I. THỤ TINH NHÂN TẠOThụ tinh nhân tạo là một chuỗi nhiều kỹ thuật bao gồm việc lấy tinh con đực, đánh giá chất lượng tinh dịch, pha loãng và tồn trữ tinh dịch, và dẫn tinh (đưa tinh dịch con đực vào đường sinh dục con cái).Lợi ích của thụ tinh nhân tạo là cho phép khai thác tốt nhất thú đực giống và có thể tiến hành đồng thời ở nhiều cơ sở nhân giống. Ngoài ra có thể khắc phục tình trạng chênh lệch về thể trọng giữa các thú đựccái, sự khác biệt về sinh lý, tập tính giữa các giống và tránh được các bệnh lây lan qua đường sinh dục.Một bò đực có thể thụ tinh cho 10.000 bò cái trong 12 tuần của mùa sinh sản và trên lý thuyết, có thể cho đến 500.000 bò con trong suốt cuộc đời nó.II. THỤ TINH IN VITROThụ tinh in vitro: là một kĩ thuật mới của công nghệ sinh học hiện đại nhằm kết hợp giữa trứng và tinh trùng trong phòng thí nghiệm để thu nhận hợp tử là mầm mống của cơ thể mới.Thu tinh in vitro được tiến hành đầu tiên trên thỏ (Daizien và Niwa, 1971), sau đó trên bò (Iritani và Niwa, 1978), trên lợn (Iritani và cộng sự, 1978) và trên dê (Kim và Iritani, 1981). Năm 1982, con bê đầu tiên sinh ra từ thụ tinh in vitro (Hanada, 1982).Từ năm 1985 trở lại đây, thụ tinh in vitro đã được áp dụng rộng rãi trong chăn nuôi bò ở nhiều nước như Anh, Mỹ, Nhật, Iseland.Quá trình kỹ thuật công nghệ thụ tinh in vitro bao gồm những công đoạn sau : Tập hợp tế bào trứng. Nuôi trứng phát triển và chín. Hoạt hóa tinh trùng. Thụ tinh đưa tinh trùng kết hợp với trứng. Nuôi hợp tử in vitro cho phát triển đến giai đoạn phôi dâu (Morula) và phôi nang (blastocyst). Cấy truyền những phôi này vào vật nhận. Đánh giá kết quả.Trong quá trình thụ tinh in vitro cần lưu ý mấy vấn đề sau : Hoạt hóa tinh trùng: Tinh trùng sẽ không có khả năng thụ tinh nếu không được hoạt hóa trong đường sinh dục của con cái. Trong quá trình này nó phải được trải qua những thay đổi về sinh lý trước khi xâm nhập qua màng trong suốt để kết hợp với nhân của tế bào trứng, do vậy để tiến hành thụ tinh in vitro thành công phải có kiến thức sâu sắc về hoạt hóa tinh trùng và phản ứng của acrosome. Hầu hết các thí nghiệm thụ tinh in vitro trước đây đã không thu được kết quả vì chưa có kinh nghiệm và kĩ thuật hoạt hóa tinh trùng để nó có khả năng thụ tinh với tế bào trứng. Cơ chế phân tử của quá trình hoạt hóa tinh trùng cho đến nay vẫn chưa được hoàn toàn sáng tỏ. Có giả thuyết cho rằng màng tế bào tinh trùng chưa hoạt hóa rất vững chắc để bảo vệ tinh trùng chống lại những ảnh hưởng bất lợi trong đường sinh dục cái, còn tinh trùng đã hoạt hóa thì tính bền vững của màng ngược lại. Một giả thuyết khác lại cho rằng hoạt hóa tinh trùng là quá trình xóa bỏ enzym ức chế với chromosome. Cũng có giả thuyết lại cho rằng hoạt hóa tinh trùng là một quá trình giải phóng yếu tố ức chế hoạt hóa, yếu tố này được hình thành ở phụ dịch hoàn và các tuyến sinh dục phụ của con đực và phủ xung quanh màng tinh trùng. Tinh trùng đã hoạt hóa có thể thu nhận ở đường sinh dục của con cái sau khi phối giống. Một phương pháp phổ biến thường được sử dụng để thu nhận tinh trùng đã hoạt hóa là bơm môi trường thích hợp để rửa tử cung và thu nhận tinh trùng đã hoạt hóa trôi theo. Ở ống dẫn trứng cũng chứa tinh trùng đã hoạt hóa.