Công nghệ sinh học trong chọn tạo giống và sản xuất cây trồng

Trang 1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP I

PHAN HỮU TÔN

GIAO TRINH CONG NGHE SINH HOC

TRONG CHON TAO GIONG CAY TRONG

Trang 3

LỜI NÓI ĐẦU

x.: nghệ sinh hoc voi hai nội dung chính là công nghệ tế bào và công | nghé tái tỗ hợp ADN, trong những nam gan day da phát triển nhanh chóng \ và

thu được những thành tựu vô cùng to lớn trên mọi lĩnh vực khoa học sinh, y học tà cuộc sống Đặc biệt trong lĩnh vực chọn tạo và nhân giống cây trong, rất nhiêu giống mới có nhiêu đặc tính kỳ diệu được tạo ra nhờ áp dụng các kỹ thuật của công nghệ sinh học Để đáp ứng với như câu học và áp dụng những thành tựu khoa học công nghệ sinh học vào nông nghiệp : nhằm tạo nhanh ra những giỗng cây trồng có năng suất cao hơn, phẩm chất tốt hon, khả năng thích ứng và chỗng chịu rộng hơn, đáp ứng nhu câu lương thực thực phẩm của nhân loại ngày một cao, đồng thời đảm bảo môi trường bên vững; nhằm phục vụ nhu cau giảng dạy, học tập và nghiên cứu ứng dụng công nghệ sính học trong các trường đại học, các viện nghiên cứu nông lâm nghiệp cho các ngành trỗng trọt, bảo vệ thực vật, giỗng cây trong và chuyên ngành công nghệ sinh học, chúng tôi đã biên soạn Giáo trình “Công nghệ sinh học trong chọn tạo giống cây trồng” Nội dung giáo trình gồm 6 chương:

- Chương Ị “Công nghệ nuôi cây mô lễ bào và cải lương giống cây trông" đê cập đến những nguyên lý, cơ sở di truyền, các bước tiễn hành và ứng dụng của từng công nghệ té bao trong chon tao va nhan giỗng cây trông

- Chương II “Công nghệ tái tễ hợp ADN" trang bị những khái niệm và nguyên lý cơ bản của công nghệ gen chính trước khi bước vào các khía cạnh

ứng dụng trong chọn tạo giống

- Chương II "Phương pháp chỉ thị ADN đánh dẫu gen ứng dụng trong

chọn tạo giỗng cây trông", giới thiệu một trong những hướng ứng dụng cơ bản của công nghệ gen, nhằm chọn lọc gián tiếp những tính trạng và đánh

giá sự đa dạng nguồn gen thông qua chỉ thị phân tử ADN

- Chương IV “Ứng dụng phương pháp nhân ADN bang PCR trên cơ sở

RFLP trong cong tac chon loc giỗng lúa chỗng bệnh”, trình bày cách ứng dụng chuyển từ phương pháp RFLP phức tap sang phương pháp PCR dễ làm và có thể áp dụng được ở các nước nghèo có trang thiết bị thí nghiệm

- còn hạn chễ như Việt Nam

G3

suy

om

Trang 4

oe ' Chương vi 'Công nghệ chuyển gen v vào thục vật” giải quyết những vẫn

dé vé công nghệ chuyển nạp gen vào thực vật, tạo sinh vật chuyền gen, một

thành tựu được coi là Cuộc cách mạng xanh lan thứ 2 trong nông nghiệp - ' Chương VI “Đa "hình protein, enzym \ vả ứng dụng trong chọn tạo giống cây trỗng" đề cập đến đa hình protein và enzym, ứng dụng trong công tác

chọn tạo giống cay trồng

Với bỗ cục các phan gdm: Khai niệm, nguyên lý và cơ sở dị truyền đến cách tiễn hành và ứng dụng chúng trong nghiên cứu di truyền và chọn giỗng cây trông, mong muốn bạn đọc không những nắm được kiến thức vẻ lý thuyết mà còn biết cách vận dụng vào thực hành tay nghề trong công tác nghiên cứu, vì thé chúng tôi đã bố trí cả những bài thực hành Xen kẽ vào từng chương mục Đồng thoi phan này đưa ra rất chỉ tiết từ các bước tiễn hành

pha hoá chất, cách sử dụng các dụng cụ cũng như các thao tác và khắc phục

thất bại thường vấp phải Đề hiéu và nắm vững những nội dung và yêu câu của giáo trình này, đòi hỏi sinh viên phải học qua và nắm chắc kiến thức các mộn như di truyễn học, sinh hoá học, vi sinh vật học và đặc biệt là những kiến thức về di truyền học phân tử

Tác giả xin chân thành cảm on PGS.TS Lê Thị Ánh Hông, Phó: Viện

trưởng Viện Di truyền nông nghiệp đã đọc và đóng góp nhiễu ý kiến bỗ ích để

bản thảo được hoàn chỉnh hơn Tuy nhiên, đây là một lĩnh vực khoa học còn mới mẻ, với vốn kiến thức bản thân có hạn, nhiêu thuật ngữ về công nghệ sinh học ở Việt Nam còn chưa thống nhất, chúng tôi tạm sử dụng các thuật ngữ nguyên gốc tiếng Anh, có chú thích theo ý hiểu của mình điều đó chắc chắn không tránh khỏi khiếm khuyết

Rất mong được sự đóng góp chân thành của các nhà khoa học, các bạn đồng nghiệp và đông đảo bạn đọc dé cuén giao trinh nay được hoàn chỉnh hơn trong lẫn tái bản sau

Xïn chân thành cảm ơn

Trang 5

BAI MO DAU

-L KHÁI NIỆM, NỘI DỤNG VÀ NHIỆM VỤ CỦA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

1 Khái niệm , me _-

- Công nghệ sinh học là tập hợp những quá trình sinh học liên quan đến việc sử dụng những hệ thông sinh học, đôi với một sô ngành công nghiệp có liên quan dén vi sinh vật biên đổi di truyện

- Công nghệ sinh học là môn học chuyên nghiên cứu, sử dụng cơ thê sông và những đặc tính của nó để tạo ra sản phâm theo ý muôn và xây dựng những quá trình công nghệ sản xuât đông loạt

- Công nghệ sinh học trong chọn tạo giống cây trồng là môn học chuyên nghiên

cứu ứng dụng những kỹ thuật của sinh học hiện đại nhằm chọn tạo nhanh và có hiệu quả

giống cây trồng mới có nhiều đặc tính kỳ diệu phục vụ nhu cầu ngày càng cao của con người và bảo vệ môi trường bền vững

2 Nội dung

da) Nghiên cứu ứng dụng công nghệ nuôi cây mô tê bào nhằm tạo và nhân nhanh giong cay trong

- K¥ thuat nudi cay in vitro và ứng dụng trong nhân giông cây vô tính

- Kỹ thuật nuôi cây đỉnh sinh trưởng, ứng dụng làm sạch virút trong nhân giông - Kỹ thuật cứu phôi, nuôi cây bầu nhụy nhăm khắc phục tinh bat dục khi lại xa - Kỹ thuật tạo hạt nhân tạo vô tính nhăm bảo quản, vận chuyên và thương trường

hoá đề dàng

- Kỹ thuật gây và chọn lọc đột biên dòng tê bào soma phục vụ công tác chọn giông

- Kỹ thuật nuôi cây bao phân bào tử, tạo cây đơn bội, lưỡng bội hoá tạo cây lưỡng

bội giúp ngăn quá trình tạo dòng thuan

- Kỹ thuật dung hợp tế bào trần, tạo cây lai bao chat

b) Kỹ thuật tái tổ hợp `

- Nghiên cứu cơ sở đi truyền phân tử của các quá trình liên quan đến công nghệ gen _~ Các phương pháp tách nhân gen sinh vật

- Dùng chỉ thị phân tử để nghiên cứu đa đạng di truyền và chọn lọc gián tiếp _~ Nghiên cứu chi thi DNA trong lập bản đồ di truyền liên kết và chọn giống phân tử

- Chuyển øen thực vật, các phương pháp, các bước tạo sinh vật biên đôi đi truyền

Trang 6

Án toàn sinh học các nguyên tác, định luật trong việc c đánh gia, quan ly những van | dé an toàn sinh học :

ve Da hinh enzym, “protein trong công tác chọn tạo giống cây trồng chất lượng cao

oe cau tao, thanh phần protein dự trữ hạt, đa hình enzym; chỉ thị enzym trong chọn giống

-3, Nhiệm vụ

| _ Ung dung cong nghệ sinh học hiện đại nhằm: -

- Nhân đồng loạt, đủ số lượng; đồng nhất, sạch bệnh các cây sốc tốt - Bao quan nguôn g gen thông qua hạt nhân tạo

ca - Khắc phục những hạn chế của lai xa bằng cách cứu u phôi, tách phôi, nuôi phôi đơn bội - Rút ngăn quá trình tạo đòng thuần bằng nuôi cấy hạt, bao phân và bào tử

-T 40 sự đa dạng di truyền bằng cách tách đột bién soma, dung hợp tế bào trần ` - - Ung dung chi thi phan tử trong chọn giống phận tử, chọn nhanh, chính xác, có

hiệu quả cho ra giỗng mới

II LICH SU PHAT TRIEN CUA CONG NGHE SINH HOC

Những mốc phát triển chính của sinh học có liên quan đến công nghệ sinh học: - Phát hiện ra quy luật đi truyền của Menden từ 1865 - 1900

- Fred Grifith nhà bác học người Anh năm 1928 đã khám phá ra vật chất di truyền (DNA) có thể di chuyên giữa các loài vị khuân -°

- Nhóm bác học Oswald Avery ở Viện Rockerfeller năm 1940 đã phát hiện ra gen được cấu tao tr DNA

- Năm 1953, Watson và Crick đã khám phá ra cấu trúc xoắn kép của DNA

¬= Vào những năm 1960, thành công lớn nhất là kỹ thuật tái tổ hợp DNA, kỹ thuật chuyển nạp, phân cắt, vecter, dung hợp tế bào trần và nuôi cấy mô tế bao

- Năm 1973, Cohen và Boyer đã thành công trong việc chuyển một øen từ cơ thé sinh vật nay sang co thé sinh vật khác

- Vào những năm 1980, một sinh vật kỳ lạ đầu tiên (một vi khuân sông được trong điều kiện đóng băng) được thử nghiệm ra môi trường Ở Mỹ

- Năm 1988, ở Canada đã thử nghiệm đầu tiên trên đồng ruộng cây có tính trạng khác lạ

- Năm 1990, sản phẩm cây biên đổi gen đâu tiên được bán trên thị trường Bắc Mỹ _— TU - Năm 2003, theo Bộ Nông nghiệp ww (USDA) 6 Mỹ ¿ đã có 80% đậu -tương, 38%

Trang 7

II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SINH HỌC

- Phương pháp nghiên cứu công nghệ sinh học là phương pháp có tính chất tổng hoà, áp dụng những kỹ thuật hiện đại nhất của di truyền, sinh hoa, vi sinh vat, té-bao hoe, vat ly hoá học trong công tác chọn tạo giống cây trồng

'-'Tiến bộ của công nghệ šinh học gắn liên với sự phát triển của các ngành khoa học cơ bản, khoa học cơ sở khác

- Các kỹ thuật đòi hỏi độ chính xác cao, trang thiết bị đắt tiền, kỹ thuật thao tác

chuẩn xác nhưng hiệu quả cũng rất cao ngồi dự đốn

- Kỹ nghệ di truyền gắn liền với công nghệ thông tin (Bloinformatie)

- Hợp tác có tính chất toàn cầu giữa các nhà khoa học trong nghiên cứu chuyển giao bản quyền và thương mại hố

IV CƠNG NGHỆ SINH HOC DOI VỚI CHỌN GIÓNG

- Thúc đây nhanh chóng công tác chọn tạo ra giống mới

_ Tạo ra giống cây trồng mới nhanh, chính xác, có nhiều đặc tính kỳ điệu theo ý muốn mà phương pháp truyền thông không thể thu được

- Góp phần đảm bảo đủ lương thực, thực phẩm cho số dân trên thế giới ngày một tăng, trong khi điện tích đất đai ngày càng thu hẹp lại „ đồng thời còn đảm bảo môi trường bên vững và sạch cho loài người :

- 50 sánh giữa chọn tạo giông truyền thông và chọn tạo giống hiện đại băng cơng

nghệ sinh học: ¬

Chọn tạo giông truyền thông Chon tao gidng hiện đại

Khi lai giống, hàng triệu genkhông Lựa chọn chỉ một.gen mong muốn chuyển mong muốn có thể xuất hiện vào cây trông

Lai giông thông thường không thê Dung hợp gen của các loài hoàn toàn tiên hành được như lai xa khác nhau vào cây trông

Đưa chuyên, tạo gen theo ý muôn Đưa, chuyền tạo từ những gen tự nhiên | 4 rn

rồi chuyền vào cây

Trang 8

pote thse _ Chương I ^

: NUÔI cAY MÔ TE BAO VA CẢI LƯƠNG GIÓNG CÂY TRÔNG

1 DAT VAN DE, NOI DUNG VA THANH TUU

“Nuôi cấy mô tế bào và bộ phận cơ quan thực vật trong môi trường dinh dưỡng vô trùng nhằm tạo cây hoàn chỉnh là một hướng nghiên cứu cơ bản và ứng dụng quan

trọng trong chọn tạo và nhân giống cây trông Y tưởng này được đề xuất từ năm 1838

- 1839 trong nội dung học thuyết tế bào của Sehleiden và Sehwann Tuy nhiên nó vẫn

chưa được ứng dụng cho đến tận năm 1902, khi Haberlandt - nhà sinh lý học thực vật

người Đức - ông tổ của nuôi cấy mô tế bào để xuất là có thể tạo ra được những phôi nhân tạo từ những tế bào dinh dưỡng Từ đó khái niệm “totipotency” (tính toàn năng) có nghĩa là tiềm năng của một tế bào có thể phát triển thành cây hoàn chính đã được ứng dụng ở rất nhiều loài cây trồng Hiện nay bằng kỹ nghệ nuôi cấy tế bào soma nuôi cấy hạt phấn, nuôi cấy protoplast có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh ở rất nhiều loài cây trồng Thành công đầu tiên phải kể đến là kết quả nghiên cứu của White P.R (1934), Gautheret R.J (1939), Nobecourt P va Seances (1939) Diéu nay da thu hut rat “nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm, chú ý đến hướng nghiên cứu này và họ đã bước đầu thu được một-số kết quả đáng khích lệ như: Xây dựng được một số quy trình nhân giống cây trồng trong ¿n vitro; quy trình làm sạch virút thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng; cách sử dụng auxin và cytokinin nhằm điều chỉnh việc hình thành các cơ quan khác nhau của cây; quy trình tái tạo phôi từ tế bào soma; kỹ thuật tạo sinh khối; kỹ nghệ dùng enzym phân lập protoplast; nuôi cấy bao phấn để tạo cây đơn bội; quy trình tái tạo cây từ một tế bào và cả các biện pháp nhằm làm tăng khả năng hấp thụ ADN của tế bào Môi trường nuôi cây lúc bấy giờ thường dùng nh Ất là Murashige va Skoog goi tat la MS va méi trường, BS là môi trường MS với nông độ các phytohormone được cải tiến

