỊNH SỰ HIỆN DIỆN CỦA SALMONELLA TRONG THỰC PHẨM

Bài 1 : CÁC QUY TẮC AN TOÀN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI

SINH VẬT

Sau khi học xong bài này học viên có thể:

- Biết được các quy tắc an toàn khi làm việc với vi sinh vật

- Đảm bảo an toàn của bản thân và mọi người xung quanh làm việc với vi sinh vậtđặc biệt là nhóm vi khuẩn gây bệnh

Thao tác an toàn là yêu cầu cực kỳ quan trọng trong kiểm nghiệm vi sinh vật Khilàm việc với vi sinh vật, chúng ta thường thao tác với số lượng rất lớn và đậm đặc tếbào vi sinh vật ( ở mức 109 tế bào/ml) Nhiều chủng vi sinh vật là tác nhân gây bệnhnên cần luôn luôn cẩn thận với tất cả các chủng đang thao tác Mặt khác, nhân viênkiểm nghiệm cũng phải sử dụng nhiều loại hóa chất, trong đó có các acid hoặc nhữnghóa chất có độc tính Do vậy, cần tuân thủ một số quy tắc an toàn để đảm bảo an toàncho bản thân và cho những người khác trong phòng thí nghiệm như sau:

- Nắm vững nguyên tắc, phương pháp làm việc với vi sinh vật

- Không ăn uống, hút thuốc trong phòng kiểm nghiệm Mang khẩu trang khi thao tácvới vi sinh vật

- Mặc áo blouse trong thời gian làm việc

- Trước khi bắt đầu làm cần xác trùng mặt bàn bằng giấy lau tẩm cồn 700 hoặc dungdịch chất diệt khuẩn khác ( Lysol 5%, amphyl 10%, chlorox 10%), để khô Thựchiện tương tự cho hai tay Chú ý chưa đốt đèn cồn khi tay chưa khô cồn Lặp lạiviệc sát trùng này sau khi hoàn thành công việc

- Cần ghi chú tên chủng, ngày tháng thí nghiệm lên tất cả các đĩa petri, ống nghiệmmôi trường, bình nuôi cấy

- Khi lỡ tay làm đổ, nhiễm vi sinh vật ra ngoài nơi làm việc, dùng khăn giấy tẩm chấtdiệt khuẩn lau kỹ, sau đó thực hiện khử trùng lại làm việc

- Cẩn thận khi thao tác với đèn cồn Tắt ngọn lửa khi chưa có nhu cầu sử dụng hoặcngay sau khi thực hiện xong mỗi hoàn tác Lưu ý tránh đưa tay, tóc qua ngọn lửa.Cần có cách bảo vệ tóc thích hợp trường hợp tóc dài

- Sử dụng quả bóp cao su khi thao tác ống hút định lượng (pipette), không hútbằngmiệng

- Khi làm vỡ dụng cụ thủy tinh, cẩn thận mang găng tay thu gom tất cả mảnh vỡ vàomột túi rác riêng.

- Tách riêng chất thải rắn và chất thải lỏng

- Tất cả chất thải rắn, môi trường chứa hoặc nhiễm vi sinh vật cần được hấp khửtrùng trước khi thải bỏ vào các bãi rác Các dụng cụ, bình chứa nhiễm vi sinh vậtcần được ngâm vào dung dịch chất diệt khuẩn ( nước javel) trước khi rữa và tái sửdụng

- Cần gói hoặc ràng bằng băng keo khi đặt chồng các đĩa peptri lên nhau

- Không mở đĩa petri và dùng mũi ngửi để tránh nhiễm vi sinh vật, cần đặt vònghoặc đầu que cấy vào chân ngọn lửa để tránh sự văng nhiễm vi sinh vật vào khôngkhí