Ở một số loài, quá trình hoạt hóa tinh trùng có thể tiến hành trong phòng thí nghiệm nhưng về cơ chế và thời gian có thể khác so với hoạt hóa tinh trùng trong đường sinh dục con cái. Môi trường có hàm lượng ion cao có thể thúc đẩy và tăng cường hoạt hóa tinh trùng trong ống nghiệm. Tóm lại, để hoạt hóa tinh trùng có thể thực hiện trong đường sinh dục con cái hay trong ống nghiệm với môi trường nuôi cấy thích hợp. Chuẩn bị tế bào trứng và tiến hành thụ tinh in vitro.Để thu thập tế bào trứng dùng cho thụ tinh in vitro người ta thường tách từ ống dẫn trứng sau khi trứng rụng hay từ các nang trứng của buồng trứng bằng phương pháp nội soi, bằng giải phẫu hay nhờ thu thập buồng trứng từ các lò mổ.Mặc dầu tinh trùng có khả năng xâm nhập vào cả tế bào trứng chưa thành thục đến trứng sau khi đã rụng một ngày, nhưng trứng chỉ được thụ tinh và phát triển bình thường ở giai đoạn nhất định, ví dụ đối với bò là 20 24 giờ sau khi rụng.Trong thụ tinh, tinh trùng nhanh chóng bao vây tế bào trứng nhưng chỉ có một tinh trùng có khả năng xâm nhập vào tế bào trứng để thụ tinh. Quá trình tinh trùng đi qua màng trong suốt của trứng rất nhanh và để lại dấu vết có thể còn thấy được sau ít giờ nhờ hiển vi điện tử.Trong quá trình thụ tinh, tinh trùng trải qua một giai đoạn biến đổi cùng với trứng như: màng đầu tinh trùng tiêu biến, hình thành thể cực sơ cấp trong nhân… Các yếu tố cần thiết cho thụ tinh in vitro đạt kết quả là sự thành thục của nhân và bào chất của các tế bào sinh dục, khả năng thụ tinh của các tế bào sinh dục, số lượng tinh trùng, hoạt lực và khả năng thụ tinh tốt.Những lợi ích của thụ tinh in vitro:
Chương 6: Ứng dụng công nghệ sinh học công tác giống vật nuôi CHƯƠNG VI: ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG CÔNG TÁC GIỐNG VẬT NUÔI I THỤ TINH NHÂN TẠO Thụ tinh nhân tạo chuỗi nhiều kỹ thuật bao gồm việc lấy tinh đực, đánh giá chất lượng tinh dịch, pha loãng tồn trữ tinh dịch, dẫn tinh (đưa tinh dịch đực vào đường sinh dục cái) Lợi ích thụ tinh nhân tạo cho phép khai thác tốt thú đực giống tiến hành đồng thời nhiều sở nhân giống Ngoài khắc phục tình trạng chênh lệch thể trọng thú đực-cái, khác biệt sinh lý, tập tính giống tránh bệnh lây lan qua đường sinh dục Một bò đực thụ tinh cho 10.000 bò 12 tuần mùa sinh sản lý thuyết, 500.000 bò suốt đời II THỤ TINH IN VITRO Thụ tinh in vitro: kĩ thuật công nghệ sinh học đại nhằm kết hợp trứng tinh trùng phòng thí nghiệm để thu nhận hợp tử mầm mống thể Thu tinh in vitro tiến hành thỏ (Daizien Niwa, 1971), sau bò (Iritani Niwa, 1978), lợn (Iritani cộng sự, 1978) dê (Kim Iritani, 1981) Năm 1982, bê sinh từ thụ tinh in vitro (Hanada, 1982) Từ năm 1985 trở lại đây, thụ tinh in vitro áp dụng rộng rãi chăn nuôi bò nhiều nước Anh, Mỹ, Nhật, Iseland Quá trình kỹ thuật công nghệ thụ tinh in vitro bao gồm công đoạn sau : - Tập hợp tế bào trứng - Nuôi trứng phát triển chín - Hoạt hóa tinh trùng - Thụ tinh đưa tinh trùng kết hợp với trứng - Nuôi hợp tử in vitro cho phát triển đến giai đoạn phôi dâu (Morula) phôi nang (blastocyst) - Cấy truyền phôi vào vật nhận - Đánh giá kết Trong trình thụ tinh in vitro cần lưu ý vấn đề sau : - Hoạt hóa tinh trùng: Tinh trùng khả thụ tinh không hoạt hóa đường sinh dục Trong trình phải trải qua thay đổi sinh lý trước xâm nhập qua màng suốt để kết hợp với nhân tế bào trứng, để tiến hành thụ tinh in vitro thành công phải có kiến thức sâu sắc hoạt hóa tinh trùng phản ứng acrosome Hầu hết thí nghiệm thụ tinh in vitro trước không thu kết chưa có kinh nghiệm kĩ thuật hoạt hóa tinh trùng để có khả thụ tinh với tế bào trứng Cơ chế phân tử