Trong vòng hai thập kỷ qua, các kỹ nghệ này ngày càng được hoàn thiện hơn Kỹ thuật nuôi cây đỉnh sinh trưởng và nhân đồng loạt trong i” vitro da được áp dụng một cách rộng rãi nhằm tạo giống khoai tây, khoai lang, sẵn, cây phong lan và một số loài cây cảnh và rau hoa quả sạch virút khác Cứu phôi đã ứng dụng thành công nhằm khắc phục tính tự bat hợp, cứu con lai xa khác loài ở các cây ngũ cốc, đậu đỗ, cây cỏ làm thức ã ăn gia súc Người ta đã tái tạo thành công hơn 200 loài cây đơn bội thông qua nuôi cấy bao phân và đã chọn tạo ra được một số dòng giống cây ưu tú, cải tiễn ở lúa mì, lúa

nước, thuốc lá v.v Khi tế bao nudi cay được đưa vào môi trường chứa độc tố do nắm

bệnh hoặc muối và axit amin tương đồng thì có thể sẽ tạo ra được ññững biển di có kha

Trang 9

soma, loại biến di xay ra trong quá trình nuôi cây có thể được tạo ra như: tính chéng bénh dém mat cua, bénh virtt Fiji ở mía, đặc tính chống bệnh thối sớm muộn ở khoai tây và chống Heminthosporium ở ngô, v.v Kỹ thuật tái tạo phôi đã được khai thác

nhằm xây dựng kỹ thuật tạo hạt nhân tạo để nhân đồng loạt một khối lượng lớn những

giống cây lai và nhiều lo ồi cây trơng có giá trị kinh tế khác Bang cách này hiện đã tạo

thành công hạt nhân tạo ở trên 150 loài cay trồng Bảo tồn nguôn gen lâu đài dưới đạng

nuôi cây mô, nuôi cấy đỉnh sinh trưởng nuôi cay mam ngày càng trở thành phương tiện

quan trọng và được ứng dụng rộng rãi hiện nay Những tiến bộ quan trọng hiện nay đã

đạt được trong kỹ nghệ nuôi cây mô tế bào đó là: * v 2 ot

- Kỹ nghệ nuôi cây tê bào phan tan dang huyền phù trong dung dịch

z ^

- Kỹ thuật nuôi cây tê bào trân và tái tạo cây thành cơng ở đhững lồi khó tái tạo

h A

cây như những cây ngũ côc một lá mâm lúa, lúa mì, ngô và một sô cây gỗ khác

.~ Thành công trong dung hợp tê bảo trần, đã tạo ra cây lai soma giữa những loài khó lai hữu tính

~ Thông qua đó chuyên nạp ADN vào trong tế bào để tạo ra cây tái tổ hợp, hiện đã thu được trên 45 loài cây có tai td hop gen, những cây này mang những øcn tạo ra những đặc tính nông học quí như: chống thuốc trừ cỏ, chống côn trùng, chống virút

chong nam bệnh hoặc có khả năng bất dục đực

I NUOL CAY IN VITRO TRỌNG NHÂN GIÓNG CÂY VÔ TÍNH

1 Cơ sở đi truyền và mục đích a) Co'sé' di truyén

Cơ sở di truyền là kỹ thuật nuôi cây mô tế bào nhằm tái tạo thành cây hoàn chỉnh trong ống nghiệm, ngoài cơ thể sống từ các cơ quan bộ phận dinh dưỡng của cây Kết quả sẽ tạo ra đồng loạt các cây có đặc điểm đi truyền đồng nhất giống với tế bào mẹ xuất phát điểm ban đầu, trừ trường hợp có xây ra đột biến trong quá trình nuôi cấy (trình bay chỉ tiết ở phần sau), hoặc nguyên liệu mô tế bào nuôi cấy xuất phát từ tế bảo đột biến khảẩm Cơ sở khoa học của phương pháp này là dựa trên hai phát hiện lớn đó là: việc tái sinh ra các cơ quan khác nhau của cây là do các hoócmôn điều khiển và cây trồng có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh thông qua con đường nuôi cấy mê Ae bảo định dưỡng Trong đó cytokinin dong vai trò quan trọng trong việc tạo ra mam cây còn auxin có vai trò xúc tiễn tạo thành rễ Cây có thể được sinh ra trực tiếp từ các đỉnh chồi nách đã có sẵn hoặc có thể trực tiếp hay gián tiếp từ callus, hoặc từ té bao nuôi cây huyền phù để hình thành lên các mam bat định rồi từ đó cho ra cây

Trang 10

Callus la một khối mô tế bào chưa phân hoá, được tạo thành trong quá trình nuôi

cấy: mô từ một tế bào thực vật Khi một mẫu cây (lá, thân ) được khử trùng rồi đưa vào

môi trường dinh dưỡng chứa cytokinin, hoócmôn này kích thích phát sinh tạo khối mam, các mâm này nếu được cấy chuyển tiếp sang môi trường mới sẽ tiếp tục cho ÿ

mầm, nếu đưa vào môi trường chứa auxin thì sẽ kích thích cho ra rễ và tạo thành cây -b) Mục đích

- Nhân nhanh Các cơ quan, bộ phận dinh dưỡng từ một cây 8 gốc tốt, giống tốt hay dòng tốt, cung cấp nhanh, đủ số lượng giống vô tính đồng nhất cho nhu cầu thực tế sản xuất Giống nhân vô tính này có độ thuần về mặt đi truyền cao vì cơ sở của nhâ nan in vitro la phan bao nguyén nhiém

- Việc sản xuất hat nhân tạo thông qua tái sinh phôi từ tế bảo soma cũng ø đang được

khai thác như là một hướng để nhân hà nàng loạt những nguồn gen quí trong ống nghiệm

- Trong sản xuất sinh khối callus, đặc biệt là đối với cây được liệu quí hiểm, làm nguồn nguyên liệu cho công nghiệp chế biến được liệu

- Làm sạch virút, ở một số cây trồng như khoai lang, khoai tây sẵn và một số cây ăn quả khác trong quá trình trồng trọt lâu đời, một số cơ quan bộ phận dinh dưỡng bị nhiễm bệnh, nếu dùng chúng làm giống sẽ là nguồn lây bệnh cho năm sau, day la nguyén nhan chinh gây thoái hoá giống đối với cây sinh sản vô tính Dùng nuôi cấy mô nhất là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng còn non, nơi chưa.bị nhiễm virút dùng làm bộ phận nuôi cấy, hoặc trong quá trình nuôi cấy xử lý nhiệt độ cao diệt một số virút, hoặc thử

ELISA chọn bộ phận sạch bệnh rồi nuôi cấy sé tao ra déng loạt các cây sạch virút

Nuôi cây ím viro còn là phương tiện đê bảo quản nguôn gen quí lâu dài trong Ông nghiệm, tạo điêu kiện thuận lợi để trao đôi các nguồn gen trên trường quốc tế

- Duy trì ưu thê lai lâu dài băng nhân vô tính cây F1, áp dụng đổi với cây vừa sinh sản hữu tính vừa vô tính, các cây ăn quả, cam: chanh bưởi, cây lấy gỗ

- Tạo ra các cây tự bắt hợp đồng hợp tử, bang nudi cay cac phôi tâm của hoa không thụ tỉnh, hoặc sau khi dùng các biện pháp như cắt vòi nhụy tạo điều kiện cho ố ống phan vươn tới tế bào trứng và quá trình thụ tình xây ra thành công sẽ tạo được cây đồng hợp tử về kiểu gen tự bất hợp rồi nhân vô tính để duy trì

- Tách các đột bién soma xây ra ở các mô tê bào đã được xử lý đột bién; dùng mô có đột biến khảm này nuôi cấy sẽ tạo ra rất nhiều cây con, cây nào phát sinh từ tế bào đột biến có thể sẽ tạo ra cây đột biến, v Và,

2 Kỹ thuật, thành tựu và thách thức

-8) Tóm tắt kỹ thuật, các giai đoạn phát tỂN T* TC

Trang 11

° Trong cay, chon, cat va tách bộ phận để nuôi cây như chỗi, thân mầm, lá, cánh hoa, v.v đều có thể dùng làm nguyên liệu cho nuôi cấy Tuy nhiên chọn bộ phận nào nuôi cây thích hợp lại tuỳ thuộc vào từng loại cây trồng

e Khử trùng mẫu cây, chú ý-khử trùng cả môi trường và dung cu bang một trong

các phương tiện säư: sây hoặc hân #*sz núi hập; dùng côn 70%; nước tẩy trùng -0;1%

HgCl];,:1,8% Hypoclorit Na, CaOC]›, HạO¿, v.v

-_® Rửa sạch 4-5 lần băng nước cât vô trùng, rồi đặt vào các môi trường tuỳ từng cây như: MS, BS và NN, sẽ trình bây chi tiết ở mục (b) dưới đây

e Nuôi ủ cần chú ý về điều kiện ánh sáng, nhiệt độ, ẩm độ và có thé cả nồng độ CÓ; thích hợp

e Kích thích cây con ra rễ, thân và lá cân thay đôi môi trường, cây chuyên, điều chỉnh băng các hoócmôn sinh trưởng

s Chuyên ra trông trong nhà lưới, tăng cường độ ánh sang dan dan để cây làm quen với điều kiện môi trường tự nhiên

e Trồng cây ra ngoài đông, chăm sóc tốt va can than

Theo Murashige (1974), sự phân hoá và phát triển của mô nuôi cây trong ông nghiệm trải qua 3 giai đoạn, có yêu câu về thành phân và điêu kiện môi trường nuôi cây khác nhau như:

+ Giai đoạn 1 liên quan đến việc kích thích tao mé seo (callus) trong in vitro

+ Giai đoạn 2 là quá trình sản sinh ra các đa mâm (multiple shoots)

+ Giai đoạn cuôi cùng là hình thành rẻ và cây con, đủ tiêu chuẩn đưa ra trông trong nhà kính Đối với một số cây trồng, môi trường và điều kiện nuôi cây ở giai đoạn 1 và 2 không khác nhau

b) Môi trường, thành phần và vai frò các hodemon sinh trưởïlg -

Hiện nay trong kỹ nghệ nuôi cấy mô tế bảo người ta qhường sử dung: 3 môi trường nuôi cấy phổ biến (bang 1.1)

- Tuỳ theo từng đối tượng cây Tôi cây mà các : môi trường co ban trên có thể bổ sung một số chất cần thiết khác nhứ “đường, hoócmôn, nước dừa, dich’ chiết nắm men,

các chất casein hay pepton, v.v „ nhiều trường hợp cũng chơi: có kết quả tốt

ty

- Nguồn cacbon bổ sung vào môi ¡ trường nuôi cấy thường là đường Saccaroza và glucoza với liều lượng khác nhau tuỳ từng đối tượng nuôi cấy

Trang 12

Bảng I.I Thành phân và liêu lượng một số mỗi trường nuôi cây thường dùng Thành phần hoá học (mg/lít) và các môi trường B5 MS NN

"Nguyễn tổ đa lượng gồm: N, P,K;S,Mg và Ca nằm trong các hợp chất khác nhau có ảnh hưởng khác nhau đến kết quả nuôi cấy Hỗn hợp các dung dịch được pha chế riêng sau đó trộn lẫn theo tý lệ thích hợp thành các môi trường nuôi cấy tuỳ từng đối

tượng cây nuôi cây * * Dung dich J 1 KNO; 3000 — 1900 125 2 NH NO; 1650 noe 3 (NH);SO¿.HạO 150 a 4 MgSOy.7H,0 500 370 125 _Š KH;PO¿ - 170 125 6 KCl ~=== n+ wens 7 CaCl;.2HạO 150 440 a

8 Ca(NO3)2.4H2O wees woo 500

| * Dung dich 2: Fe EDTA 28 36.0 40

Trang 13

eit

absixic (ABA) Những chất này được phân thành

_ sinh trưởng thân (hình 1.1) được giải thích là ©) Chât điệu tiết sinh trưởng

Ở thực vật hiện nay người ta đã phát hiện thây có 5 nhóm chât điêu tiết sinh trưởng đó là auxin, xytokinin, gibberellin, cthylen và axi tác nhóm dựa vào tính tương đồng về cấu trúc và chức năng sinh lý, tuy nhiên về chức năng nhiều

khi chúng có tác dụng chồng chéo và hỗ trợ lẫn

nhau Còn có một số nhóm khác điều khiển từng

công đoạn sinh trưởng nhất định nào đó nhưra Hình L1 Chéi cay hướng cong

hoa chẳng hạn thì vẫn còn chưa rõ Thêm vào đó về phía ánh đèn chiều sáng còn có rất nhiều chất tự nhiên được biết có tác

dụng ức chế quá trình sinh trưởng và phát triển, chúng chưa được liệt kê và phân chia thuộc nhóm nào Trong nuôi cây mô tế bào người ta thường sử dụng hai nhóm chất điều tiết sinh trưởng là những dẫn xuất của auxin và cytokinin

* Nhóm auxin là nhóm kích thích sinh trưởng — ` CH;¿COOH

chính được các nhà sinh lý học thực vật phát hiện và

quan tâm sớm nhất Auxin là những hoócmôn thực vật \

có tác dụng kích thích sinh trưởng, kéo dài tế bào và phân hóa cơ quan, kiểu tác động của nó liên quan đến làm chuyển đổi và mềm hoá màng tế bào Chính chức

năng này đã được người ta sử dụng để đánh giá hoạt ; ;

tính của nó, thí dụ bằng cách đo phần kéo đài lá mầm Axit Indoleacetic (AA) cây yến mạch trồng trong điều kiện tối chang han sẽ biết được hoạt tính của auxin như thế nào Nhóm auxin bao gồm các chất sau: 2,4 Diclorophenoxy axetic axit (2,4D); œ- naphtylaxetic axit (œ -NAA) va thong dung nhất là Indolaxetic axit (IAA), trong d6 2,4

N H

D dễ gây độc nhưng có tác dụng kích thích quá trình phân chia tế bào và tạo rễ cho cây con, thường được dùng nhiều nhất Một trong những minh chứng cho vai trò điều khiển sinh trưởng của auxin là tính bướng ánh sáng

của cây uôn cong về phía ngọn đèn của đỉnh do quá trình tổng hợp tích luỹ auxin ở phía tôi đã làm cho tế bào ở vùng này kéo đài mạnh hơn so với phía có ánh sáng, kết quả là đỉnh sinh trưởng gập về phía đèn điện Tính ngủ nghỉ của đỉnh sinh trưởng và sự ức chế điểm sinh trưởng mầm lách ngày dưới nó là đo chức nang phan bé auxin Auxin duoc tao ra nhiều ở

đỉnh thân sinh trưởng mạnh và nồng độ Cao ở đây đã ức chế bật chồi các mầm nách

Ngắt bỏ đình ngọn sẽ làm mất nơi tạo ra auxin cho nên mầm bên bật ra cành được

Trang 14

id

Người ta thấy rằng auxin được sinh ra từ đỉnh sinh trưởng thân, cành và rễ sau đó vận chuyển xuống các vùng khác nhau của cây, tuy vậy phân bố của chúng không đồng đều nhau Nồng độ của chúng ở những bộ phận khác nhau có liên quan đến tăng cường hoặc - ức chế sinh trưởng và phân hoá cơ quan, mô Những quá trình như làm dãn tế bào, rụng lá, hoa quả, tính ngủ nghỉ của đỉnh sinh trưởng, tỷ lệ đậu và sinh trưởng của quả có liên quan đến auxin Ở một số cây auxin có tác dụng đến ra hoa và điều chỉnh giới tính do vậy có vai trò rất lớn đối với nông nghiệp Các chất có câu tạo hoá học tương tự như IAA tac dụng kích thích sinh trưởng thì được gọi là những auxin tổng hợp Các chất này được dùng để kích thích tạo rễ, đậu quả, điều khiển quá trình rụng quả và tỉa quả g giảm bớt tối thiểu công tỉa Vai trò của auxin có liên quan đến nhiều hệ thống điều tiết sinh trưởng khác trong cây, vì thế người ta cho rằng nó là hoócmôn chính ảnh hưởng đến sinh trưởng và phân hoá của cây Tuy nhiên, tẦm quan trọng của bất kỳ chất điều tiết phát triển đặc biệt nào đều có thể được đánh giá thông qua số các công trình nghiên cứu chúng Sinh trưởng và phát triển hình như phụ thuộc vào mối tương tác qua lại của nhiều yếu tố Tóm lại auxin mặc dầu là một hoóemôn quan trọng nhưng cũng chỉ là một nhóm trong số rất nhiều chất khác liên quan đến sinh trưởng và phân hoá của cây