- Sát trùng và rửa tay sạch sẽ trước khi rời phòng thí nghiệm

Bài 2 : CÁC PHƯƠNG PHÁP THU, BẢO QUẢN MẪU NƯỚC VÀ THỰC

PHẨM

1 MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU :

- Công đoạn lấy, vận chuyển và bảo quản mẫu là công đoạn rất quan trọng.Mọi sai sót trong công đoạn này ( lượng mẫu không đủ, mẫu bị nhiễm bẩn từbên ngoài, nhiễm bẩn từ dụng cụ, mẫu bị biến đổi do các tác nhân lý, hoá,sinh học…) đều có thể dẫn tới sai lệch nghiêm trọng kết quả thử nghiệm

- Việc lấy mẫu cần phải đảm bảo hai điều kiện :

Mẫu lấy phải đại diện được cho lô hàng hoặc nơi lấy mẫu ( khi kiện tra vệsinh công nghiệp) và nhận dạng được rõ ràng

Hàm lượng các chất hay các vi sinh vật cần xác địng không được biến đổi kểtừ khi lấy mẫu đến khi phân tích

2 THU VÀ BẢO QUẢN MẪU NƯỚC :

1 Thu mẫu : dựa theo tiêu chí là mẫu phải đại diện ở mức cao nhất của nước cần

phân thể tích

2 Dụng cụ lấy mẫu : các dụng cụ phải được súc rửa cẩn thận, tráng lại lần cuối cùng

bằng nước cất và khử trùng trước khi sử dụng Có thể sử dụng túi nhựa vô trùng đểlấy mẫu

3 Quy trình lấy mẫu :

- Lấy mẫu từ các nguồn sông, suối, hồ : cầm chai ở vị trí gần đáy, đưa cổ chailên hướng xuống dưới và đưa sâu vào dưới mặt nước Xoay nhẹ để cổ chaihơi nghiêng lên bề mặt nước và miệng chai hướng về phía dòng chảy Trongtrường hợp không có dòng chảy thì phải tạo dòng chảy nhân tạo bằng cáchxoay chai theo hướng nằm ngang và đẩy chai theo hướng miệng chai Nếu lấymẫu khi đi trên thuyền phải lấy mẫu trước mũi thuyền Có thể buộc một vậtnặng vào đáy chai rồi từ từ đưa nước vào trong Trong tất cả trường hợp tránhkhông cho dụng cụ lấy mẫu tiếp xúc với bờ hay đấy của suối hay bồn chứa

- Lấy mẫu từ vòi của hệ thống cấp nước dịch vụ, chọn những vòi cấp nước trựctiếp từ các đường ống chính Mở vòi thật lớn, để chảy khoảng 2 – 3 phút sau

đó giảm vòi để lấy vào dụng cụ chứa mẫu

- Lấy nước từ các giếng bơm tay : bơm nước khoảng 5 phút để rửa sạch vòi,mẫu được lấy trực tiếp bằng cách buộc vật nặng vào chai lấy mẫu Phải tránh

sự nhiễm bẩn từ vật nặng hoặc thành giếng

- Lấy mẫu nước uống : lấy ở giai đoạn cuối của quá trình sản xuất

- Thể tích mẫu phải đủ để phân tích, không được nhỏ hơn 100ml Mẫu sau khilấy phải ghi đầy đủ và chính xác về ký hiệu và các dữ liệu được mô tả

4 Bảo quản và vận chuyển :

- Nhiệt độ bảo quản mẫu nước là dưới 10°C và thời gian vận chuyển không quá6h Bảo quản trong các tủ lạnh ở phòng thí nghiệm cũng không quá 2h.Không chấp nhận gửi mẫu phân tích bằng đường bưu điện và không được bảoquản theo đúng yêu cầu

3 THU VÀ BẢO QUẢN MẪU THỰC PHẨM :

1 Lấy mẫu theo lô hàng :

Thông thường vị trí lấy mẫu như sau: lô hàng  mẫu chung  mẫu trungbình  mẫu phân tích( cảm quan, kháng sinh, vi sinh)