trình hoạt hóa tinh trùng chưa hoàn toàn sáng tỏ Có giả thuyết cho màng tế bào tinh trùng chưa hoạt hóa vững để bảo vệ tinh trùng chống lại ảnh hưởng bất lợi đường sinh dục cái, tinh trùng hoạt hóa tính bền vững màng ngược lại Một giả thuyết khác lại cho hoạt hóa tinh trùng trình xóa bỏ enzym ức chế với chromosome Cũng có giả thuyết lại cho hoạt hóa tinh trùng trình giải phóng yếu tố ức chế hoạt hóa, yếu tố hình thành phụ dịch hoàn tuyến sinh dục phụ đực phủ xung quanh màng tinh trùng Tinh trùng hoạt hóa thu nhận đường sinh dục sau phối giống Một phương pháp phổ biến thường sử dụng để thu nhận tinh trùng hoạt hóa bơm môi trường thích hợp để rửa tử cung thu nhận tinh trùng hoạt hóa trôi theo Ở ống dẫn trứng chứa tinh trùng hoạt hóa Ở số loài, trình hoạt hóa tinh trùng tiến hành phòng thí nghiệm chế thời gian khác so với hoạt hóa tinh trùng đường sinh dục Môi trường có hàm lượng ion cao thúc đẩy tăng cường hoạt hóa tinh trùng ống nghiệm Tóm lại, để hoạt hóa tinh trùng thực đường sinh dục hay ống nghiệm với môi trường nuôi cấy thích hợp - Chuẩn bị tế bào trứng tiến hành thụ tinh in vitro Để thu thập tế bào trứng dùng cho thụ tinh in vitro người ta thường tách từ ống dẫn trứng sau trứng rụng hay từ nang trứng buồng trứng phương pháp nội soi, giải phẫu hay nhờ thu thập buồng trứng từ lò mổ Mặc dầu tinh trùng có khả xâm nhập vào tế bào trứng chưa thành thục đến trứng sau rụng ngày, trứng thụ tinh phát triển bình thường giai đoạn định, ví dụ bò 20 - 24 sau rụng Trong thụ tinh, tinh trùng nhanh chóng bao vây tế bào trứng có tinh trùng có khả xâm nhập vào tế bào trứng để thụ tinh Quá trình tinh trùng qua màng suốt trứng nhanh để lại dấu vết thấy sau nhờ hiển vi điện tử Trong trình thụ tinh, tinh trùng trải qua giai đoạn biến đổi với trứng như: màng đầu tinh trùng tiêu biến, hình thành thể cực sơ cấp nhân… - Các yếu tố cần thiết cho thụ tinh in vitro đạt kết thành thục nhân bào chất tế bào sinh dục, khả thụ tinh tế bào sinh dục, số lượng tinh trùng, hoạt lực khả thụ tinh tốt Những lợi ích thụ tinh in vitro: - Khai thác tiềm sinh sản gia súc đơn thai (ví dụ bò có từ 60.000 đến 100.000 tế bào trứng) - Rút ngắn khoảng cách hệ gia súc có vòng đời dài - Xác định sớm phát huy tiềm gia súc cao sản thông qua kiểm tra đời sau - Thành lập ngân hàng gen công nghiệp hóa ngành chăn nuôi 44 III TẠO DÒNG VÔ TÍNH Như biết, sinh sản vô tính sinh sản không kèm theo tái tổ hợp di truyền, nguyên hệ gen cá thể sở nguyên phân Từ xa xưa, người biết cách giâm cành Đó sinh sản sinh dưỡng vô tính loại Tập hợp xuất xứ từ gọi clone (dòng vô tính), cloning tạo clone sinh sản kiểu cloning tạo tập hợp cá thể đồng di truyền Thuật ngữ clone ngày dùng để tập hợp cá thể (từ trở lên) có xuất xứ từ cá thể ban đầu qua sinh sản vô tính Như vậy, sinh sản vô tính, từ thể ban đầu tách hay nhiều phần mà phần phát triển thành thể Phần tách phần thể, quan, nhóm tế bào, chí tế bào Hiện phát triển số kĩ thuật nhằm tạo dòng vô tính vật nuôi 3.1 Chia tách phôi (Embryo splitting) Mục tiêu kĩ thuật làm tăng số lượng phôi từ phôi ban đầu cuối tạo nên dòng vô tính Những phôi dùng để chia tách giai đoạn - ngày sau thụ tinh (đối với bò) Nhìn chung, kết chi tách phôi tốt sử dụng phôi giai đoạn cuối phôi dâu hay đầu phôi nang khối tế bào đủ lớn tế bào chưa biệt hóa Nếu chia tách phôi giai đoạn phôi dâu việc chia khối mầm phôi thành hai phần Nếu chia tách giai đoạn phôi nang