# Nhóm gibberelin là một nhóm ít nhất có 45 hợp chất tự nhiên tương tự, chúng được phát hiện qua nghiên cứu bệnh nắm lúa von Nó tác động làm cho tế bào dãn ra và phân chia, làm cây lùn có thể cao lên được, như cây ngô lần thành cây ngô cao, đậu dạng bụi thành dạng đứng Gibberelin có ảnh hưởng đến nhiều quá trình phát triển đặc biệt là những quá trình chịu sự chỉ phối bởi nhiệt độ, ánh sáng (quang chu kỳ) như tính

ngủ nghỉ, nây mam của cây và hạt, sự phát triển của quả và trục hạt Ở Nhật Bản, người

ta xử lý gibberelin để tạo nho không hạt và tăng kích thước quả Đại điện cho nhóm nảy là axit gibberelic (GA3) được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp

* Nhóm cytokinin, dạng đơn gidn la kinin, là nhóm chất hoá học có ảnh hưởng quyết định đến kích thích phân chia tế bào Rất nhiều cytokinin la purine, thi du nhu kinetin, mét chat kich thich phan chia té bao, chiét xuất từ nắm men đã được xác định là có cơng thức hố học 6- -furfurylamino purine Một dẫn xuất nhân tao khác là benzyladenine hoặc BA đã kích thích quá trình phát sinh ra rễ ở cây gỗ có cấu tạo 6- benzylamino purine va tao chéi Dai diện cho nhăm cytokinin gdm: Kinetin; 6- Benzylamino purine (BA), 6-(y-y-Dimethylalylamino) purine (21P); Zeatin vit 6- (Benzylamino)-9-(2-tetrahydropyrany!)-9H-purine (PBA)

Rất nhiều cytokinin duge phat hién trong những nghiên cứu liên quan đến nuôi cấy mô, nó kích thích phân hoá cơ quan của những tế bào không phân chia Cytokinin và auxin phối hợp cũng có ảnh hưởng đến phan hoá mô Nồng độ auxin cao phối Hợp với nồng độ cytokinin thấp sẽ kích thích rễ phát triển Auxin thấ nap, cytokinin cao sé kích thich chéi phát triển, nồng độ 2 hoócmôn tương đương sẽ chỉ sinh trưởng chứ không phân hoá Cytokinin tìm thấy nhiều ở quả và hạt thí dụ như ở ngô và nội nhũ nước dừa đóng V vai trỗ quan trong, trong kích thích $inh trưởng và phan hoa phôi hạt Trong những "tế bào khối u của cây người ta thường tìm thấy có chứa nhiều cytokinin Cytokinin anh

Trang 15

hưởng đến cơ chế sinh lý quan trọng như sinh trưởng của lá, phản ứng với ánh sáng và tính già hoá Gần đây cytokinin và một số hoócmôn khác đã được phát hiện là có liên quan đến cơ chế sinh tổng hợp protein, có thể liên quan đến quá trình đóng mở phiên mã gen hoặc vận chuyển ARN để dịch mã tạo ra sản phẩm của gen 9 HNCH, HNCH, NZ SN KY H 6-Furfurylamino (Kinetin) 6-Benzylamino purine (BA): CH; —- — ys Ko HNCH¿—CH=C—CHạ HNCH»—CH==C—CH,OH 4 N T » SN , N

6-(y,y-Dimethylallylamino)purin (2Pi) Zeatin

¢ Ethylene, mic du da tt lau ngudi ta thay rằng ethylene có H H ảnh hướng rất lớn đến sinh trưởng và phát triển của cây, nhưng

gần đây nó mới được coi là một hoócmôn thực vat Ethylene ⁄ —=C được sử dụng làm chín chuối và dẫn xuất của no.nhu acetylene H H va calcium carbide duoc str dung làm cho đứa ra hoa đồng loạt

Ethylene có ảnh hưởng mạnh đối với cây con sinh trưởng trong : Ethylene bóng tối làm phồng và mất định hướng cho cây, nó cũng ảnh

hưởng đến quá trình phân bào Đối với cà chua trồng trong điều kiện nông độ ethylene cao sẽ kích thích kéo đải khoảng ra rễ của thân Táo đã tạo ra cthylene khi chín và hiện nay người ta đã phát hiện ra tác dung ctia ethylene 6 4 diém sau: 1) ảnh hướng đến phát triển của cay con ta vàng, 2) sự rụng lá, hoa quả, 3) phân hoá hoa ở một vài cây, 4) làm quả chín Chất Ethephon hoặc (2-chlorothyl) phosphonic: axit trong cây sẽ chuyển hoá thành ethylene đã kích thích quả dứa và cà chua chín đồng đều, đảo lộn giới tính, tạo

hoa cái cho đưa chuột - : ¬

Trang 16

-e Abscisic axit (ABA), là hợp chất ức chế '

sinh trưởng thực vật tự nhiên ảnh hưởng đến

tính ngủ nghỉ của hạt, mam va rung ‘la, tang cường ra hoa cho một số cây ngày ngắn thông qua hiệu quả tổng hop: ARN va protein Anh hưởng của ABA có thể được phục hồi bang xử ‘ly Gibberelin hoặc cytokinin

Axit abscisic

e Chất ức chế sinh trưởng, giúp điều khiển

quá trình nây mầm, sinh trưởng của mầm và-tỉnh ngủ nghỉ Một số chất được áp dụng nhiều trong nông nghiệp như Maleic hydrazide giúp ngăn cản nây mầm củ hành và khoai tây Một số chất khác ngăn cản hình thành Gibberelin tu nhién, Chlorphonium chloride (phosphon) và chlormequat được dùng để giảm chiều cao của nhiềù cây hoa cảnh

Trong nuôi cây tuỳ theo cây trồng, bộ phận và kiểu gen nud? cấy, môi trường và giai đoạn phát triển cụ thể trong quá trình nuôi cây mà thành phần, chủng loại và nồng độ các chat didu tiét sinh trưởng sử dụng có khác nhau

d) Thành tựu nuôi cấy mô tế bào trên thế giới

Vào đầu những năm 1960, Morel là người đầu tiên đã áp dụng thành công kỹ nghệ này trong nhân giống phong lan ống nghiệm Morel và Martin (1952) đã tạo được những cây dahlia (cây thược dược) sạch virút bằng cách dùng đỉnh sinh trưởng để nuôi cây, vì đây là cơ quan mới phát sinh còn non chưa bị nhiễm và tích luy virút Hiện nay rất nhiều loài phong lan, dâu tây, asparagus, hoa câm chướng và một số cây cảnh khác được nhân lên theo phương pháp này Hiện có hơn 22 chỉ phong lan được nhân giống phổ biển thông qua con đường nuôi cấy mô Hàng triệu cây dâu tây có thể được tạo ra từ một cây mẹ tốt trong vòng một năm Ở Mỹ, Pháp, Đức, Trung Quốc, Bỉ và một số nước khác, việc nhân giống thông qua con đường này đã trở nên phổ biến trên một số đối tượng là cây cảnh nhằm mục đích thương mại Trên thế giới hiện có khoảng trên -_300 phòng thí nghiệm nhân giống cây cảnh để bán theo con đường này, rất nhiều phòng thí nghiệm có khả năng sản xuất được cỡ 200.000 cây con mỗi tuần Một số công ty tu nhan nhu Cong ty sản xuất hạt lai Mỹ - Án ở Bangalore (Ấn Độ) đã đầu tư trang thiết bị để nhân giống in vitro va xudt khẩu được hàng triệu cây con sang châu Âu, đã bán hàng trăm ngàn cây dứa, cây cardamon (cây tiêu dau khau, Elettaria car damomum) cho nông dân Ấn Độ Phòng thí nghiệm hoá học quốc gia ở Poona (Ấn Độ) dang cố gắng để nhân cây gỗ tếch (teak, Tectona) thông qua nuôi cây mô, giá trị của cây tếch chỉ có thể đánh giá được sau 10 đến 20 năm sau trồng, chính vì thế chọn các cây tốt để nhân đồng loạt có ý nghĩa vô cùng to lớn Mặc dù đã thành công to lớn trong nuôi cấy các cây cảnh, rau và cây hoa nhưng việc nuôi cấy cây lấy gỗ gặp không ít khó khăn và kết quả thu được còn rất hạn chế, chỉ có một vài thí dụ thành công trong nuôi cấy cay lay gd Theo báo cáo của Villalobos V.M '(1989), khi nhân chôi nách cây cà phê: trong mơi tr ường Ì MS có "bổ sung 1 - 4 me/lit benzylaminopurine (BAP) thi thu duge cac mam "Bất định, các mâm này chuyển vảo môi trường không có BAP sẽ kích thích mầm ra rễ Bằng phương pháp

Trang 17

này, họ đã nhân được hơn 100 000 cây con vô tính cung cấp cho các nước châu Mỹ

latinh Thành công của nuôi cấy mô cây lấy gỗ phụ thuộc rất lớn vào việc chọn bộ phận nào để nuôi cấy và biện pháp xử lý bộ phận đỏ trước khi dùng

©) Những điều thường gặp khi nuôi cấy mô

s Tần số tái tạo Thành cây thấp, cần tìm biện pháp khắc phục như chọn đúng bộ phận nuôi cây, cần xử lý trước khi nuôi cấy, xác định đúng môi trường và điều kiện

nuôi cấy, v.v

s Kiểu gen đóng vai trò khá quan trọng để nuôi cấy im vifro thành công, có những dòng tốt nhưng lại rất khó tái tạo thành cây, cần phải tìm ra những điều kiện tối ưu cho từng kiểu gen, có nghĩa là các giống khác nhau có phản ứng và cho kết quả khác nhau khi nuôi cấy

a

e Trong qua ivih nui cdy cd thể xây ra một số biến di, tuy nhiên vì mục đích nuôi cây mô là nhân vô tính tạo ra dòng đồng đều, do vậy cần khống chế điều kiện môi trường nhằm hạn chế các biến đị này

s Nuôi cấy in vi/ro thường tốn kém, do vậy cần tìm các biện pháp làm giảm giá thành khi nhân vô tính thông qua con đường này, có như vậy mới phổ cập được trong

sản xuất ,

ø Để nuôi cấy in viro thành công thì trang thiết bị, hoá chất và các vật dụng dùng trong nuôi cây từ công đoạn tách mẫu cây đến các thiết bị khử trùng, nhà nuôi trồng cây con sau ông nghiệm, v.v đóng vai trò vô cùng quan trọng

s Trong tương lai cần tập trung nghiên cứu tìm ra các biện pháp kỹ thuật nhằm nhân nhanh, có hiệu quả và thích hợp cho nhiều kiểu gen của một sô cây trồng có hệ số nhân tự nhiên thấp, kiểu gen đị hợp tử cao do giao phần, thời gian tái sinh thé hé dai va khó cải lương tạo giống mới bả ăng con đường lai tạo giống thông thường Các cây này là: cây dừa, cọ dầu, đứa, cao su, các dòng đu đủ cái, nhân gốc ghép cho táo tây, cây asparagus bất dục đực, các cây rừng và nhiều cây ăn quả lâu năm khác

3 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (meristem) làm sạch virút a) Tóm lược nội dung

Nuôi cấy meristem thực chất là nuôi cay in vitro chỉ khác bộ phận lấy để nuôi cay là đỉnh sinh trưởng có ¿hứa từ một đến vài lá non Đỉnh sinh trưởng có đường kính khoảng 0, Imm, đài từ 0,25 đến 0,30mm năm trên cùng của chỗi thân và cành cây Đỉnh

sinh trưởng nếu nuôi cấy in vitro trong môi trường có điều kiện thích hợp sẽ sinh trưởng

và phân hố thành cây hồn chỉnh Ở một số loài, mỗi đỉnh sinh trưởng khi nuôi cấy sẽ cho ra một cây con, một số loài khác thì có thể cho ra nhiều cây con nếu nuôi cấy trong

điều kiện tối ưu Những cây được tạo thành thông qua nuôi cay đỉnh sinh trưởng thường

có độ đồng đều cao vì chúng được sinh ra từ những tế bào ít hoặc chưa bị phân hoá như những tế bào ở nơi khác

Trang 18

Đầu năm 1949, Limmaset và Cornuet đã chứng minh được răng virút phân bố trong cây theo quy luật, càng gan đỉnh sinh trưởng mật độ virút càng giảm Sau đó Morel và Martin (1952) là những người đầu tiên đã tạo ra các cây thược dược khoẻ từ cây bệnh thông qua con đường nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Từ đó đến nay-nuôi cây đỉnh sinh

trưởng đã được áp dụng rộng rãi để nhân vô tính sạch virút ở rất nhiều lồi cây trơng

1ÿ thuật nay bao gém:

- Trồng và chọn cây lây đỉnh sinh trưởng oS ©

- Tach, cat dinh sinh trưởng đâu thân, chôi và nách cảnh, mâm thường đài từ 0,2 -

0,5 mm, yêu câu lây đỉnh sinh trưởng phải khéo léo, tỉ mi - Khử trùng mẫu cắt và rửa sạch băng nước cât vô tring

- Đặt cây trong môi trường dinh duGng, tao callus va da mam - Cây chuyên sang môi trường tái sinh cây, tạo rễ, thân lá chú ý thành phân môi trường, thành phân và hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng

- Đưa cây con trồng trong nhà kính, nhà lưới Trồng trong khu cách ly, có khả năng

ngăn chặn, hoặc chống được côn trùng truyền bệnh và được kiểm tra cần thận xem

chúng có bị nhiễm virút hay không bằng một số biện pháp như ghép truyền lan bằng rệp sáp, phản ứng huyết thanh, soi kính hiển vị điện tử, phân tích ELISA, từ đó chọn cây sạch bệnh và dùng làm nguồn cây sạch bệnh Cần chú ý-rằng những cây này chỉ sạch bệnh chứ không chéng hoặc miễn địch đối với bệnh

b) Ứng dung

Nuôi cây đỉnh sinh trưởng cũng nhằm một số mục đích sau: a) Tạo ra cây sạch

virúf; b) Nhân vô tính kiểu gen tốt tạo dòng vô tính thuần; c) Tao diéu kiện thuận lợi để

trao đổi nguồn gen quốc tế; đ) Bảo tồn nguồn gen lâu dài trong ống nghiệm Hiện nay người ta đã dùng phương pháp này để làm sạch virút khảm cây sẵn, mía, súp lơ, tỏi, virút khám dưa chuột, chuối, virit X, Y, S, A, M, virit cuộn lá và sọc khoai tây Hiện có trên 10% diện tích trồng khoai tây ở Trung Quốc đang trồng giống sạch virút thông qua nuôi cây đỉnh sinh trưởng Các trung tâm nghiên cứu quốc tế như CIAT ở Colombia va IITA 6 Nigeria dang phé bién nudi cấy đỉnh sinh trưởng làm sạch virút trên đối tượng cây sắn, khoai tây và khoai lang, cung cấp cho nhiều quốc gia