2 Lấy mẫu theo dây chuyền sản xuất :

Khi tiến hành thu mẫu thì ở công đoạn nguyên liệu và thành phẩm là bắt buộc,trong khi đó giai đoạn bán thành phẩm thì tuỳ từng loại mặt hàng sản phẩm mà sẽ cócác công đoạn khác nhau và số lượng công đoạn cũng nhiều ít khác nhau Không thểthu hết tất cả các công đoạn ở giai đoạn bán thành phẩm mà chỉ thu ở 2 công đoạn liêntiếp trong một lần thu mẫu

3 Thu mẫu vệ sinh công nghiệp :

Là thu mẫu trong quá trình sản xuất chế biến của công nhân, các dụng cụ sản xuấtcũng như vệ sinh, đồ bảo hộ lao động của công nhân như găng tay, yếm, ủng, … cácmáy móc trực tiếp sản xuất nhằm xác định có sự lây nhiễm hay không

4 Thu mẫu ở cửa hàng hoặc chợ :

Chủ yếu dựa vào kinh nghiệm và sự quan sát của người thu mẫu Khi thu mẫu cầnmang tính đại diện và đảm bảo không bị tạp nhiễm

5 Dụng cụ lấy mẫu

Thường là thùng nhựa, sử dụng bao nylon để chứa mẫu Không dùng các bình thuỷtinh vì dễ vỡ làm nhiễm mẫu hay gây tai nạn cho người thu mẫu Các dụng cụ thu mẫunhư dao, kéo, … đã được khử trùng.

6 Bảo quản và vận chuyển :

- Các mẫu sau khi được lấy bảo quản tách biệt nhau trong thùng chứa mẫu,được giữ lạnh bằng các bao nước đá Tại phòng kiểm nghiệm , mẫu đượcchuyển tủ đông và được phân tích ngay trong thời gian có thể

- Nếu không phân tích ngay được, mẫu phải được bảo quản ở -20°C cho đếnkhi phân tích Nếu mẫu không thể bảo quản đông, có thể bảo quản ở 4°Cnhưng không quá 36h Các loại đồ hợp, thực phẩm có độ ẩm thấp hay khó hư

có thể bảo quản ở nhiệt độ phòng

7 Chuẩn bị mẫu thực phẩm :

- Rã đông trong điều kiện vô trùng, nhiệt độ có thể là 2 – 5°C trong 18h, nếucần nhanh có thể ở nhiệt độ phòng trong 2h hoặc 45°C trong 15p

- Cân một lượng mẫu xác định để phân tích tuỳ theo từng chỉ tiêu yêu cầu, sai

số cho phép là ± 0,1g Lượng mẫu phân tích cho vào các bình chứ bằng nhựahoặc bao nylon vô trùng

- Sau khi cân mẫu và cho dung dịch pha loãng vào mẫu, tiến hành đồng nhấtmẫu để đảm bảo sự phân phối của vi sinh vật vào dịch pha loãng thật đồngđều

4 CÂU HỎI ÔN TẬP

Câu 1:

Lấy mẫu từ các nguồn sông, suối, hồ : cầm chai ở vị trí gần đáy, đưa cổchai lên hướng xuống dưới và đưa sâu vào dưới mặt nước Xoay nhẹ để cổ chaihơi nghiêng lên bề mặt nước và miệng chai hướng về phía dòng chảy Trongtrường hợp không có dòng chảy thì phải tạo dòng chảy nhân tạo bằng cách xoaychai theo hướng nằm ngang và đẩy chai theo hướng miệng chai Nếu lấy mẫu khi

đi trên thuyền phải lấy mẫu trước mũi thuyền Có thể buộc một vật nặng vào đáychai rồi từ từ đưa nước vào trong Trong tất cả trường hợp tránh không cho dụng

cụ lấy mẫu tiếp xúc với bờ hay đấy của suối hay bồn chứa

Lấy mẫu theo dây chuyền sản xuất :

Khi tiến hành thu mẫu thì ở công đoạn nguyên liệu và thành phẩm là bắtbuộc, trong khi đó giai đoạn bán thành phẩm thì tuỳ từng loại mặt hàng sản phẩm

mà sẽ có các công đoạn khác nhau và số lượng công đoạn cũng nhiều ít khácnhau Không thể thu hết tất cả các công đoạn ở giai đoạn bán thành phẩm mà chỉthu ở 2 công đoạn liên tiếp trong một lần thu mẫu