việc tách nội phôi bì, phần ngoại phôi bì (lá nuôi phôi) phải tách hai Nếu chia tách phôi giai đoạn muộn hơn, lúc tế bào biệt hóa tỉ lệ tạo nên thể toàn vẹn thấp Để thực kĩ thuật chia cắt phôi phải có dung dịch nuôi, kính hiển vi soi nổi, với độ phóng đại 200 - 300 lần, thiết bị vi thao tác điều khiển dao cắt… Qui trình chia cắt phôi bao gồm bước chủ yếu sau đây: - Lắp hệ thống thiết bị vi thao tác vào kính hiển vi, dao cắt đặt thẳng góc với đáy đĩa petri chứa phôi - Đưa phôi vào đĩa petri có 200 - 300ml dung dịch nuôi cấy, đợi - phút cho phôi lắng xuống đáy đĩa - Sau phôi cố định, nhìn kính hiển vi độ phóng đại nhỏ, di chuyển dao cắt xuống gần phôi tăng độ phóng đại kính lên - Cho lưỡi dao thấp xuống đặt vào khối tế bào phôi, phôi nang phải đặt lưỡi dao cân đối để chia nuôi phôi cho nửa - Đưa dao thấp xuống hướng tới đáy đĩa để cắt phôi thành hai Chú ý điều khiển lưỡi dao nhanh dứt khoát - Phôi sau tách phải chuyển sang dung dịch để nuôi cấy in vitro - trước cấy truyền vào vật nhận gây động dục đồng pha Cũng 45 nuôi cấy chia tách lặp lại để thu nhiều phôi chuyển vào vật nhận Bằng kĩ thuật người ta tạo bê, thỏ, dê, cừu xuất phát từ phôi ban đầu Hiện hàng năm có hàng trăm bê sinh từ phôi chia hai giới (Donahue, 1986) 3.2 Chuyển ghép nhân (Nuclear transplantation) Đây kĩ thuật đại nhằm chuyển nhân tế bào phôi sớm vào tế bào trứng tách nhân để tạo nên tế bào lưỡng bội (“hợp tử”) phát triển thành phôi Qui trình kĩ thuật bao gồm bước sau: - Tạo phôi cho nhân: để tạo phôi cho nhân người ta gây siêu noãn, thụ tinh, giội rửa lấy phôi ra, tốt giai đoạn phôi dâu 16 - 32 tế bào - Tách khối tế bào phôi dâu thành tế bào riêng rẽ - Cấy tế bào vào tế bào trứng không nhân chuẩn bị trước (có thể lấy lò mổ nuôi cấy in vitro) - Nuôi cấy in vitro tế bào trứng ghép nhân đưa vào nuôi vật nhận trung gian (thường thỏ cừu) - Sau thời gian (tùy loài) đem phôi phát triển cấy vào vật nhận gây động dục đồng pha hay đem đông lạnh nhân lên lặp lại để thu nhiều phôi Phương pháp chuyển ghép nhân tạo nên dòng vô tính thành công nhiều loài vật nuôi cừu, bò, ngựa, lợn, dê Kĩ thuật đem lại hiệu cao nhân giống, cải tiến di truyền giống vật nuôi Chẳng hạn Nicholas Smith (1983) nghiên cứu việc tạo dòng vô tính nhân giống bò sữa ước tính đạt gia tăng di truyền sản lượng sữa 15 - 25% (tương đương với kết 10 - 12 năm chọn lọc) IV CHUYỂN GEN (GENE TRANSFER) Có thể hiểu chuyển gen việc chuyển gen tái tổ hợp in vitro vào thể khác (ở hiểu cá thể vật nuôi) Từ năm 1980 mà lần đầu tiên, thực nghiệm chuyển ghép gen thành công nhờ vi tiêm ADN vào tiền nhân hợp tử chuột nhắt thông báo, phương pháp cho phép chuyển gen đô tách xây dựng (Gordon et al, 1980) Nhờ áp dụng phương pháp sinh học phân tử này, gen quan tâm cho mục đích chọn giống tách ra, giải trình tự, tái tổ hợp với thành phần điều hòa, khảo nghiệm in vitro in vivo hoạt động chúng Việc thực đầy đủ nghiên cứu chương trình nhân giống vật nuôi vừa bắt đầu dự đoán có biến cố bật tương lai 46 Đã có nhiều kĩ thuật xây dựng phép chuyển gen động vật, kĩ thuật vi tiêm ADN vào tiền nhân hợp tử áp dụng nhiều loài vật nuôi cá, thỏ, dê, cừu, lợn bò Qui trình kĩ thuật vi tiêm ADN động vật có vú bao gồm bước sau: - Tái tổ hợp tách dòng gen quan tâm - Chuẩn bị vật cho - Phát hợp tử - Làm trông thấy tiền nhân - Chuẩn bị dung dịch ADN để tiêm - Vi tiêm dung dịch ADN vào tiền nhân hợp tử - Chuyển hợp tử tiêm vào tử cung vật