©) Cơ sở khoa học

- Lý giải tại sao bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng lại làm sạch được virút thực sự vẫn chưa rõ ràng Giả thuyết đầu tiên cho rằng: ở đỉnh sinh trưởng có nồng độ các hoócmôn sinh trưởng cao nên đã làm mắt hoạt tính của virút, một quan điểm khác lại cho rằng sự di chuyển của virút từ tế bào này sang tế bào khác để đến đỉnh sinh trưởng không theo kịp với tốc độ phân chia tế bào ở đây, điều này chưa thật đúng lắm Walkey (1978) đã _ phát hiện có một số virút như virút.khảm-thuốc lá (TMV), virút kham dau ngtta (CMV),

X khoai tây tôn tại ở tế bào đỉnh sinh trưởng với nồng độ éao: và người ta cũng đã tạo ra

Trang 19

qua quá trình nuôi cấy, virút đã bị loại trừ bởi tổ hợp các yếu tổ như thế nào vẫn còn chưa rõ Khả năng loại trừ virút khi nuôi cấy được tăng cường nếu kết hợp với xử lý nhiệt độ như đặt cây bị nhiễm bệnh ở nhiệt độ 372C trong vài tuần nhằm làm mất hoạt tính -của virút, sau đó lấy đỉnh sinh trưởng của các cây này, nuôi cấy sẽ tạo được cây sạch virit Bang cách này, Kartha và Gamborg (1975) đã tạo ra 100% cây sạch virút

khảm nếu nuôi cấy định sinh trưởng của đoạn cây sẵn nhiễm virút, trồng ở nhiệt độ

35°C trong thời gian 30 ngày Dùng hoá chất để ức chế virút cũng đã được nghiên cứu, thí dụ xử lý ribavirin đã làm giảm nồng độ virút khảm đậu ngựa (CMV) va cay alfalfa, nhiéu chat kháng virút khác cũng đã được sử dụng

t) Những điễu cần chú Ụ

Hiệu quả nuôi cấy đỉnh sinh trưởng được đánh giá bằng tỷ lệ thành cây con và độ sạch virút Điều này tuỳ thuộc rất lớn vào loại cây trồng, loại virút và kích thước đỉnh sinh trưởng dùng khi nuôi cấy Một số virút có thể bị loại trừ một cách rất dễ dàng, số

khác thì khó hơn, thí dụ trong số những virút hại thuốc lá thì đễ nhất là virút cuộn lá V

(PLRV) tiếp đến là virút A (PVA), virút PVY, PVX cuối cùng là viroid sơ củ Nhìn

chung mẫu đỉnh sinh trưởng lấy cảng to thì tỷ lệ thành cây cảng cao, nhưng số cây sạch virút lại càng giảm Số mầm ở đỉnh sinh trưởng CÓ Vai trò quan trọng trong việc làm sạch virút hơn là kích thước đỉnh sinh trưởng, nếu đỉnh sinh trưởng có l - 2 mầm sẽ loại trừ virút tốt hơn

Khi nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thường gặp một số tình huống sau: a) Tỷ lệ thành cây thấp nếu nuôi cấy lấy phần đỉnh sinh trưởng nhỏ; b) Tỷ lệ cây bị nhiễm virút cao; c) Thiếu kỹ thuật kiểm tra cây nhiễm virút có hiệu quả; d) Thiếu phương tiện duy trì và trồng cây cách ly côn trùng chuyền bệnh Nuôi cây đỉnh sinh trưởng kích thước 0,1- 0,2mm sẽ thu được tỷ lệ tái sinh cây thấp, nhưng khi đỉnh sinh trưởng lớn hơn 0,4mm thì lại khó loại trừ được virút

Tuy nhiên, đây là một phương pháp tạo cây sạch virút khá đơn giản, có nhiễu triển vọng, hiệu quả của phương pháp này có thể được tăng lên nếu có kết hợp với xử lý nhiệt độ, có các trang thiết bị hiện đại và phương tiện nhằm trồng cây trong điều kiện tránh được lây bệnh, kể cả việc có cây chỉ thị và kỹ thuật phát hiện virút chính xác và nhanh Cần nghiên cứu dé tìm ra những biện pháp nhằm tăng tỷ lệ thành cây khi lấy mẫu đỉnh

sinh trưởng nuôi cây nhỏ ,

Il NUOI CAY PHOI TRONG CHON GIONG ©

1 Tóm lược nội dung

Dé lam giầu vốn gen cây trồng, các nhà chọn giống phải tìm sự đa dạng từ nhiều nguồn đi truyền khác nhau, Loài cây dại là một trong những nguồn gen quan trong, chứa những gen quí chống bệnh, sâu hại, chống chịu các điều kiện môi trường khó khăn, chứa gen bất dục đực và nhiều tính trạng chất lượng tốt khác, Tuy nhiên thông

qua lai hữu tính để chuyển những gen quí này từ cây đại sang cây trồng gặp không ít

Trang 20

xa giữa các loài, đây còn là biện pháp làm tăng cường sự nây mầm của hạt, khắc phục

tính ngủ nghỉ và tính tự bất hợp của hạt, tạo cây đơn bội và lệch bội thông qua việc loại

trừ nhiễm sắc thể trong cơ thể cây lai xa khác loài Đặc điểm của cây lai xa là hợp tử thường bị chết trong quá trình phát triển khác nhau của phôi thai, nguyên nhân chính là do sự bất hợp giữa phôi và nội nhũ Nuôi cấy phôi là một kỹ thuật liên quan đến việc tách phôi lai xa, nuôi cây chúng trong môi trường đỉnh dưỡng nhất định giúp các phôi này phat trién thanh những cây lai con Laibach (1925) là người đầu tiên nuôi cấy hạt lai không sông từ tổ hợp lai xa giữa Linum perenne lai với L au striacum va d& tao duoc hat chin nay mam bình thuong Tu đó ky thuat nay da ap dung thành công nhằm cứu phôi khi lai xa ở nhiều đối tượng cây trồng bao gôm cây ngũ cốc, đậu đỗ, cây rau hoa quả và nhiều loài cây lấy gỗ khác Việc tạo thành công nhiều cây lai giữa Triticum voi Hordeum, gitra Triticum X Elhunus, và Hordeum X Secale, dic biệt là cây lai giữa Triticum v6i Secale la mét thi dụ kinh điển trong việc ứng dụng phương pháp cứu phôi lai xa để tạo giống cây trồng

Hiện nay trên thé gidi co mét số trung tâm nghiên cứu thường xuyên ứng dụng kỹ nghệ này để tạo ra giống lai khác loài như CIMMYT ở Mehico thực hiện chương trình lai giữa ngô với Tripsaeum, giữa ngô với lúa miễn, giữa lúa mì với đại mạch Tương tự ở Ấn Độ có Trung tâm ICRISAT sử dụng kỹ thuật này để chuyển gen chéng bệnh từ loài lạc đại cho giống lạc trồng Tại IRRI đã tạo ra được một số tổ hợp lúa lai khác lồi thơng qua phương pháp cứu phôi, đã chuyển thành công gen chỗng bệnh đạo ôn, bạc lá, và rầy nâu cho những giống ưu tú từ những loài lúa dại mà bằng cách lai hữu tính thông thường không thể thực biện được Cứu phôi lai xa còn được ứng dụng để tạo cây đơn bội, vì trong cây lai xa xây ra quá trình loại trừ nhiễm sắc thể dẫn đến hình thành cây đơn bội Kasa và Kao (1970) đã tiến hành lai giữa H vulpare với H Bulbosum, họ đã phun GA3 với nồng độ 75 ppm trong 3 ngày liên tiếp cho những hoa đã được thụ phấn, sau thụ 12 ngày thì tách phôi và cấy ở môi trường dinh dưỡng trong điều kiện bóng tối với nhiệt độ 22C Sau 1 đến 2 tuần tiếp theo, nếu phôi này được chuyển đến buồng trồng cây có điều chỉnh thời gian chiếu sáng, 12h và nhiệt độ 22°C thì có thể sẽ kích thích tạo được khoảng 50-60% số phôi nuôi cấy phát triển thành cây đơn bội Bằng cách - quan sát tế bào và phương pháp đánh dấu gen người ta đã chứng minh được rằng, việc ‘tao cay đơn bội là kết quả của quá trình loại trừ nhiễm sắc thể lồi Bulbosum

Ni cấy phơi còn được ứng dụng trong việc cứu tách các mâm phôi bất định, phôi hình thành từ những tế bào không thụ tỉnh trong bầu nhụy ở một số loài cây đa phôi họ cam quýt (Rutaceae) Ở các cây này khi gieo một hạt không phải chỉ nẫy ra một mam , ma cho ra nhiều mầm, các mầm này được sinh ra từ các tế bào khác nhau sẽ có số lượng nhiễm sắc thé va kiểu gen khác nhau

2 Cơ chế tạo hại và các loại phôi hạt

q) Cơ sở di truyền

- Đỗi với nhiều loài cây sinh sản “hữu tính, hạt được tạo ra Ở trong cây thông qua quá trình thụ tỉnh kép Hình 2.1 trình bay các bước trong quá trình sinh sản tạo thành giao tử

Trang 21

đực, cái và cầu tạo giải phẫu bầu nhụy của thực vật hạt kín Trong bầu nhụy có § tế bao 3 tế bào đối cực mang n nhiễm sắc thể, một tế bào trứng, hai bên có hai tế bào kèm mang n nhiễm sắc thể và một tế bào phôi tâm hai nhân thường nằm ở giữa bầu nhụy Quá trình thụ tính bình thường diễn ra, như sau: hai tỉnh tử trong ông phâ ấn chui vào bầu _nhụy, một kết hợp với tế bào trứng tạo thành hop tử, sau này hat nay mam va phat triển thanh cay mới, còn tỉnh tử kia kết hợp với hai tế bào phôi tâm, hai tế bào này có thể đã hợp nhất với nhau từ trước khi thụ tỉnh hoặc cũng có thể hợp nhất sau khi tỉnh tử thứ hai của tinh trùng chui vào xong rồi thì 3 nhân của 3 tế bào này mới cùng sat nhập vào nhau và tạo thành nhân tế bào nội nhũ mang 3n nhiễm sắc thể, hiện tượng này xây ra tuỳ loại cây trồng Tế bào phôi tâm đã thụ tỉnh sẽ phân chia nguyên nhiễm nhiều lần tạo thành mô nội nhũ chứa các chất dự trữ như tinh bột, dầu hoặc protein tuy theo cây, khi hat nay mam giai doan dau curs ca ap chất dự trữ để nuôi mam Tiểu bào tử — Hạt Tiểu bào tử n phần 2n n a n Om RHO G ch ; Ce) Thụ phấn n wenn Nhị hoa Giảm phân " Ong phan Nhân , Vò hạt phôi tâm Phôi : Nôi ội nhũ nhũ tâm Giảm phân 3n Hat Hop tu Phôi 2n 2n _ Đại bảo tử mẹ Bầu hoa

Hình 2.1 Các bước trong quá trình tạo hạt ở thực vật Bắt đầu bằng các đại bào tử mẹ _ trong g bao phan và trong noãn, quá trình thụ tình xảy ra và cuỗi cùng tạo thành hạt

Đối VỚI một số cây họ đậu như đậu tương, lạc thì nội nhũ bị teo đi do phôi phát triển mạn th va chat dinh dưỡng được tích luỹ trong các lá mầm (hình 3 xa Vỏ hạt được

Trang 22

- Vỏ quả Than mam Chéi mam Nội nhũ xa ¬ Ré mam La La mam mam Vo hat Choi © x ,=< mam Ay

Hình 3.1 Cầu tạo hạt của một số cây trồng

b) Tách phôi cây sinh sản vơ phổi

Một sơ lồi cây trông xây ra hiện tượng sinh sản vô phôi gọi là apomixis, đây-là kiêu sinh sản trong đó cơ quan giới tính hoặc những bộ phận đảm nhiệm giới tính có khả năng sinh sản và hạt được tạo thành không cân có quá trình thụ tỉnh giữa giao tử đực và cái, Các hạt này gọi là hạt vô tính Hiện tượng apomixis xây ra ở 4 tr ường hợp sau:

- Hạt phát triển từ tế bào lưỡng bội, tế bào này được tạo thành do sự kết hợp của hai tế bào đơn bội, trợ bào h hay tế bào đối cực (gọi là hiện tượng Apogamy)

- Túi phôi được hình thành trực tiếp từ một tế bào dinh dưỡng không xây ra quá

trình giảm nhiễm và tạo thành bào tử Phôi sau đó được phát triển từ trứng nhị bội

không qua quá trình thụ tỉnh (Apospory)

- Phôi có thê phát triên trực tiếp từ tê bào mẹ đại bào tử không xây ra quá trình - giảm nhiễm (Diplospory)

- Phôi phát triên trục tiếp từ một tÊ bào trứng không được thụ tỉnh (Parthenogenesis) Nếu như trong quá trình phân bào giảm nhiễm xây ra bất bình thường, số lượng nhiễm sắc thể của các giao tử trứng này không giảm, phôi vô phối sinh ra trong trường hợp này sẽ cho ra cây lưỡng bội Còn khi có quá trình phân bào giảm

nhiễm ở túi phôi xây ra bình thường, số lượng nhiễm sắc thể của giao tử giảm, nếu quá

- trình thụ tỉnh không xẩy ra, trường hợp sinh sản vô phối apomixis thuộc kiểu này sẽ cho ra cây đơn bội

Mặc dù thụ tỉnh không xây ra trong quá trình ph át triển hạt vô phối, nhưng, nguoi ta - đã kết luận rang qua trinh thu phan và sự kết hợp của một giao tử đực với tế bào phôi tâm

Trang 23

Ở một số loài thực vật hình thức sinh sản vô phối là bắt buộc, ở một số loài khác thì cả hai hình thức sinh sản hữu tính và vô tính đều đồng thời cùng xây ra ở bầu nhuy Sinh sản vô phối được phát hiện ở 30 đến 40 loài thực vật, nhiều trường hợp người ta phải nghi ngờ vì con cái giống hệt mẹ cho dù nguồn hạt phấn thế nào đi nữa Hiện - tượng v vô phối cũng do gen kiểm tra và được ứng dụng để duy' trì ưu thé lai

3 Trình tự nuôi cấy Kỹ thuật gầm:

se Trồng cây bố mẹ và tiến hành lai xa để tạo phôi lai xa, chọn hoa, xác định giai đoạn lây phôi

e Định vị phôi trong bầu nhuy tuy cay, tây t trùng bề mặt và cắt gọt lấy phần phôi, càng nhỏ và chính xác càng tốt

e Cấy đặt lên môi trường nuôi cấy thích hợp, chú ý thành phần môi trường, điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ và ánh sáng