Câu 3:

- Rã đông trong điều kiện vô trùng, nhiệt độ có thể là 2 – 5°C trong 18h, nếucần nhanh có thể ở nhiệt độ phòng trong 2h hoặc 45°C trong 15p

- Cân một lượng mẫu xác định để phân tích tuỳ theo từng chỉ tiêu yêu cầu, sai

số cho phép là ± 0,1g Lượng mẫu phân tích cho vào các bình chứ bằng nhựahoặc bao nylon vô trùng

- Sau khi cân mẫu và cho dung dịch pha loãng vào mẫu, tiến hành đồng nhấtmẫu để đảm bảo sự phân phối của vi sinh vật vào dịch pha loãng thật đồngđều

Bài 3: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI SINH VẬT HIẾU KHÍ (TPC) BẰNG

1.2 Nguyên tắc (TCVN:5165-90)

Sử dụng kỹ thuật đỗ đĩa, đếm khuẩn lạc trên môi trường thạch sau khi ủ trongđiều kiện hiếu khí ở 300/72h ± 6h Số lượng vi khuẩn hiếu khí trong 1g hoặc 1ml mẫuthực phẩm kiểm nghiệm được tính theo số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa nuôi cấytheo các nồng độ pha loãng

2 Môi trường và dụng cụ

2.1 Môi trường sử dụng

- Môi trường pha loãng mẫu: Saline Pepton Water (SPW) hoặc Buffer PeptonWater (BPW)

- Môi trường nuôi cấy: Plate Count Agar (PCA)

2.2 Dụng cụ

- Đĩa petri

- Ống nghiệm

- Tủ ấm 300C

3 Quy trình phân tích

25g mẫu +225ml BPW  đồng nhất trong 30s  độ pha loãng 10-1

Pha loãng trong nước muối sinh lý  độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4

Từ mỗi độ pha loãng hút 1ml cho vào 2 đĩa petri vô trùng Sau đó đổ môitrường PCA

đã được làm nguội đến 45oC

Lắc đều và chờ đĩa thạch nguội  úp ngược  đem ủ ở nhiệt độ 30oC/72h

Đọc kết quả từ 25-250 khuẩn lạc

n1V1f1+…+n i V i f i(cfu/ g)

4 Thuyết minh quy trình

4.1 Chuẩn bị mẫu

Cân chính xác 10g ( hoặc 25g) mẫu cho vào bao PE vô trùng, sau đó thêmvào 90ml ( hoặc 225ml) dung dịch pha loãng mẫu Tiến hành đồng nhất mẫubằng máy dập mẫu (stomacher) Thời gian dập mẫu tùy thuộc vào từng loại mẫunhưng không quá 2,5 phút Tất cả thao tác trên phải thực hiện trong điều kiện vôtrùng Khi đó, ta sẽ có được dung dịch pha loãng là 10-1

Dịch pha loãng sẽ được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùng micropipette(pipetman) vô trùng chuyển 1ml vào ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pha loãng →đồng nhất, ta sẽ có được dịch pha loãng 10-2 Tiếp tục thực hiện tương tự để có đượccác độ pha loãng cần thiết

4.2 Đổ đĩa

Chọn 2 hay 3 độpha loãng liên tiếp dự kiến chứa 25-250 tế bào vi sinh vật.Dùng micropipette với các đầu tip vô trùng để chuyển 1ml dịch pha loãng vào giữa đĩapetri vô trùng Tương ứng với mỗi độ pha loãng cấy từ 2-3 đĩa Saukhi cấy, đổ vào mỗiđĩa 10-15 ml môi trường PCA đã nấu chảy và để nguội đến 45-50 0C Trộn đều mẫuvào môitrường bằng cách xoay tròn đĩa petri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ từ 3-5lần Đặt đĩa lên mặt phẳng ngang cho thạch đông đặc