nhận gây động dục đồng pha - Kiểm tra vật sinh xem có gen lạ xen vào hay không Trong trình này, vật cho siêu noãn kĩ thuật tiêm kích tố sinh dục gonadotropin (theo chương trình xây dựng cho loài) thụ tinh Việc thu nhận hợp tử thực 12 - 14 sau thụ tinh qua xối nước ống dẫn trứng Li tâm phương pháp thông dụng để nhìn thấy tiền nhân… Việc xây dựng gen cần tiêm tái tổ hợp với plasmid sau tách dòng Sau tách ADN vectơ tái tổ hợp enzym giới hạn, gen nghiên cứu chiết ra, tủa rữa đưa vào buffer tiêm Tất dung dịch sử dụng trình chuẩn bị dịch để tiêm phải tuyệt đối vô trùng Dung dịch ADN gen phải không bẩn pha loãng để microlit chứa khoảng 1000 gen Thiết bị cần thiết cho vi tiêm gồm kính hiển vi, hai máy vi thao tác thiết bị tiêm Những phận bổ sung buồng tiêm, giá đỡ pipette tiêm Pipette tiêm có đường kính khoảng - 2mµ đổ đầy dung dịch ADN Trong trình tiêm, hợp tử đỡ pipette đỡ Pipette tiêm đưa vào tiền nhân qua màng tế bào màng nhân Khoảng – microlit dung dịch ADN tiêm vào tiền nhân làm cho thể tích tăng lên Những hợp tử tiêm sau nuôi cấy in vitro chuyển vào ống dẫn trứng vật nhận gây động dục đồng pha Sau vi tiêm ADN sinh ra, ADN hệ gen tách khỏi mô (máu tế bào lấy cách thích hợp từ đuôi) để xác định xem việc xen gen vào có kết hay không Sự xen gen kiểm tra kĩ thuật Southernblot 47 hay PCR Các vị trí xen gen vào nhiễm sắc thể thăm dò qua lai nhiễm sắc thể kì với việc sử dụng gen tiêm làm probe (mẫu dò) Các động vật chuyển gen nuôi giao phối với Đời cặp giao phối kiểm tra để xem có gen chuyển hay không Trong số ý chọn đồng hợp gen chuyển Chuyển gen số loài vật nuôi Trong thư mục có thông báo vi tiêm ADN vào tiền nhân hợp tử thỏ, lợn, cừu, dê, bò cá - Thỏ: sử dụng làm mô hình thực nghiệm chuyển gen Năm 1985, thông báo việc sản xuất thành công thỏ chuyển gen MT-hGH Hammer người cộng tác thực Tỉ lệ thoái hóa hợp tử thỏ việc vi tiêm ADN 10% (Ross người cộng tác, 1988) Khả phát triển thời kì tiền cấp ghép hợp tử tiêm thấp nhiều so với đối chứng - Heo: hợp tử tiêm AND, - 11% phát triển sinh heo (Hammer cộng sự, 1985) Tỉ lệ xen gen lạ heo gần 10% Gen hGH sử dụng thực nghiệm có tỉ lệ biểu 50% Đã thu heo lai F gen chuyển Đặc biệt thấy di truyền gen chuyển số heo khảo nghiệm (Hammer cộng sự, 1988) - Cừu: không cần ly tâm thấy tiền nhân hợp tử cừu 80% tiền nhân định vị kính hiển vi có độ phản quang rõ Chỉ 19% hợp tử sau vi tiêm ADN phát triển đến giai đoạn 32 tế bào Trong thực nghiệm đầu tiên, tỉ lệ xen gen lạ khoảng 1% (Hammer cộng sự, 1985; Ward cộng sự, 1986), tỉ lệ sống sót phôi tiêm 7% - Dê: có thí nghiệm thăm dò việc vi tiêm ADN vào hợp tử dê Tuy nhiên, không phát gen lạ tiêm sinh (Aumstrong cộng sự, 1987; Fabricaut cộng sự, 1987) - Bò: Lohse, Roll First (1985) vi tiêm gen Thymidine - Kinase vào hợp tử bò 24 sau tiêm khoảng 30% phôi có gen Thymidine - Kinase Roschlau cộng (1985) vi tiêm gen có nguồn gốc virút khác vào 513 hợp tử bò phát ADN lạ 14 phôi - Cá: chuyển gen vào phôi cá thực số loài (cá hồi, cá chép, cá rô Phi, cá vàng, cá ngựa, cá chạch, cá trê) Trong nhiều trường hợp, tiền nhân hợp tử nhìn rõ nên vi tiêm phải thực vào bào chất phôi sớm Một số thông báo ADN tiêm tái nhanh chóng pha sớm phát triển phôi Sự sống sót phôi tiềm tương đối tốt nhiều đạt tới tuổi thành thục Tỉ lệ chuyển gen dao động từ - 50% hay nhiều tùy loại nhân tố thực nghiệm khác Nhân giống với gia súc chuyển gen: Khi áp dụng kĩ thuật chuyển gen chương