° Cay chuyển tiếp, kích thích tạo mam, cây con va tách nuôi các mầm này trong điều kiện tối ưu

e Tang bội nhiềm sắc thê nêu cây lai xa bât dục

kỹ thuật này được áp dụng trong trường hợp phôi của cây lai xa bị chết ở giai đoạn phát triển sớm ban đầu, do vậy khi nuôi cay người ta thường phải lấy nội nhũ của cây mẹ bình thường làm đinh dưỡng để nuôi cây phôi lai Nội nhũ non bình thường của cây mẹ được đặt lên bề mặt môi trường nuôi cay, nhưng không được tiếp xúc trực tiếp với phôi lai Thỉnh thoảng người ta có thể nghiền nát nội nhũ non của cây bình thường rồi chiết lấy dich lỏng và đổ vào môi trường nuôi cấy vì chính nội nhũ non của cây bình thường này đã cung cấp những chất đỉnh dưỡng quan trọng giúp chọ phôi lai phát triển và kích thích phôi nây mầm Kruse (1974) đã áp dụng thành công phương pháp này khi lai Hordeum với Triticum Nếu áp dụng phương pháp này khi lai giữa Hordeum v6i Secale tỷ lệ thành công đạt tới 30 đến 40% so với kỹ nghệ cứu phôi thông thường chỉ đạt 1% Sau này William và De Lautour (1980) đã cải tiến kỹ thuật này bằng cách ghép phôi lai vào nội nhũ cây khoẻ được tách ra từ cây có bầu phôi phát triển bình thường, sau đó nuôi cây trong môi trường định dưỡng Phôi của cây bình thường bị nén tách khỏi nội nhũ, sau đó ghép phôi lai vào lỗ phôi cũ rồi dat vào môi trường nuôi cây sẽ phát triển cho ra cây lai xa bình thường

4 Tái sinh cây từ callus phôi lai xa khác loài

Trang 24

quả nghiên'c cứu của Lloyd (1975), ông đã nuôi, cấy lá mầm non của cây thuốc lá L] này

vào trong môi trường kích thích tao ra callus, sau đó tir callus tai sinh thành một số mầm và mầm này tiếp tục phát triển thành cây trưởng thành Có rất nhiều ví dụ tạo thành công cây |ai thông qua giai đoạn callus như ở tổ hợp lai giữa Tr Iƒolium repens và T

uniflorum boi Pandey và cộng sự (1987) Poysa (1990) khi lai Lycope rsicon voi L peruvianum đã that bại vì đã không thu được con lai nếu chỉ thông qua phương pháp

cứu phôi, nuôi cây bầu nhụy thông thường, thậm trí đã dùng đến cả biện pháp xử lý hoócmôn và chất ức chế nhiễm khuẩn, nhưng khi áp dụng nuôi cấy trải qua giai đoạn callus thì đã thành công

5 Ung dung

Khắc phục tính tự bất hợp hạt lai xa khác loài: Kỹ thuật nuôi cấy phôi có khả năng to lớn để khắc phục tính tự bất hợp của hạt lai và tạo ra con lai xa giữa các loài khác xa nhau về đi truyền, phôi lai thường bị chết ở giai đoạn phát triển sớm Trong trường hợp này cần nuôi cây phôi non kết hợp với xử lý, hoặc bồ sung GA3, chất ức chế miễn dịch

nhu L-lysine, E-amino caproic axit, v.v

Cứu phôi lai xa: Trong một số trường hợp phôi hạt bị mắt khả năng nây mầm trước khi quả chín, sự phát triển của phôi và nội nhũ bị ngừng, nuôi cấy phôi có thể khắc phục được van dé nay Skene va Barlass (1983) cho biét phdi cay bo (Persea americana) được tách ra khỏi hạt trước khi chín, nuôi trong môi trường định dưỡng có bd sung cytokinin sé kich thich tao khối mầm sau đó ra rễ và thành cây

Có rất nhiều loài cây trong hat ed đặc tính ngủ nghỉ mà phân lớn là do vỏ hạt hoặc nội nhũ gây lên, nuôi cây phôi cũng có thê khắc phục được hiện tượng nảy, thí dụ như loài hoa hỗng, táo tây, co dầu, v.v

Nuôi cấy trứng không thụ tính có thể tạo ra hạt đa mầm gồm các kiểu gen khác nhau, có cả đơn bội và nhị bội, bao gồm cả nhị bội nội nhũ chưa thụ tĩnh và nhị bội tế bảo soma Tir mam này tạo thành cây có thể duy trì được ưu thế lai nếu như lẫy bau hat nuôi cây từ cây F1 Ngoài ra ở một số loài rất khó thụ phấn trong điều kiện tự nhiên, người ta đã tiễn hành thụ phan trong ống nghiệm có “điều kiện môi trường tối ưu, sau đó

cứu phôi có thể sẽ thu được hạt lai

Sản xuất hạt nhân tạo để nhân hàng loạt những giống lúa lai, lay hat Fl để nuôi cấy Tách ra được những con cháu lai lại, từ những tô hợp lai giữa lúa trồng với lúa đại nhằm tạo những dong, tao sw da dang bất dục đực tế bào chất vì một trong những nguyên nhân gây lên tính bất dục đực tế bào chất là sự bất hoà giữa nhân của loài này

với tế bào chất của loài kia trong một cơ thể, nhân của loài lúa trồng tương tác với tế

bào chất của loài lúa đại hoặc ngược lại đều dẫn đến hiện tượng bất dục đực

Trong tượng lại, những tồn tại cần Biảt quyết trong kỹ thuật nuôi cấy phôi là cần “phải nghiên cứu và tìm ra những điều kiện tối ưu chö việc cứu những phôi lai bị chết ở

giai đoạn phát triển som

Trang 25

IV NUOI CAY PHÔI LUA CHIN VA TAI TAO CALLUS

(Phan thực hành bai 1)

Nuôi cấy tế bào soma lúa được sử dụng rộng rãi để tạo cây vô tính lúa hoặc dùng nó để tách protoplast, phục vu cho qua trinh chuyển nạp gen, xử lý gây đột biến nhân

tạo Có nhiều cơ quan lúa nếu nuôi cấy có thé tao callus dé là: 7

1 Sử dụng bạt lúa chín nuôi tạo callus

- Bóc vỏ hạt chín rồi khử trùng bằng ngâm trong dung dịch 70% ethyl alcohol trong 1 phút, sau đó ngâm tiếp trong dung dịch 45% chlorox cộng thêm 1-2 giọt tween 20 trong 30 phút

- Rửa sạch hạt 4-5 lần bằng nước cât vô trùng qua nôi hap

- Nuôi cấy hạt vô trùng này trong môi trường tạo callus, thường đùng môi tr ường

MS chứa thêm 2 mg/1 2,4-D

- Đặt trong tủ định ôn tối ở nhiệt độ 27°C

- Sau 3-4 tuân tách riêng những callus được hình thành từ nội nhũ rồi đưa lên môi trường mới đề tái sinh tiép callus

- Nuôi cây trong tủ định ôn tôi ở nhiệt độ 27C

- Nuôi cây chuyên tiêp tạo nhiêu callus ở điều kiện trên cứ sau 3-4 tuần một lần Chú ý: Trước mỗi lần nuôi cấy chỉ nên tách những callus nào có khả năng tạo phôi và tiếp tục nuôi cấy tiếp Những callus có khả năng hình thành phôi thường có mẫu hơi trắng đến vàng sáng, chắc, tương đối khô, ngược lại những callus nào không tạo thành phôi thường có màu vàng, ướt, nhữn và rời rạc

2 Nuôi cấy tạo callus dùng mô mầm (Scutellar tissue)

- Khử trùng các hạt chín đã bóc vỏ bằng cách ngâm trong dung dịch 70% ethyl alcohol trong 1 phút rồi sau đó ngâm tiếp trong dung dịch 45% chlorox cộng thêm 1-2 giot tween 20 trong 30 phút

- Kích thích hạt vô trùng nẫy mầm trong môi trường lỏng MS/N-6 có bổ sung, 0.5 mg/l] 2,4-Ð và ủ ở tủ lắc vòng tộc độ 90-120 vòng/phút

- Sau 6-7 ngày tách mô mâm từ nội nhũ và nuôi mô này trong môi trường kích

thicu tao thanh callus

Chi ý: Phân mô mâm cân phải đặt ngửa lên vì callus chỉ được sinh ra từ đây

- Sau 3-4 tuần thì chọn và cắt nhỏ các callus phôi thành c các phần nhỏ rồi cho chúng

tái sinh tiếp trong cùng môi trường trên

- Chọn lọc tiếp và nuôi lại phôi callus cứ sau mỗi 4 tuân

Trang 26

Cay chuyén sang méi trường kích thích tạo thành cây gầm: - Lây khoảng 50 mg callus đặt vào môi trường tái sinh cây

- Giữ nuôi cay trong điều kiện ánh sáng liên tục với cường độ 3000 lux và nhiệt độ

26,

- Sau 6- 8 tuần chuyển các cây tái sinh có hệ thống rễ phát triển tốt vào dụng dịch nuôi cấy Yoshida để tạo điều kiện rễ phát triển tốt và g1úp cây làm quen với điều kiện

môi trường sinh trưởng

Bảng 2.1 Thành phần và cách pha chế môi trường Yoshida Lượng cần lấy cho 4 lít Lọ Thành phần mee mẹ môi trường nuôi cấy ° (ml) A | NHANO, 914,0 5 | B_| NaH;PO;2HạO 403,0 5 C J|K;SO¿ 714,0 5 PD] cach 886,0 5 E | MgSO4.7H2,O 3240,0 5 E | Nguyên tổ vi lượng 5 MnCl,.4H20 15,0 (NH¿)s¿Mo7O¿¿.4HO 0,74 H;BO; _—— 934 4nS5O¿.7H;O 0;35 CuSQ4.5H,0 0,31 FeCh.6H,0 - — 770 Gitric axit (Monohydrat} 19,0 | PH ,0

- Giữ cây “tiếp trong phytotron ở nhiệt độ 29° C ban ngay va 21°C ban đêm dưới điều kiện ánh sáng và quang chu kì tự nhiên

- Sau một tháng chuyển cây vào chậu có đất vô trùng - Nuôi cây trong nhà kính đến trỗ và chín

3 Nuôi tạo callus sử dụng hoa non

Trang 27

- Khử trùng dong như đã sử dụng khử trùng đôi với hạt - Rua bang nước cất vô trùng 4-5 lân

- - Tach hoa ra khoi bẹ lá dưới kính hiển vì

- Nuôi hoa trong môi.trường kích thích tạo callus, để có kết quả tốt nên dùng những đòng hoa có kích thước 0,5 - 2,0 em

- Sau 3 tuân chuyên callus tạo phôi đến môi trường kích thích tạo callus mới cho tái sinh

- Chọn và nuôi cây tiếp những callus tạo phôi sau mỗi 4 tuần

- Giữ callus trong điều kiện bóng tối ở nhiệt độ 27°C

- Chuyên theo quy trình nuôi cấy tái tạo cây như trên 4 Nuôi cấy phôi non

: Cat lay các bông lúa sau trỗ 7-10 ngày vào giai đoạn chín sữa

- Bóc tách và khử trùng các hoa bằng cthanol 70% trong 90 giây, rôi rửa 2 lần bằng

nước cất vô trùng : "——

- Khử trùng các hoa một lần nữa băng dung dịch 50% cholorox chứa 1-2 giọt tween 20 trong thời gian 50 phút trong điều kiện chân không, sau đó rửa 3 lần nữa băng nước cat

- Tách phôi ra khỏi hoa, cần thận cắt phan phôi gôm cả hai vỏ trâu ngay đề hoa - Dùng cạnh dao ân nhẹ hoa dé phôi tÒI Ta

- Nuôi phôi trong 1 môi trường kích thích tạo callus và giữ chúng ở nhiệt độ 27°C trong bong tdi

- Sau 3-4 tuần chuyển callus đến môi trường tái sinh callus mới

- Cứ sau mỗi 4 tuần lại chọn và nuôi cấy những callus nào thành phôi - Chuyên sang các bước nuôi cấy nhằm tái sinh cây như trên

Š Nuôi tái sinh cây

Thành phần của môi tr ường tái sinh cây thường dùng là môi trường có hàm lượng muối cơ bản của 3 môi trường N-6, MS hoặc R2, bể sung 3% đường sucrose hoặc maltose, 1-3 mg/l kinetin, 1 mg/l NAA (napthalene acetic axit) va 0.8% agar

_V NUOI CAY BAU NHUY VA NOAN

1 Nội dung

Trang 28

tách ra và nuôi cây gặp rất nhiều khó khăn, hơn thế nữa nuôi cây phôi non đòi hỏi yêu cầu đinh dưỡng khắt khe hơn nhiều so với nuôi cây phôi lớn Để khắc phục vẫn đề này người ta đề xuất kỹ thuật nuôi cấy bầu nhụy Kỹ thuật này bao gồm việc tách bầu nhụy sau khi hoa thu phan được 2 - 15 ngày, tuỳ tổ hợp lai, tách cánh và đài hoa, chỉ nhị cũng bị loại bỏ, sau đó nuôi cay chúng trong môi trường đinh dưỡng Trước khi nuôi cấy cắt một phần đáy của cuống bầu nhụy sau đó đìm chỗ cắt vào môi trường dinh dưỡng, môi trường dinh dưỡng rất đơn giản chủ yếu là các muỗi vô cơ Tuy nhiên nếu thêm auxin, cytokinin, dịch chiết nắm men và casein hydrolysate thì có thể sẽ hỗ trợ bầu cắt rời này tiếp tục sinh trưởng trong quá trình nuôi cấy Sau khi phôi lớn có thể quan sát thấy thì chúng được tách ra và cấy trên môi trường dinh đưỡng nhằm thu nhận cây lai kỹ thuật tương tự như các bước nuôi cấy cứu phôi như đã trình bây ở trên Áp dụng phương pháp này người ta đã thu được rất nhiều cây lai khác loài như giữa Brưssica campestris với B oleracea (nomata, 1978), giữa B migra X B oleracea (Sarla và cộng sự 1988), giữa Diplotaxis erueoides với B napus (Delourme 1989) Moricandia arvensis X B oler'dcea (Takahata, 1990) Inomata (1978) da tach bau nhuy s sau thụ tỉnh 4 ngày của tổ hợp lai gitta Brassica campestr is v6i_ B oleracea rồi nuôi cấy trong môi trường đinh dưỡng của White chứa muối khoáng, vitamin và casein hydrolysate Sau 36 ngày nuôi cấy các phôi được tạo ra từ bầu này được tách ra và nuôi cấy trong cùng môi trường, cùng điều kiện tương tự sau đó cây con được chuyển ra đất Tương tự như vậy, Takahata (1990) đã tạo thành công cây lai giữa A#oricandia arvensis v6i Brassica oleracea théng qua nudi cay bau nhụy sau thụ phấn 3-8 ngày được cấy trên môi trường MS không có hoócmôn Phôi từ các bầu này được tách ra sau khi nuôi cấy bầu 3-4 tuần sau đó lại cấy chuyển vào cùng một môi trường, phôi không phát triển được thành cây con, người ta đành phải cất thân mầm và nuôi cấy cuối cùng đã tạo được cây lai

2 Cấu trúc giải phẫu và thành phần tế bào bầu nhụy

Bầu nhụy là thành phan quan trọng và là để của hoa, sinh trưởng phát triển cùng với hoa Khi phân hoá hoa bên trong bầu nhụy có chứa (các) tế bào mẹ đại bào tử, tế _ bao nay trai qua qua trinh phan chia giảm nhiễm liên tiếp 2 lần tạo thành một dãy 4 tế bao đơn bội xếp thành hàng Sau đó 3 tế bào chết đi còn lại một chiếc, tế bào n nhiễm sắc thể này phan chia nguyên nhiễm liên tiếp 3 3 lần để thành 8 tế bào đơn bội có đặc điểm đi truyền giống hệt nhau Hai chiếc nằm ở tâm có thể được sát nhập nhau trước khi thu tinh, cap nay khi thụ tỉnh kết hợp với tỉnh trùng tạo thành nội nhũ chứa chất dự trữ nuôi hạt Như Vậy các té bào trước thụ tỉnh trong bầu nhụy bao gồm:

- 3 tế bào đối cực và l tế bảo trứng nằm giữa 2 trợ bảo đều mang n nhiễm sắc thé và 2 tế bào phôi tâm có thể cũng mang n nhiễm sắc thể nếu chúng chưa nhập vào nhau còn nếu nhập vào nhau thì thành 1 tế bào mang 2n nhiễm sắc thể

et Té bào đỉnh dưỡng thành bau nhuy, vòi nhuy mang 2n nhiễm sắc thé; ó đặc điểm ` `

di truyén hoan toan giống mẹ ˆ

Trang 29

28 Truong hop ngoai lệ xây ra như không phân chỉa giảm nhiễm, đột biến tăng bội xây ra thì cầu trúc di tr uyễn của các loại tế bào sẽ khác di

Về nguyên tắc tất cả các tế bào trên đều có khả năng tạo thành phôi, tuy nhiên phôi xuất xứ từ loại tế bào nào thì sẽ có đặc điểm di truyện t tương ứng,

3 Nuội cấy noãn (Ovule) - ộ ¬ `

Giống như nuôi cấy bầu nhụy, nuôi cấy bầu phôi cũng có mục đích nhằm khắc phục những cán trở sinh trưởng của hợp tử ở giai đoạn phát triển sớm Cách thức tiến hành như sau, bầu nhụy được tách ra sau khi thụ phấn ] - 12 ngày tuỳ loài cây, khử trùng bề mặt, cắt tách và gọt bỏ vỏ phôi bằng đao vô trùng Chọn đúng vị trí bầu phôi đã được thụ tỉnh rồi lay ra, đặt lên môi trường nuôi cấy, sự sinh trưởng bầu phôi biểu hiện bằng sự thay đổi về kích thước và giai đoạn phát triển của phôi và nội nhũ bên trong wvioi trường dinh dưỡng nhìn chung chứa muỗi vô cơ, auxin và eytokinin, trong một số trường hợp chứa phức hợp các chất sinh trưởng nhằm kích thích sự phát triển của phôi như nước dừa, casein hydrolysate, dịch chiết xuất nấm men

Bằng phương pháp này, người ta đã tạo được rất nhiều cây lai khác loài như giữa Abelmoschus, Lolium với Festuca, va gitta Nicotiana, Impatiens, va gitta Gossypium với Brassica (Stewart 1981) Bong là một ví dụ điển hình về sự thành công của phương pháp này, người ta đã tạo được rất nhiễu cây bông lai khác loải Stewart va Hsu (1978) da nudi cay tui phôi sau hoa nở 2 - 4 ngày, sau 8 - 9 tuần nuôi cấy, tất cả những túi phôi không nây mầm được tách ra và phôi nuôi cây chuyển sang môi trường kích thích tạo cây con Day thường gọi là kỹ thuật nuôi cấy phôi - bầu phôi nhăm khắc phục tính tự bất hợp trong con lai giữa loài bong nhị bội chứa genome A với lồi bơng tứ bội chứa genome AD Théng qua nudi cấy bầu phôi hàng loạt các cây lai giữa các lồi bơng khác _ nhau được tạo ra như: giữa Gossypium hirsutum voi G- cust} ‘ale, G barbadense véi G australe và giữa Œ arborreum với G australe Nudi cay bau phôi còn được áp dụng thành công trong lai.xa giữa loài cây trồng và loài dại như ở thuốc lá Micotiana tabacum lai với ba loài dại M nesophila, N stocktonii và N repanda, ở đậu tượng (Reed và Collins 1978) Atsumi (1980) d& phat hién thay rang dé tao ra duoc cây mpafien lai giữa loài thì cứu phôi chỉ thành công khi sử dụng phôi đã phát triển hoàn chỉnh đem nuôi cây, trong khi đó nuôi cấy bầu phôi thì có thê dùng phôi non hơn nhiều Lý do tại sao để cứu (cay lai xa lai thường dùng nuôi cấy bầu nhụy hoặc bầu phôi dễ thành công hơn nuôi cây phôi thì vẫn chưa rõ Có điều phôi phát triển trong bầu phôi có thê có môi trường vật lý hoặc hoá học thuận lợi dé phat triển hơn là phơi ni cây ngồi bầu nhụy Cũng có thể là do mô trong bầu nhụy và bầu phôi có một số chức năng cung cấp dinh dưỡng và bảo vệ phát triển của phôi bên trong

4 Thụ tinh in vitro

Trang 30

tỉnh và hạn chế hiện tượng hợp tử chết ở giai đoạn phát triển sớm Kỹ thuật này bao gồm cả các khâu thụ tỉnh trong im vio sau đó nuôi cấy bầu nhụy đã thụ tỉnh để tạo thành bầu nhụy chín là một hướng có triển vọng có thể tạo ra những biến dị cận giới tính hoặc lai tế bào soma Stewart (1981), Tilton và Russell (1984) đã đề xuất việc sử dụng kỹ thuật này để khắc phục hiện tượng bất hợp nham tao con lai xa

Có nhiều phương pháp khác nhau như Kanta (1962) đã cắt cả bầu và vòi nhụy của cay Papaver somniferum ra rồi đặt nuôi trên môi trường đỉnh dưỡng khoảng từ 24 đến 48 giờ, sau đó rũ hạt phấn lên vòi nhụy VỀ sau có tất nhiều tác giả khác cũng đã áp dụng phương pháp này, tuy nhiên kỹ thuật này chỉ được áp dụng đối với một số ít loài lai xa Dhaliwal va King (1978) đã tiến hành lai giữa ngô với nøô, giữa ngô với Zea mexicana, họ cắt nhụy cây ngô và cấy bầu nhụy này trên môi trường nuôi cấy sau đó rũ hat phân của Zeœ mexicana lên đã thu được 5% kết hạt Tuy nhiên sử dụng môi trường nào, thành phần dinh dưỡng và hoócmôn ra sao cũng như điều kiện ngoại cảnh khi thụ tính nhân tạo có ý nghĩa quyết định cho sự thành công của phương pháp Trong khi đó dùng phương pháp này đối với hạt phần cây lúa miễn lai với ngô thì không cho ra hạt, trường hợp này lai trực tiếp lại cho kết quả tốt hơn Slusarkiew ez-jarsina va Zenkteler (1983) da thanh cong khi thu tinh va lai in vitro gitta thuédc 14 (cay me) voi bé la NV knightiana, N stocktonii va N Repanda

vi CAY DON BOI VA NUOI CAY BAO PHAN

1 Cây đơn bội và đặc điểm đi truyền

Cây đơn bội là cây có số lượng nhiễm sắc thể trong tế bào dinh dưỡng chỉ có một nửa (n) so VỚI cây bình thường 2n Như vảy trong cây đơn bội, mỗi chiếc nhiễm sắc thể tương đồng chỉ tồn tại một chiếc, hay một locus øen đơn chỉ tồn tại một alen Tr ường hợp cây bình thường 2n không phải là 2x os là bộ nhiễm sắc thể cơ ban) ma 1a 4x, 6x thi mỗi nhiễm sắc thể tương đồng còn có thể có một vài chiếc gần tương đồng khác cùng, tồn tại Khi phân bào giảm nhiễm có thể có xuất hiện phép cặp trao đổi chéo và có thé sinh ra được giao tử dẫn đến mức độ bất dục g giảm đi Chính do cơ sở tế bào này mà cây đơn bội có những đặc điểm sau:

- Cây đơn bội thường có nhiều tính trạng giống với cây lưỡng Đội nguồn bình thường nhưng bé nhỏ hơn từ kích thước tế bao đến bộ phận cơ quan do số gen và liều lượng sản phẩm gen giảm nhiều Chúng có sức sống yếu và có những nét đặc thù riéng vì các gen lặn ở trạng thái đơn bội được thể hiện ra kiểu hình Cây đơn bội có nguồn gốc từ cây giao phần chéo thường có sức sống yếu hơn từ cây tự thụ Các cây đơn bội

bất dục mạnh đo phân chia giảm nhiễm xây ra không bình thường cá biệt tao ra cac giao tử không phân chia mang n nhiễm sắc thể

Cây đơn bội nếu được lưỡng bội hoá sẽ tạo thành cây có kiểu gen đồng hợp tử ở tất cả các gen dẫn đến các tính trạng thuần chủng, điều này có ýn

ngắn quá trình tạo dòng thuân phĩa to lớn trong việc rút © “Nếu tác động đột biến vàơ cây đơn bội sé phat hiện được ngay đột biến, sau đó nếu -lưỡng bội hoá sẽ được dạng đồng hợp: tử \ về gen đột biến \ và dé dang duy tri thông qua

sinh sản hữu tính.” vĩ

Trang 31

2 Các hướng tạo cây đơn bội

se Thu từ các dạng sinh sản vô phối, hiện tượng đa phôi ở thực vật, các té bao thi phôi đơn bội (té bao’ đối cực, trợ bào), hiện tượng sinh sản phụ sinh xây ra trong tu nhiên với tần suất rất thấp, khác nhau ở mỗi loài Tạo cây đơn bội từ các tế bào đơn bội trong bầu nhụy không thụ tỉnh có thể được tăng cường bang cach: -

- Chiếu xạ hạt phấn nhằm g giết tỉnh trùng sau đó thụ cho nhụy c Cái

- Thụ bằng hạt phần của cây khác loài để kích thích bào tr ứng phát triển

- Dung chat kích thích sinh trưởng, hoặc hoá chất làm bất dục hạt phần còn nhụy

van phat trién binh thường, tạo thành hạt đơn bội

s Thu nhận cây đơn bội từ các cây lai xa khác loài, vì trong các cây này có xây ra , hiện tượng loại trừ nhiễm sắc Các cây thu nhận được trong trường hợp này thường là đơn lệch bội e Nuôi cấy bau, túi noãn trước và ngay sau khi thụ tỉnh xây ra cũng là những biện pháp hữu hiệu nhằm thu được cây đơn bội

e Nuôi cây tiểu bào tử, hat phan va bao phan hién được coi là phương pháp được áp dụng rộng rãi nhất dé tạo ra cây đơn bội

3: Nuôi cấy bao phần , “ở

a /

Nuôi cấy bao phần là kỹ thuật nuôi cấy a Ì in viro bao phân chứa các bào tử hoặc hạt

phan-: chua chín, trong môi trường đỉnh dưỡng nhất định nhằm mục dich iao cay don bội Sau đó số lượng nhiễm sắc thể của các cây đơn bội này được lưỡng bội hoá lên bằng thủ thuật thích hợp để tạo ra cây lưỡng bội đồng hợp tử hoàn toàn gọi là cây nhị bội hố Ni cấy bao phấn được ứng dụng rộng rai và có hiệu quả trong việc tạo ra các dong, giống thuần ở cây tự thụ phan vì đã rút ngăn được thời gian tạo ra một giống mới rong phương pháp tạo giống thuần kinh điển người ta thường bắt đầu bang viéc lai giữa các bố mẹ có những tính trạng mong muốn, cho tự thụ liên tục các quân thể phân ly từ F2 _ đến F7 để tạo ra các dòng thuần sau đó hoặc song song tiễn hành chọn lọc dòng thuần tốt

Làm như vậy phải chờ mất ít nhất từ 7 đến 8

đời (vụ, năm), trong khi đó nuôi cấy bao B

phần trong môi trường nhân tạo sẽ tạo ra

nhiều dòng thuần ngay từ năm đầu đời FI Hình 4.1 Hai hướng tái sinh khi

Trang 32

Nuôi cây bao phấn tạo giống thuần mới đã được ứng dụng thành công ở lúa mì, lúa nước, thuốc lá Riêng lúa nước đã có trên 100 giống và dòng thuần được tạo ra ở Trung quốc thông qua nuôi cấy bao phân đó là các giống Huayu- 1, Huayu- 2, Tanfong 1, Xin Xiu, Nakamura (1974) đã tạo được nhiều đòng thuốc lá có triển vọng từ nuôi cấy bao phấn các dòng này có khả năng chong chịu bệnh héo rũ vi khuẩn tốt hơn và có chất lượng Smok trung bình so với các giỗng khác Đối với lúa, gen P¡-z¡ chống đạo ôn của giống Toride No.2 đã được chuyển sang một giống địa phương mắt có hai năm thông qua con đường nuôi cấy bao phan, két qua tao ra gidng Zhong Hua 8, Zhong Hua 9, Huayu-1 va Huayu- 2, từ khi lai đến khi công nhận giống mới chỉ mất có 5 năm Huayu-Ï có năng SUẤt cao, chống bệnh bạc lá và có khả năng thích ứng rệng còn Xin Xu thì dược trồng trên 10.000 ha ở phía Đông Trung Quốc Lee và cộng su (1989) đã tạo được giống lúa Japonica Hwacheongbyco thong qua nuôi cấy bao phấn cây F1 của tổ hợp lai giữa Suwecon 298 với Milyang 64 Giống này chống được ray nau, đạo ôn, bạc lá lúa và trồng được ở vùng đồng bằng và vùng biển Tây Nam Triều Tiên

4 Kỹ thuật

Kỹ thuật nuôi cấp bao phẫn

ø Trồng cây cho bao phần, cây F1 hoặc F2, chọn hoa (giai đoạn 1-2 nhân) dựa vào

chiều đài đòng

ø Khử trùng bê mặt mâm hoa chưa mở hoặc những hoa còn non

e Tach cdc bao phan, dat nudi cấy trên môi trường chứa agar trong đĩa Petri hoặc ống nghiệm thuỷ tỉnh, chọn môi trường nuôi cấy đúng, có thể được thả vào môi tr ường lỏng

e Diéu chinh điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, ánh sáng cho tái tạo callus hoặc nếu chọn được thành phan môi trường nuôi cấy thích hợp có thể sẽ cho ra cây con trực tiếp qua phôi hoặc gián tiếp thông qua callus Phôi được tạo thành thường do qua.trinh phan chia của các bào tử và khi được nuôi cấy trong điều kiện thích hợp có thể phát triển thành cây con sau 4-6 tuần Cây con sau đó được chuyển đến nuôi cay trong môi trường thích hợp sẽ cho ra rễ và lá, sau do qua g giai đoạn tôi luyện cây con trong điều kiện khó khăn roi dura ra trong ngồi đất vơ trùng Nếu như phải qua giai đoạn callus thì callus chuyển đến nuôi cay trong môi trường tái sinh cây dé kích thích hình thành và thu được cay | con sau 4-§ tuần Cây con này chuyên đến môi trường nuôi cấy mới để kích thích ra rễ và phát triển chồi rồi sau đó trồng ra đất vô trùng Một số bao phần của một số cây khi nuôi cấy chỉ cho ra callus, không cho ra cây con (Plantlets là cây chỉ có lá khơng hồn chỉnh _ và thân, chưa ra rễ), trong trường hợp này không có ý nghĩa trong chọn tạo gidng

° Lưỡng bội hoá cây con đơn bội băng xử lý colchicine Cay con thu được thông qua nuôi cấy bao phan thường là cây đơn bội, để sử dụng được trong chọn giống thì chúng ta phải lưỡng bội hoá thành cây lưỡng bội, thường bằng phương pháp xử lý Colchicine, Không phải tất cả các cây được tạo thành-từ nuôi cấy bao phấn dều là: cây đơn bội: Khi nuôi cấy bao phấn thường sản sinh ra callus don bội hoặc phôi soma được