A(CFU / g)= N

n1V1f1+…+ n i V i f i

Trong đó : A: số tế bào vi khuẩn ( khuẩn lạc) trong 1g mẫu

N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọnn: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i

V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào môi trườngf: độ pha loãng tương ứng

- Nguồn mẫu phân tích

 Tên mẫu: Pate (gan heo)

 Địa điểm thu: Xe bán bánh mì trước cổng trường Hutech (Cô Lan 475A/ĐiệnBiên Phủ, P.25, Bình Thạnh)

 Thời gian thu: 7h30 Ngày 29/03/2017

 Cảm quan: màu sắc nâu đặc trưng, mùi đặc trưng, kết cấu đẹp

5 CÂU HỎI ÔN TẬP

Câu 1:VSV hiếu khí là những VSV tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều

kiện có sự hiện diện của oxy phân tử Tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong mẫuchỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm

Câu 2:

 Chuẩn bị mẫu:

- Cân chính xác 10g ( hoặc 25g) mẫu cho vào bao PE vô trùng, sau đó thêmvào 90ml ( hoặc 225ml) dung dịch pha loãng mẫu Tiến hành đồng nhất mẫubằng máy dập mẫu (stomacher) Thời gian dập mẫu tùy thuộc vào từng loạimẫu nhưng không quá 2,5 phút Tất cả thao tác trên phải thực hiện trong điềukiện vô trùng Khi đó, ta sẽ có được dung dịch pha loãng là 10-1

- Dịch pha loãng sẽ được pha loãng theo dãy thập phân bằng cách dùngmicropipette (pipetman) vô trùng chuyển 1ml vào ống nghiệm chứa 9ml dungdịch pha loãng → đồng nhất, ta sẽ có được dịch pha loãng 10-2 Tiếp tục thựchiện tương tự để có được các độ pha loãng cần thiết

Đổ đĩa

- Chọn 2 hay 3 độ pha loãng liên tiếp dự kiến chứa 25-250 tế bào vi sinh vật.Dùng micropipette với các đầu tip vô trùng để chuyển 1ml dịch pha loãng vàogiữa đĩa petri vô trùng Tương ứng với mỗi độ pha loãng cấy từ 2-3 đĩa.Saukhi cấy, đổ vào mỗi đĩa 10-15 ml môi trường PCA đã nấu chảy và đểnguội đến 45-50 0C Trộn đều mẫu vào môitrường bằng cách xoay tròn đĩapetri xuôi và ngược chiều kim đồng hồ từ 3-5 lần Đặt đĩa lên mặt phẳngngang cho thạch đông đặc

Ủ: Các đĩa lật ngược lại và nuôi ủ ở nhiệt độ 300C trong 72 giờ

N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọnn: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i

V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào môi trường

f: độ pha loãng tương ứng

BÀI 4: ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS TỔNG SỐ BẰNG PHƯƠNG PHÁP

4.1.2 Nguyên tắc

- Mẫu đã được đồng nhất được cấy một lượng nhất định lên môi trường thạchchọn lọc thích hợp chứa lactose Sau khi ủ 37°C/48 giờ, đếm số lượng khuẩnlạc coliforms điển hình

- Khẳng định các khuẩn lạc đặc trưng bằng môi trường chứa lactose, nhưBGBL để đánh giá khả năng sinh hơi

- Tính toán số lượng coliform trong 1g mẫu

4.2 MÔI TRƯỜNG VÀ DỤNG CỤ

4.2.1 Môi trường sử dụng

- Môi trường Tryptone Soya Agar (TSA)

- Violet Red Bile Agar (VRB)

- Brillant Green Bile Lactose broth (BGBL)

- Cho vào mỗi đĩa đã cấy mẫu 5ml TSA, để 15-30 phút ở nhiệt độ phòng đểphục hồi khả năng của coliforms Đổ thêm 10-15ml VRB Lật ngược đĩa và ủ37°C/24h