trình nhân giống gia súc, điều quan trọng gen chuyển phải di truyền tiếp cho hậu Tức là, hầu hết số tế bào phôi vật sinh chuyển gen phải chứa gen chuyển 48 Hiện biết trình sinh học phân tử xảy ADN tiêm xen vào hệ gen ví dụ, thời gian xác việc xen gen vào chưa biết kiện có ổn định tất tế bào trình phát triển phôi hay không Khi gia súc chuyển gen sinh kiểm tra, đặc biệt việc sinh đời sau, người ta thấy gặp thể khảm, tức vật, có dòng tế bào khác kiểu gen, hợp tử Các thể khảm chuyển gen gồm loại tế bào: có gen chuyển không điều khó hiểu Hiển nhiên đời sau di truyền gen chuyển từ cha mẹ gen chuyển tuyến sinh dục Từ thực nghiệm tiến hành, khoảng 30% số động vật chuyển gen thể khảm Thông thường tượng khảm hợp thấy F o Đời F1 hệ phải có gen chuyển tất tế bào xoma tế bào sinh dục Song thực tế, thấy gen chuyển di truyền qua hệ sau Lý gen chuyển không xen cách ổn định hệ sau, hay khỏi gen khó giải thích Có thể tượng xảy khả methyl hóa ADN mức khác Những khả ứng dụng chuyển gen Cho tới nay, chuyển gen làm ảnh hưởng tới tính trạng đơn gen tính trạng số gen kiểm soát Tuy nhiên, có tính trạng nhà chọn giống quan tâm đơn gen Song, sai khác tính trạng chất lượng số lượng rõ ràng tính trạng số lượng cổ điển chọn giống động vật Palmiter người cộng tác (1983) biến đổi để trở thành chất lượng qua chuyển gen kiểm soát tổng hợp Hormone sinh trưởng liên quan tới chế điều hòa feed back Hậu tương tự dự đoán nhờ áp dụng somatotropin bò sữa Hiện tại, việc nghiên cứu lĩnh vực chuyển gen gia súc tập trung vào hướng sau: - Sinh trưởng, cố gắng làm tăng sinh trưởng cấu tạo thể động vật qua việc chuyển gen kiểm soát điều hòa hormone sinh trưởng Những thực nghiệm với proteohormone tương ứng sinh trưởng động vật hiệu đạt Năm 1990, Peijung zhang người cộng tác vi tiêm gen RSV-rtGH-cADN (Rous sarcome virus, rainbon trout Growth Hormone - ADN) vào trứng thụ tinh cá chép Trong số 365 cá chuyển gen phân tích 20 có RSV-rtGH-cADN gen chúng Mặc dầu có sai khác đáng kể kích thước cá chuyển gen, song vi tiêm trung bình lớn 22% so với đối chứng Những chọn ngẫu nhiên từ phép lai đực chuyển gen không chuyển gen di truyền ADN lạ Các chuyển gen lớn nhanh so với anh chị em ruột không chuyển gen chúng Những thực nghiệm chuyển gen dự kiến làm lợn (Hammer cộng sự, 1985; Vize cộng sự, 1987) cừu (Ward cộng sự, 1986) - Sức đề kháng với bệnh Mới có gen, biết có khả ảnh hưởng tới sức đề kháng vật nuôi bệnh Mô hình cho công việc sức kháng bệnh cúm gây nên 49 gen Mx (Stacheli cộng sự, 1986) Các tác giả cố gắng để tạo lợn kháng bệnh cúm qua việc chuyển gen Mx - Cải tiến chất lượng sản phẩm Việc cải tiến chất lượng hay thành phần cấu tạo sản phẩm động vật qua việc chuyển gen tương ứng đưa triển vọng mẻ cho sản xuất chăn nuôi Mô hình Mercier (1987) đưa làm giảm lượng lactose tổ hợp với promoter đặc hiệu bầu vú, lactose tách thành galactose glucosa Sữa tiêu thụ cho tỉ lệ lớn dân số giới mắc chứng không dung nạp lactose Qua chuyển gen, nhà nghiên cứu cố gắng để làm tăng tổng hợp cystein thể động vật có vú để làm tăng sản lượng len (Ward, Mueeay Nancarron, 1986; Ward cộng sự, 1986) - Sản xuất protein làm dược phẩm sữa: Có số lý để dự đoán năm bắt đầu sử dụng gia súc chuyển gen để sản xuất số lượng lớn sữa động vật protein mà người cần cho điều trị bệnh Những nghiên cứu với gen β-Lg cừu β-Cn chuột cống gen sản xuất protein tương ứng sữa chuột nhắt, cừu, thỏ lợn chuyển gen V