Trang 33

_ sinh ra từ mô giao tử, bởi vì những mô giao tử cũng có thể trở thành mô lưỡng bội bằng

cách tự lưỡng bội hoá nhiễm sắc thể, phôi hoặc cây tạo ra từ mô này sẽ là lưỡng bội

Callus hoặc phôi lưỡng bội cũng có thể được sinh ra từ tế bào vỏ bao phan lưỡng bội cho nên sau này cũng có thể cho ra cây lưỡng bội Chính vì thế mà quần thể cây được tạo ra thông qua nuôi cây bao phấn thường bao gộm cả cây đơn và lưỡng bội hoặc thậm

chí cả cây đa bội, hoặc lệch bội :

Kỹ thuật nuôi cấp bao phan lia do M Terzi va cộng sịt để xHẤI năm 1995 (phan thực hành)

~ Trồng cây F1 cho bao phan trong nhà kính, dùng bông chính có khoảng cách từ đầu bông đến gối lá đòng đài từ 5 - 10 em tuỳ giống và kiểu gen Chọn những bông như vậy thì bảo tử hạt phấn có thể đang ở giai đoạn 1-2 nhân (tương đương bước 4-6 phân hoá đòng), đây là giai đoạn nuôi cấy bao phần có hiệu quả nhất Để xác định chính xác giai đoạn phát triển của hạt phân tốt nhất nên nhuộm bao phan bằng 2% acetocarmine rồi quan sát Sau đó bông lúa được phun khử trùng bằng 70% ethanol rồi xử lý ở nhiệt

độ §C trong thời gian § ngày _ "

- Kích thích tạo callus: Những hoa được chon khử trùng bằng nước sát trùng chứa 5,2% NaOCl trong thời gian 20 phút Sau đó tách lay bao phần rồi đặt vào mỗi đĩa petri Falcon, vô trùng, kích thước 60 x 15mm, chứa môi trường tạo callus khoảng 90 hao phấn, rồi để trong tủ tối có nhiệt độ 25°C Thường xuyên quan sát sự hình thành callus của các bao phân trên đĩa petri này sau cây 2 - 8 tuân cho đến khi thây tạo được callus

- Tái tạo cây và chăm sóc cây con, những callus nào hình thành phôi dài ít nhất 2 mm được chuyển vào bình tam giác chứa môi trường tái sinh cây và giữ trong thời gian khoảng 4 tuần dưới quang chu kỳ 12 giờ chiếu sáng/ngày và cường độ ánh sáng đèn nêông 3000 lux ở nhiệt độ 25°C Sau đó cây con lại được chuyển vào bình tam giác chứa cùng môi trường tái sinh cây trên để kích thích phát triển ra rễ và mầm cũng trong điều kiện cường độ ánh sáng 3000 lux và thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày Cây con nào có rễ khoẻ thì được chọn và chuyển đến bảng xốp có lễ rồi đặt trên khay nhựa chứa môi trường nuôi cấy Yoshida, đặt tròng buồng khí hậu nhân tạo có nhiệt độ ban ngày 29°C, ban đêm 21°C, quang chu kì bình thường từ 9-10 g1ờ/ngày Cây lớn được chuyển trồng

vào chậu vại có đất và phân bón với tỷ lệ 3g 6NH.»;SO¡, 2,5ø P¿O; và 1,5g K;O Khi

hoa nở bao cách ly từng bông để tránh giao phan

5 Nhiing yéu t6 anh hưởng đến kết quả nuôi cấy bao phấn

Kết quả nuôi cây bao phấn phụ thuộc cả vào kiểu gen lẫn điều kiện môi trường khi

nuôi cây :

_ 8) Loài cây trắng và kiểu gen

Trang 34

rộng cho các loài cây khác, tuy vậy thu được những kết quả rất khác nhau Nuôi cây bao phấn lúa các giỗng thuộc loài phụ Japonica (thậm chí cả trường hợp không cần xử lý lạnh trước) đều đạt tỷ lệ thành cây thường cao hơn nuôi cấy các giống thuộc Indica Chen và Lin (1981) còn thấy rằng ty 18 bao phan tao callus, kha nang callus tai sinh thanh cay, ty lệ cây xanh/eay bach tang (albino) va sé lượng nhiễm sắc thể của cây tái sinh đều có liên quan đến kiểu gen của cây cho bao phan cay Diéu nay chứng tỏ khả năng nuôi cấy bao phần lúa cũng do gen điều khiến, đối với những giống phản ứng tốt có thé chứa nhiều gen tác động lên quá trình này Do vậy để tăng hiệu quả nuôi cây có thể bằng cách lai tạo nhằm cải tiến giống Thí dụ ở khoai tây kiểu gen phản ứng tốt có thể thu được bằng cách lai giữa kiểu gen phản ứng kém với kiểu gen phản ứng tốt Đồng thời phải thay đổi điều kiện và môi trường nuôi cấy theo từng loại cây trồng, thậm chí

cho từng giống cây trồng trong một loài b) Giai đoạn phát triển bao phần Giai đoạn phát triển của gar

hat phan tai thoi diém tách 4 rp)

roi ra va nudi cấy cũng có up? @)

ảnh hưởng rất quan trọng đến kết quả nuôi cấy Rất nhiều loài cây trồng, tỷ lệ cho cây con cao nhất thường

8, al

ĐÓ

, : ar Ấ Giai đoạn4 Tiềnđơn Dơnnhân Đơn nhân Hạt phan nguyên Giai đoạn thu được: khi nuôi cay bao té bao nhân giữa muộn phan thứ nhất — hai tế bảo

phan ở giai đoạn trƯỚC VÀ _ Các giai đoạn 1 2 3 4 5

sau phân chia bào tử lần đầu

(hạt phan 1 - 2 nhân, khi hạt

phân hình thành không bào

lớn, một nhân năm ở một

phía của bào tử), bao phần càng gia tỷ lệ thành cây càng thấp và tỷ lệ cây bạch tạng lại tăng (hình 5.1) Quá trình phát triển hạt phấn giai đoạn 1-2 nhân ở cây 2 lá mầm (A) va cay cải dầu B) Một số yếu tố khác hỗ trợ có thể ø gây lên sự thay đổi về giai đoạn phản ứng tối ưu, ví dự đối với lúa giai đoạn phản ứng tốt tối ưu là trước và giữa g giai đoạn hạt phan một nhân trong điều kiện nồng độ đường trong môi trường nuôi cấy tăng từ 6 đến 9% (Chen, 1978) Cay Hyoscyamus ‘niger, nêu không xử lý lạnh trước thì giai đoạn phản ứng tốt nhất là trước và giữa hạt phân một nhân, còn bào tử ở giai đoạn phân bào giảm nhiễm 1 và giai đoạn 2 nhân thi hồn tồn khơng có phản ứng gì Nhưng khi xử lý mầm hoa lạnh đột ngột ở nhiệt độ 7°C trong 14 ngày thi hat phan & giai doan 2 nhan lai cho kết quả tốt nhất, mặc dầu bao phần chứa bào tử giai đoạn trước và giữa giai đoạn một nhân vẫn biểu hiện kết quả tốt Dé xác định từng giai đoạn phát triển của hạt phân hiện có nhiều phương pháp khác nhau như nhuộm mẫu rồi soi kính hiển vi nhưng

Hình 5.1 Quá trình phát triển hat phan trong co thé cây ngũ côc (A) và một số thực vật 2 lá mầm:

thuốc lá và cây cải dầu (B)

phương pháp đơn: giản nhất đà (1) Dua vào khoảng cách giữa lưỡi lá đồng và lưỡi lá 7 cạnh lá đòng va (2) Dua vào mâu sắc và kích thước hoa lúa,-nhiều tác giả khuyên nên

Trang 35

c) Diéu kiện sinh lý cây cho bao phân

- Chen va Lin (1976), Chen va T say (1984) cho rang bao phan nào được lấy ở những bông trỗ sớm thì cho kết quả nuôi cây tốt hơn bao phan lay ở bông trỗ muộn Tỷ lệ tạo callus ở bao phần lấy từ nhánh cấp 3 3 thấp hơn bao phan lay 6 nhanh me, nhanh cap lLvà

cấp 2 (bang 3.1) sr ee

Ly do bao phan ty nhanh cap 3 cho hiệu quả nuôi cấy kém hơn có thé là vì những nhánh này thiếu đinh dưỡng, tuy nhiên không có sự sai khác rõ rệt giữa những hoa ở các vị trí khác nhau trên một bông Ảnh hưởng của quang chu kỳ, cường độ ánh sáng, nhiệt độ lúc trồng cây cho bao phân cũng đã được nghiên cứu Có sự khác nhau rõ ràng giữa nuôi cây bao phấn lấy từ các cây trồng ở các tháng khác nhau trong năm, theo Ych và Tsay (1987) thì tỷ lệ % tạo callus của bao phan lấy từ cây trỗ từ tháng 4 đến tháng 12 biến động từ 27 đến 42% Nếu bao phấn lây vào tháng 2 lúc nhiệt độ xuống 15C sẽ không có khả năng tạo callus Biên độ nhiệt độ đêm/ngày khi trồng cây cho hại phan thấp 159C/20°C có ảnh hưởng nghiêm trọng hơn là ở nhiệt độ cao 30°C - 35°C, dac biét - là ở giai đoạn sinh trưởng sinh thực, phân bào giảm nhiễm Vì nhiệt độ thấp đã ức ché việc hình thành bào tử gây lên sự phân chia bất bình thường của lớp tế bảo thành bao phan (tapetum) Nhìn chung, cây nào sinh trưởng khoẻ, trong điều kiện môi tr ường dinh dưỡng tối ưu, có cường độ ánh sáng Thạnh thường cho bao phân có tỷ lệ thành cây cao Theo Cowen và cộng sự (1992) cho rằng ở ngô có 2 cặp gen lặn chính tương tác VỚI nhau và hai gen phụ khác có tác dụng nhỏ điều khiển phản ứng cho kết quả nuôi cây, hạt phan Phan tich RFLP cho thay hai gen chinh nay nằm trên nhiễm sắc thể số 3 và số 9 Từ kết quả nghiên cứu này khẳng định rằng có thể chuyền các gen này vào các giống tốt để tăng hiệu quả của nuôi cấy bao phan Tuy nhiên, hướng tương lai không nên chọn những kiểu gen chuyên phản ứng chặt với nuôi cấy bao pha an

Bang 3.1 Anh hưởng của tuổi cây đến việc hình thành callus trong nuôi cấy bao phan 2 giống lúa họ phụ Japonica (Chen và Tsay, 1984) ` Giống Tainung 67 Giống Tainan 5 Nguồn cho : ; ———T :

bao phấn - SỐ bao phân | Tỷ lệ bao phân Số bao phan Tỷ lệ bao phấn Đó nuôi cây tao callus (%) | nuôi cây tao callus (Yo)

Nhanh chinh 856 42,8a 958 23,1a

Nhánh cấp 1 885 44.6a 749 22,4a

Nhánh cấp 2 892 40,6a 86A 23,4a

Nhánh cấp 3 776 — 32//b 889 - 16,0b

_Môi trường tao callus là MS có bể sung 4mg/l NAA va 2 mg/! kinetin

d) Xw ly cay truéc khi cho bao phan

Vai trò xử lý mam hoa ở nhiệt độ thấp đầu tiên được Nitsch và Noreel (1973) tiến

hành đôi với cây Datura innoxia, sau đó được rât nhiêu tác giá khác khăng định lại:

Trang 36

(Sunderland 1978, Sunderland va Roberts 1979; Huang and Sunderland 1980, 1981 va Bajaj 1983, 1990) Hiệu quả của xử lý trước nhiệt độ thấp đến việc hình thành callus và cây con đã được nghiên cứu bởi một số tác giả về một số phương pháp xử lý (bảng 4 )

Bang 4.1 Các điêu kiện xử lý lạnh khi nuôi cấy bao và hat phấn lúa 5 ` y le c ariel : mMlO ve) Tài liệu tham khảo Bông 10 2 Wang và cộng sự (1974) Bông 10-13 | 10-14 | GenovesivàMagil(199) 7

Bông 7 3 Chalef và Stolarz (1981) |

Bông 2-4 2 Cornejo-Martin và Primo-millo (1981)

Bao phan da g 4 Hu ef al (1978)

duge nudi cay

được nuôi cấy 8 8 | Zapata er al (1982)

Béng 10 10-15 | Cheneral (1982) - —

Bông có lá cờ ˆ 8-10 7 Tsay va Chen (1984)

Bông có lá cờ 7-8 7 Lin va Tsay 1984 :

Bông có lá cờ 10 7-28 | Tsay ef al 1988

Tat ca cac phương pháp xử lý trên đều cho kết quả tốt, tuy nhién tốt hơn cả là theo

phương pháp của Genovest và Magill (1979) đã xử lý bông còn năm trong bẹ lá ở nhiệt độ 10 hoặc 13°C trong 10 - 14 ngày Tsay và Chen (1984), Lin Tsay (1984) phat hién ra rang nhting hạt phấn được xử lý lạnh đột ngột 8-10°C trong 7 ngày tao ra nhiéu callus hon 2 lan la không xử.lý, tuy nhiên kết quả không khác biệt mấy khi xử lý lạnh bao phan đã cây trên môi trường Thời gian xử lý lạnh đài (8-15 ngày) tỏ ra tốt hơn 2- 4 ngày Tuy, nhiên nếu kéo dài quá trên 15 ngày lại ức chế quá trình hình thành callus (Chen và cộng sự 1982), ngược lại xử lý nhiệt độ quá thấp 4°C lại là nhiệt độ lạnh quá mức Theo Lin và Tsay (1984), Tsay và cộng sự (1988) thị callus hình thành từ bao phân được xử lý lạnh sẽ tạo ra nhiều cây đơn bội và ít cây lưỡng bội hơn là từ bao phân - không xử lý, điều kiện lạnh đã kích thích việc tạo callus sớm và khả năng tái sinh thành - cây cao Các ø giống khác nhau đòi hỏi điều kiện xử lý có khác nhau trạng thái sinh lý và giai đoạn phát triển của bạt phân cũng có ảnh hưởng đến hiệu quả của xử ly Tsay và cộng sự (1988) thấy rằng khả năng hình thành callus được tăng đôi khi xử lý bao phấn chứa bảo tử ở giai đoạn giữa và cuỗi một nhân trong 7- 14 ngày, qua 14 ngày thì tý lệ cây xanh giảm Ngoài ra một số biện pháp xử lý kh nắc như xử lý nhiệt độ cao, hoặc đặt ~ bong Tha trong nước ở nhiệt độ trong phòng thấy cũng có ảnh hưởng điều này có thể có

Trang 37

thì nhiệt độ lạnh đã định hướng lại sợi tơ vô sắc trong phân bào nguyên nhiễm lần đầu,

kết quả tạo ra 2 bào tử hay 2 tế bảo có nhân cân bằng, những bào tử này có khả năng tái

sinh thành phôi cao hơn là những tế bào có cả nhân phát sinh và phát triển T uy nhiên nhiều tác giả khác (Sunderland, 1980) lại phản đôi giả thuyết nay trong trường hop đói _ với lúa, vì cho rằng trước khi xử lý thì hầu hết các bào tử đã qua giai đoạn phân bảo s

nguyên nhiễm 1, ông g giải thích có thể do xử lý lạnh đã làm chậm quá trình già hoá của bào tử Gần đây nhất người ta cho + Tăng xử lý lạnh không những làm ngừng hoạt động một số gen hoặc ức chế chức năng của sản phẩm gen (enzym chịu trách nhiệm phát triển giao tử) Những bào tử được xử lý ít phân hoá và chuye én thanh hướng phát triển bảo tử thể có 2 nhân cân bằng