4.4.3 Đọc và tính kết quả

- Chọn các đĩa có 10-100 khuẩn lạc coliforms để tính Khuẩn lạc Coliforms cómàu đỏ đậm, đường kính >0.5mm, xung quanh khuẩn lạc có quầng tủa muốimật

N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọnn: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i

V: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào môi trườngR: Tỉ lệ xác nhận ( lúc làm khẳng định) = Số ống BGBLdương Tổng số ống BGBL

4.4.5 Tính toán kết quả

- Nguồn mẫu phân tích

 Tên mẫu: Pate (gan heo)

 Địa điểm thu: Xe bán bánh mì trước cổng trường Hutech (Cô Lan 475A/ĐiệnBiên Phủ, P.25, Bình Thạnh)

 Thời gian thu: 7h30 Ngày 29/03/2017

 Cảm quan: màu sắc hơi nhạt, mùi đặc trưng, kết cấu đẹp

- Chỉ tiêu Coliform

Nồng độ pha loãng 10 -3 Số ống BGBL dương

tính (+)

5

Hình 2.Coliforms trên môi trường TSA + VRB

Hình 3.Coliform trên môi trường BGBL

- Nguồn mẫu phân tích

 Tên mẫu: Nước mía (Máy ép cổ truyền)

 Địa điểm thu: Cổng trường Hutech, đường Điện Biên Phủ, phường 25, quận BìnhThạnh ( Trước Quán Avatar )

 Thời gian thu: 7h20 ngày 05/03/2017

Số ống dương tính trên môi Số ống dương tính trên môi

Hình 4.Số ống âm tính trên môi trường LSB ủ ở 37 o C/24 h

Kết luận: Không phát hiện Coliform

5 CÂU HỎI ÔN TẬP

Câu 1:

Coliforms là những trực khuẩn, gram âm, không sinh bào tử, kỵ khí tùy nghi, cókhả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở nhiệt độ 37°C trong vòng 24-48h Nhóm coliforms hiện diện khắp nơi trong tự nhiên, trong ruột người vàđộng vật Coliforms được xem là nhóm vsv chỉ thị an toàn: số lượng hiện diệncủa chúng trong thực phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉthị khả năng hiện diện của các vsv gây bệnh khác

Câu 2:

Trong quá trình xử lý mẫu, vi sinh vật bị thương suy yếu, mà điều kiện VSVnuôi cấy phải hoàn toàn khỏe mạnh Do đó, khi tiến hành phân tích Coliform phải đổmôi trường 2 lớp TSA và VRB, TSA trong môi trường có vai trò phục hồi VSV, sau

đó tiếp tục sử dụng VRB để chọn lọc vsv: ức chế các vi khuẩn gram (+)

Câu 3:

 Chuẩn bị: Quá trình chuẩn bị mẫu tương tự như phần định lượng tổng số vsv hiếukhí Nhưng quá trình pha loãng mẫu sao cho trong 1ml dd pha loãng mẫu chứa khoảng

<100 khuẩn lạc

 Cấy mẫu:

- Cấy chuyển 1ml dd pha loãng mẫu đã chọn vào đĩa petri, mỗi nồng độ cấy ítnhát vào 2 đĩa và chọn 2 nồng độ pha loãng liên tiếp để cấy sao cho sau khimỗi đĩa xuất hiện 10-100 khuẩn lạc

- Cho vào mỗi đĩa đã cấy mẫu 5ml TSA, để 15-30 phút ở nhiệt độ phòng đểphục hồi khả năng của coliforms Đổ thêm 10-15ml VRB Lật ngược đĩa và ủ37°C/24h

 Đọc và tính kết quả: Chọn các đĩa có 10-100 khuẩn lạc coliforms để tính Khuẩnlạc Coliforms có màu đỏ đậm, đường kính >0.5mm, xung quanh khuẩn lạc có quầngtủa muối mật

Khẳng định: Chọn 5 khuẩn lạc cấy sang môi trườmg BGBL và ủ 37°C/24h Phảnứng dương tính khi có hiện tương đục và sinh hơi trong ống Durmham