SỬ DỤNG CÁC LOCUT MARKER Gần đây, nhiều kĩ thuật phòng thí nghiệm phát triển để kiểm tra tượng đa hình hệ gen người động vật Những kĩ thuật bao gồm việc sử dụng lai tế bào loài (Gusella cộng sự, 1980), lai insitu (Neel cộng sự, 1982), kĩ thuật miễn dịch sử dụng kháng thể đơn dòng (Kennett cộng sự, 1980), điện di chiều gel (Goldman cộng sự, 1983), RFLP (Betstein cộng sự, 1980), vị trí vùng dễ biến đổi ADN tiểu vệ tinh (Jeffreys cộng sự, 1985), mẫu dò oligonucleotit (Kazazian, 1985), … Những kĩ thuật hứa hẹn cung cấp số lượng lớn marker di truyền đa hình để: 5.1 Kiểm tra dòng dõi: Với số lượng lớn marker đa hình sẵn có thuộc dạng nào, việc kiểm tra dòng dõi tổ tiên rõ ràng xác phương pháp hành sử dụng marker huyết miễn dịch Jeffreys cộng (1985), sử dụng vị trí biến động cao ADN tiểu vệ tinh để nhận dạng xác quan hệ tổ tiên người, kĩ thuật xác có thông tin từ bên cha mẹ Sự mở rộng kĩ thuật cho loài vật nuôi thay cho kĩ thuật 5.2 Xác nhận tồn giống cải tạo: Những tượng đa hình biết không đủ để phân biệt mặt di truyền cá thể giống vật nuôi cải tạo với giống khác Tính phổ biến số lượng lớn marker đa hình hay số lượng nhỏ marker đặc biệt cao cho phép nhận dạng cá thể tạo nên giống cách xác nhận tồn giống (Soller Bechmann, 1982) 50 5.3 Chọn lọc qua marker Nếu hiệu biết cho tất alen locut ảnh hưởng tới tính trạng kinh tế chọn lọc trực alen cho đáp ứng di truyền nhanh so với chọn lọc theo kiểu hình Khi hiệu số alen đánh giá tất locut ảnh hưởng tới tính trạng phát việc đưa thông tin alen phát vào số chọn lọc cải tiến đáp ứng chọn lọc Trong thực tế, locut ảnh hưởng trực tiếp tới tính trạng kinh tế (thường gọi locut tính trạng số lượng, QTL) phát Tuy nhiên, QTL không phát locut marker liên kết chặt chẽ với chúng có lợi cách tương tự Sự liên kết marker với QTL phát nhờ sai khác alen locut marker biểu kiểu hình tính trạng quan tâm gây nên QTL liên kết, không phát cách trực tiếp Do hiệu locut riêng rẽ tham gia vào tính trạng số lượng nhỏ hay trung bình nên phải đòi hỏi số lượng lớn gia đình đánh giá xác hiệu cách hợp lí Một số lượng lớn marker đa hình cần để bao phủ hệ gen (Kashi cộng sự, 1986; Smith Simpson, 1986;…) Ví dụ: Kashi cộng (1986) sử dụng chọn lọc gen marker bò sữa ước tính cần khoảng 125 marker đa hình 1000 cái/1 đực giống Lúc đầu, – 20 đực giống sàng lọc phát liên kết quan trọng với QTL Sau đó, locut có liên kết quan trọng ghi nhận cho trình chọn lọc qua marker VI SIÊU BÀI NOÃN VÀ CẤY TRUYỀN PHÔI (Multiple Ovulation and Embryo Transfer, MOET) Siêu noãn cấy truyền phôi bao gồm giai đoạn chủ yếu sau : 6.1 Chọn thú cho phôi Nái cho phôi chọn lọc từ đàn hạt nhân Các thú chọn phải bảo đảm tiêu chuẩn : - Có nguồn gốc rõ ràng, có đặc trưng phẩm giống - Năng suất cao - Khả sinh sản bệnh sản khoa 6.2 Chọn thú nhận phôi Nái nhận phôi có ảnh hưởng lớn đến việc tiếp nhận nuôi vai trò kiểu gen đời sau phải đạt yêu cầu sau : - Không mang bệnh tật - Sinh trưởng, phát triển bình thường - Sinh lý sinh sản bình thường 51 6.3 Gây siêu noãn thú cho phôi Gây siêu noãn thú cho phôi trình kích thích để lần động dục có nhiều trứng phát triển, chín rụng Mục tiêu việc thu nhiều trứng chín rụng tạo thành hợp tử kết thu nhiều phôi có chất lượng cao Để gây siêu noãn, người ta thường sử dụng hormone FSH, PMS, HMG Pergonal…các hormone dùng riêng biệt hay kết hợp với HCG hay PGF 2α 6.4 Gây động dục đồng pha thú nhận phôi Mục đích tạo cho thú