é) Thanh phan méi trường

’

Môi trường nuôi cấy đóng vai trò rất quan trọng làm tăng hiệu quả nuôi cấy Thành phần tối uu cua môi trường tuỳ theo cây trỗng thậm chí tuỳ theo cả kiểu gen Một số cây yêu cầu môi trường nuôi cấy rất đơn giản chỉ cần chứa đường và một số muối khoáng cần thiết là đủ, một số cây khác lại yêu cầu thêm cả auxin và cytokinin vào môi trường trên mới cho kết quả

"Nhiều nghiên cứu cho rằng nếu nồng độ ion NH," trong môi trường cao sẽ ức chế việc hình thành callus khi nuôi cấy bào tử đại mạch Chu và cộng sự (1975) lại để xuất khi nuôi cấy bao phấn lúa nên dùng môi trường Nó chứa nồng độ (NH¡); SỐ¿ thấp và

KNO; cao Thường môi trường có hàm lượng nitrat cao và amôniac giảm như môi

trường B5 va LS, sé cho két qua thanh céng hon

Người ta thấy rằng những bông lúa được xử lý ở nhiệt độ 8C trong một tuần sau đó tách lấy bao phấn rồi nuôi cây trong môi trường chứa thành phần muối vô cơ của N6 còn chất hữu cơ của MS có bổ sung NAA va kinetin sẽ thu được tỷ lệ hình thành callus tăng gấp 4 lần so với nuôi cấy trong môi trường MS Yeh và Tsay (1988) phát hiện rằng muối vô cơ của môi trường N6 có tác dụng làm chậm quá trình chuyển màu nâu và tăng cường sự sinh trưởng của callus bao phấn so với nuôi cấy trên môi trường MS

Ning dé đường cao đã kích thích việc tạo thành cây trong, nuôi cây bao phân của nhiều loài cây trồng đặc biệt đối với cây họ Gramineae Đối với lúa, nồng độ đường tối ưu theo các tác giả khác nhau có khác nhau Theo Chen (1978) thì tỷ lệ phối hợp giữa 6% đường trong môi trường tạo callus và 3% trong môi trường tái sinh cây sẽ cho tý lệ tạo callus và cây xanh cao Tuy nhiên một số báo cao khác lại cho rằng 6% đường là hơi cao nên giảm xuống còn 4 - 5% Ly do tai sao phai cần nồng độ đường cao vẫn chưa rõ, xong điều chắc chắn là đường đã làm tăng áp suất thâm thấu trong môi trường và kích thích quá trình phân hoá hạt phâ hẳn ở những giai đoạn phát triển khác nh rau Do vậy nồng độ đường có thé thay déi tuy theo giai doan phat triển của bào tử nuôi cấy

Trang 38

'lệ tạo mầm va tái tạo thành cây cao (noue và Macda 1981) 2,4 và NAA có tác dụng tạo callus nhưng những callus này lại khó tạo thành cây so với môi trường chỉ cho thêm NAA Nồng độ NAA tối ưu để tạo callus khoảng 2 mg/I, ở nồng độ này làm quá trình tạo callus và tái tạo thành cây tăng nếu như tăng nồng độ kinetin, tuy nhiên nồng độ kinetin không nên cao quá 2 mg/1 vì sẽ làm tăng tỷ lệ cây bạch tạng Tỷ lệ phối hợp tối ưu là NAA 2 mg/l và kinetin I mgi

Đôi với tác dụng của các chat phụ gia khác như nước dừa, nước chiệt nâm men,

nước chiệt khoai tây đang còn bàn cãi

Môi trường agar và than hoạt tính Lúc đầu có nhiều nghiên cứu kết luận rằng nuôi cấy bao phấn trên môi trường lỏng tốt hơn môi trường agar và họ đã giải thích là có thé môi trường lỏng đã làm cho bao phan tiếp xúc được với chất đỉnh đưỡng tốt hơn và những chất ức chế do bao phấn tiết ra khi nuôi cấy đã bị rửa sạch dé dang hơn Nhung au đó Horner và Pratt (1979) đã phát hiện ra rang mat dé bao phan dat trên môi trường i nhân tổ quan trọng ảnh hưởng đến kết quả nuôi cấy Việc phát triển kém của bao phấn trên môi trường đặc là do sự có mặt của các chất ức chế sinh trưởng trong bản thân

agar và nếu lọc agar bang than hoạt tính trước khi sử dụng hoặc thêm than hoạt tinh trực

tiếp vào môi trường nuôi cây agar sẽ kích thích bao phấn phát triển (Nakamura va Itagaki 1973) Diéu nay co thé 1a than hoạt tính không những chi hap phu chất ức chế do bao phan thai ra, những chất có sẵn trong agar mà còn hấp phụ cả những hoóemôn thực vật và cả những chất có lợi khác trong môi trường (Weatherhead và cộng sự 1978) Do vậy đối với những loài cây cần sự có mặt của các hoócmôn để phát triển bào tử thì việc thêm than hoạt tính vào môi trường có thể không tốt thí dụ như đối với lúa chăng hạn

J) Điêu kiện nuôi cây

Theo Maheshwari va céng sự (1980) thi anh sáng và nhiệt độ đóng vat trò quan trọng đến sự phát triển của bào tử, Đối với lúa có thể từ tối hoàn toàn đến chiếu sáng liên tục trong suốt quá trình nuôi cấy Một thí nghiệm so sánh giữa điều kiện tối hoàn toàn và chu kỳ 16 giờ sáng (2000 lux)/8h tdi cho thay: điều kiện tối hơi có ảnh hưởng tốt đến việc hình thành callus Mặc dầu ánh sáng không cần thiết cho việc hình thành callus nhưng quá trình tái sinh cây phải cần ánh sáng và người ta gợi ý nên để cường độ ánh sáng ở giai

đoạn tái sinh cây cao hơn giai doan tao callus Anh sáng xanh (475 nm) và đỏ (630 nm)

có ảnh hưởng rất tốt đối với nuôi cấy bao phần ngô (Nitsch và cộng sự 1982)

Nhiệt độ nuôi cấy bao phấn lúa thường từ 25 đến 30C, trong ngưỡng này phản ứng

của bao phấn tăng khi nhiệt độ tăng tuy nhiên kèm theo cả tỷ lệ cây bạch tạng cũng tăng Wang và cộng sự (1978) kết luận rằng, việc hình thành cây xanh hay bạch tạng chủ yếu do nhiệt độ tại thời điểm bắt đầu phát triển bào tử chứ không phải ở pha phân hoá callus, tuy nhiên quan điểm này vẫn cần phải làm sáng tỏ thêm Dối với lúa mỳ thì tỷ lệ tạo cây xanh được tăng lên nếu chuyển phôi nuôi cấy hạt phân từ nhiệt độ 27C

/ xuống 5° C (Bernard 1980) Bởi vậy Chen và cộng sự (1982, (1983) da dé xuất đối VỚI

lúa, nên nuôi cấy ở nhiệt độ thấp hơn một chút từ 20 đến 25”C sẽ thuận lợi cho quá trình tái sinh cây hon

Trang 39

Theo Dunwell (1979), Johansson và cộng sự (1982) thì thành phân hỗn hợp khí trong buông nuôi cây và mật độ bao phân lúa mỳ nuôi cây trên môi trường cũng ảnh hưởng đên kết quả nuôi cấy, uy nhiên chưa có nghiên cứu cụ thể ở lúa nước

&) Thanh bao phan

Có rất nhiều bài báo nêu vai trò của thành bao phan anh hưởng đến kết quả kích thích việc tạo cây đơn bội trong nuôi cấy bao phần Ở cây thuốc lá, những bao phần biểu hiện đang chuyển mẫu nâu ở thời kì cuối của nuôi cấy, có tiềm năng to lớn để hình thành phôi hơn là những bao phấn chuyển mẫu nâu sớm Tỷ lệ % thành cây của những bao phần biểu hiện chuyển nâu trong 2 tuần đầu nuôi cấy rất thấp Trong khi đó tỷ lệ này cao đối với những bao phấn sống đài hơn (Pelletier va Hami 1972, Mii 1976, Tsay 1982) Hiệu quả của quá trình chuyển nâu cũng xây ra đối với việc nuôi cấy bao phan

lúa Tsay (1982) cho biết, nông độ chất khử trùng cao và thời gian khử trùng đài đã làm

tăng quá trình nâu hoá và làm giảm khả nang tao callus, chiều hướng này cũng xây ra đối với nuôi cấy bao phần của tổ hợp lai giữa Japonica với, Indica Nguyên nhân của sự giảm khả năng hình thành callus là do quá trình nâu hoá bao phấn sớm có thể đã tạo ra quinôn, một chất độc đối với bào tử Rất nhiều bài báo khác đều cho răng kết quả này là do hoạt động của một số nhân tố nằm trong thành bao phần Pelletier và Hami (1972) cho rằng mô thành bao phân có chứa những điều kiện cần thiết để hat phan phat sinh thành phôi trong những ngày đầu nuôi cấy khi mà chúng chưa có thể tự phân hoá được Vậy chức năng của thành bao phấn trong nuôi cấy bao phan IA gi Pelletier va Hami (1972) cho rằng, có một nhân tố kích thích nào đó được sinh ra từ thành bao phan đã kích thích hạt phấn phát sinh phôi Theo Dunwell q 976) thì sự cân bằng về hoócmôn trong thành bao phan đóng vai trò quan trọng cho quá trình phát triển của phôi thuốc lá Mii (1976) lại chỉ ra rằng thành bao phan đã bị nâu có ảnh hưởng xâu đến hat phan, lam cho nó không qua được giai đoạn khủng hoảng để chuyển sang giai đoạn phân hố phơi Tsay và cộng sự (1986) lại chứng minh răng mô biểu bì (epidermis) và nội bì (endothecium) cia bao phan lúa nuôi cây có thể tích luỹ và vận: chuyên lipit và polysaccharides cho bào tử ở những giai đoạn nhất định trong thời kỳ nuôi cấy Tsay (1981) phat hién ra rang lớp tế bào tầng nuôi (tapetum) phát triển tốt là yếu: tố quan trọng để tạo phôi đơn bội thuốc lá Sunderland và Roberts (1977) lại cho rằng khi lớp tế bào tapetum phân rã có thể cung cấp dinh dưỡng cho bào tử phát triển thành phôi Kohlenbach và cộng sự (1978) đã chứng minh rằng trong nuôi cấy bao phần thuốc lá,

vật chất của tapetum đã có tác dụng tốt cho sự phát triển của bào tử phân lập Người ta cho rằng lớp tapetum đã cung cấp dinh dưỡng cho bào tử phát triển trong cây Moss và Heslop-Harrison phát hiện ra rằng tế bào tapetum có ích bởi vì việc tổng hợp ADN xây ra nhanh ở tế bào đa bội hơn là tế bào nhị bội do vậy chúng có thể sử dụng như là nơi dự trữ ADN khi mà nhu cầu đột xuất tăng lên Điều này có thể do thành bao phan da

cung cấp ADN và một số vật chất khác cho tế bào sinh sản để nhân nhanh những tế bào

Trang 40

° Trong nuôi cấy bao phân một số quá trình nào làm giảm tối thiểu sự ơxy hố phêno! có thể sẽ làm tăng một cách đáng kể khả năng tạo callus Do vậy người ta dé xuất bằng cách nên dìm bao phần vào môi trường lỏng có bổ sung chất chống ơxy hố vào tuần đầu và thứ 2 của nuôi cấy Trong buồng nuôi cấy không nên để nhiệt độ quá cao vì sẽ làm tăng q trình ơxy hố phénol Duy trì nuôi trong điều kiện tối sẽ có lợi vì chiếu sáng đã kích thích để tao ra phénol

h) Quá trình phan héa callus

Kha nang callus hat phan phan hoa thanh cay phu thudc rất nhiễu vào chất lượng callus trước khi nó được cấy chuyển sang môi trường tái sinh cây Bởi vậy những yếu tổ ảnh hưởng đến việc hình thành callus có ảnh hưởng quan trọng đến quá trình tái sinh cây Chen và cộng sự (1986) cho rằng callus nào được tạo thành sớm sau 30 - 50 ngày đặt cấy bao phần thì có khả năng tạo thành cây xanh cao, vì những callus hạt phấn thường mất khả năng phát sinh hình thái rất nhanh trong quá trình nuôi cấy, do vậy Oono (1975) và Chen (1977) đề xuất cần chuyển càng sớm callus sang môi trường tái sinh cây thì càng tốt Thời gian chuyển tốt nhất là sau khi callus bắt đầu hình thành được 10 ngày, chuyển sớm hơn callus thường bị chết (Wang và cộng sự 1974 Chen và

cộng sự (1984) Mặt khác cay chuyén sớm còn làm mức độ bội thể trong-quá trình phan

chia tăng sinh khối của callus bị giảm tối thiểu, dẫn đến sẽ thu được nhiều cây đơn bội,

ít cây đa bội, còn những cây lệch bội sẽ được phục hồi (C.C Chen va C.M Chen 1980,

Chen và cộng sự 1984) Khoảng cách giữa 2 callus trên dia la 2.cm 1a thich hop dé callus phân hoá thành cây Hẹp hớn khoảng cách trên sẽ dẫn đến làm giảm khả năng phân hoá (Chen và cộng sự 1984)

i) Hién twong bach tang

Việc hình thành cây bạch tạng là hiện tường thường gặp khi nuôi cấy bao phấn cây ngũ cốc Tỷ lệ cây bạch tạng đối với lúa biến động từ 10% (Wang và cộng sự 1978, Genovesi va Magill 1979) dén 100% theo Tsay va cộng sự (1981) Tỷ lệ này phụ thuộc vào kiểu gen, mỗi một giống có một tỷ lệ nhất định (Wang và cộng sự 1978, Chen và Lin 1981) Hạt phần cây lai giữa các loài thường có tý lệ này cao hơn (Woo và cộng sự 1978, Woo và Huang 1982), ví dụ như lai giữa Indica với Japonica (Tsay và cộng sự 1981) Bởi vậy hiện tượng bạch tạng là một trở ngại lớn khi muốn phục hồi lại những cây tái tổ hợp có lợi từ cây lai xa thông qua nuôi cây bao phẩn Nguyên nhân gây lên cây bạch tạng hiện chưa được sáng tỏ Tuy nhiên, bằng nghiên cứu kính hiển vị điện tử Vaughn và cộng sự (1980) cho rằng việc hình thành cây bạch tạng là do sự đảo lộn về cầu trúc vật lý trong các cơ quan tử, đặc biệt là lạp thể Việc tạo ra cây bạch tạng cũng có thể là do mắt khả năng hoạt hoá của các gen phát triển lục lạp và diệp lục trong điều kiện nuôi cấy Liên quan đến tần số cây bạch tạng là nhiệt độ ủ khi nuôi cây (Wang và cộng sự 1974, Bernard 1980), loại và nồng độ hoócmôn thực vật, nồng độ đường và muỗi VÔ CƠ trong dung dịch nuôi cấy (Y Cheng và cộng sự 1978, C.C Chen 1978, Lee - ~ va Chen 1982), cũng như giải đoạn phát triển của bao phần dùng để nuôi cay, Bởi vậy