nhận phôi tình trạng động dục đồng pha với thú cho phôi (nếu sử dụng phôi tươi) hay phù hợp với tuổi phôi (nếu cấy phôi đông lạnh) Để gây động dục đồng pha, sử dụng hormone như: PMS, PGF 2α, Progestrone 6.5 Thu hoạch phôi Sau phối giống thời gian, phôi lấy khỏi thú mẹ: Thu hoạch phôi Có hai phương pháp thu hoạch phôi: Phẫu thuật không phẫu thuật Với phương pháp không phẫu thuật, người ta thu nhận phôi nhờ dụng cụ đặc biệt bơm dung dịch dội rửa lấy phôi (ở bò dùng dung dịch muối Phosphate - Phosphate beffered saline - PBS) vào ống dẫn trứng hay sừng tử cung, phôi trôi theo dẫn để thu nhận Dung dịch rửa có lẫn phôi dẫn để lắng đọng 20 - 30 phút đưa vào đĩa petri soi tìm phôi 6.6 Đánh giá phân loại phôi Việc tìm đánh giá phân loại phôi tiến hành kính hiển vi có độ phóng đại > 24 lần Phôi đánh giá phân loại theo tiêu chuẩn sau : - Hình thái, kích thước - Mức độ tế bào : Sự phân bố, xếp tế bào, nguyên sinh chất - Màu sắc phôi Phôi coi tốt có kích thước đảm bảo, có dạng cầu đều, nguyên vẹn, tế bào xếp đều, liên kết chặt chẽ, có độ sáng phần 6.7 Cấy truyền phôi Nguyên tắc việc cấy truyền phôi phôi lấy vị trí cấy trả vào vị trí nhờ súng cấy phôi Thú nhận phôi sau cấy thời gian, tùy thuộc loài, khám thai để đánh giá kết Đối với bò tháng Tỉ lệ đậu thai bò sau cấy truyền phôi nước phát triển 60 - 70% phôi tươi 55 - 65% phôi đông lạnh Ở VN tỉ lệ đạt có thấp : 30 - 40% với phôi tươi, 38 - 44% với phôi đông lạnh Lợi ích siêu noãn cấy truyền phôi công tác giống gia súc: - Phổ biến nhân nhanh giống có suất cao, có đặc tính quí sản xuất 52 - Nâng cao cường độ chọn lọc, đẩy mạnh hiệu công tác giống sở tăng nhanh tiến di truyền hàng năm - Hạn chế tối thiểu số lượng gia súc làm giống từ giảm chi phí sản xuất - Dễ dàng, thuận lợi việc xuất, nhập vận chuyển trao đổi giống nước, vùng - Giữ gìn, bảo tồn vật liệu di truyền (phương pháp Exsitu) - Hạn chế số dịch bệnh nâng cao khả chống chịu bệnh, khả thích nghi vật môi trường phần lớn dịch bệnh gia súc không lây lan qua phôi - Thúc đẩy nghiên cứu phát triển ngành khoa học có liên quan : phôi sinh học, sinh lý, hóa sinh, miễn dịch, sinh học phân tử, y học… 53 [...]... lợi trong việc xuất, nhập vận chuyển trao đổi giống giữa các nước, các vùng - Giữ gìn, bảo tồn các vật liệu di truyền (phương pháp Exsitu) - Hạn chế một số dịch bệnh và nâng cao khả năng chống chịu bệnh, khả năng thích nghi của con vật ở môi trường mới do phần lớn dịch bệnh ở gia súc không lây lan qua phôi - Thúc đẩy sự nghiên cứu và phát triển các ngành khoa học có liên quan : phôi sinh học, sinh. .. thích nghi của con vật ở môi trường mới do phần lớn dịch bệnh ở gia súc không lây lan qua phôi - Thúc đẩy sự nghiên cứu và phát triển các ngành khoa học có liên quan : phôi sinh học, sinh lý, hóa sinh, miễn dịch, sinh học phân tử, y học… 53 ... Chuẩn bị dung dịch ADN để tiêm - Vi tiêm dung dịch ADN vào tiền nhân hợp tử - Chuyển hợp tử tiêm vào tử cung vật nhận gây động dục đồng pha - Kiểm tra vật sinh xem có gen lạ xen vào hay không Trong. .. đặc biệt bơm dung dịch dội rửa lấy phôi (ở bò dùng dung dịch muối Phosphate - Phosphate beffered saline - PBS) vào ống dẫn trứng hay sừng tử cung, phôi trôi theo dẫn để thu nhận Dung dịch rửa... hạn, gen nghiên cứu chiết ra, tủa rữa đưa vào buffer tiêm Tất dung dịch sử dụng trình chuẩn bị dịch để tiêm phải tuyệt đối vô trùng Dung dịch ADN gen phải không bẩn pha loãng để microlit chứa khoảng