THỰC HÀNH Môn CNSH trong BVTV Bài 1. PCR phát hiện begomovirus 1. Giới thiệu Begomovirus là các virus có bộ gien DNA sợi vòng đơn, kích thước khoảng 2.6 – 2.8 kb. Begomovirus có thể có bộ gien đơn (gồm một phân tử DNA-A) hoặc có bộ gen kép (gồm hai phân tử DNA-A và DNA-B) 2. Mồi PCR Sử dụng một cặp mồi chung (degenerate primers) được thiết kế ở vùng bảo thủ của phân tử DNA-A để phát hiện virus Mồi Trình tự (5’ – 3’) Vị trí Kích thước (bp) Tham khảo BegoAFor1 TGYGARGGiCCiTGYAARGTYCARTC * Hình 2 ~1200 BegoARev1 ATHCCMDCHATCKTBCTiTGCAATCC * * Y (C / T), R (G / A), H (A / C / T), M (A / C), B (C / G / T), D (A / G / T), K (G / T) và i = inosine DNA-A ~2.7kb AC4 AC2 (TrAP) AC1 (Rep) (Rep) AV1 (CP) AC3 (REn) AV2 (CEGPCKVQS) (IPT/A/SIF/VLCNP) AV1 AV2 AC3 AC2 AC1 AC4 BegoAFor1 BegoARev1 ~ 1.2 kb DNA-A Hình 2. Sơ đồ tổ chức bộ gien DNA-A (biểu diễn dưới dạng mạch thẳng) của begomovirus và vị trí tương đối của cặp mồi BegoAFor1 và BegoARev1. Mũi tên dạng hộp biểu diễn vị trí và hướng của các ORF. Dãy chữ trong 2 ngoặc kép là các chuỗi axit amin bảo thủ tương ứng với 2 mồi BegoAFor1 và BegoARev1. 1 Hình 1. Tổ chức bộ gien phân tử DNA-A của begomovirus. CP = coat protein. REn = replication enhancer. TrAP = transcriptional activator protein. Rep = replication associated protein. 3. Chiết DNA tổng số từ mô cây. Chuẩn bị: 1. Đệm chiết (đệm CTAB) 2. Chloroform: Isoamylalcolhol (24:1) 3. β Mercaptoethanol (BME) 4. Ethanol 70% 5. 2-Propanol 6. Chày, cối sứ (hoặc tube 1.5 mL và chày nhựa): rửa sạch ngâm trong dung dịch NaOH 3M (1 ngày), rửa lại bằng nước cất rồi hấp vô trùng. 7. Tube 1,5ml 8. Bút viết kính 9. Pipet (1000, 200) và tip 10. Máy li tâm để bàn (15000 g) 11. Bể nhiệt Quy trình chiết 1. Ủ đệm chiết CTAB (cứ 1 mẫu chiết cần 1ml đệm) đã bổ sung BME (với tỉ lệ 1ml đệm CTAB :10 μL BME) trong bể nhiệt ở nhiệt độ 60 o C trong 30 phút. 2. Lấy 0,1 g mô lá bệnh nghiền với 1ml CTAB bằng chày cối sứ (nghiền đến khi dung dịch thu được là một thể đồng nhất). Hút 700 mL dịch chiết cho vào tube 1,5 ml. 3. Li tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, thu dịch trên tủa (600 μL) cho vào tube mới 4. Cho Chloroform: Isoamylalcolhol (24 :1) vào tube với tỉ lệ thể tích tương đương. Đảo đều tube. 5. Li tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, thu dịch trên tủa (400 μL). 6. Lặp lại các bước 3, 4, 5 thêm một lần nữa. 7. Cho thể tích tương đương (400 μL) 2-propanol vào tube. Đảo đều tube và để lạnh (-20 oC) 30 phút. 8. Li tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút. Loại bỏ dịch phía trên, thu lấy cặn DNA tổng số. 9. Rửa cặn bằng Ethanol 70% hai lần (mỗi lần 0.7 – 1 mL) 10. Làm khô cặn DNA bằng cách mở nắp tube, để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút (nơi sạch). 11. Hòa cặn trong 50 μL nước cất 2 lần vô trùng hoặc đệm TE và bảo quản dich DNA ở -20 oC 4. Thực hiện phản ứng PCR Chuẩn bị 1. Tube PCR 0,5 ml hấp khử trùng. 2. Đá lạnh vụn (nếu không có hộp lạnh chuyên dụng) 3. Máy PCR 4. Pipet (200, 20, 10, 2.5) và tip tương ứng 2 Thao tác Cho vào mỗi tube PCR các thành phần sau: Thành phần Thể tích cần lấy (μL) Dd H 2 O 19.3 Đệm PCR (10X) 2.5 dNTPs (10 mM mỗi loại) 0.5 Mồi xuôi dòng: BegoAFor1 (20 μM) 1.0 Mồi ngược dòng: BegoARev1 (20 μM) 1.0 DNA polymerase (Taq) (5U/ μL) 0.2 DNA tổng số 0.5 Tổng thể tích 25 Cho vào máy PCR với điều kiện phản ứng PCR Nhiệt độ o C Thời gian Số chu kỳ Biến tính khởi đầu 92 4 phút 1 Các chu kỳ tổng hợp 92 35 giây 30 50 35 giây 72 1 phút Kết thúc 72 5 phút 1 5. Kiểm tra kết quả Chạy điện di trên gel agarose để kiểm tra sản phẩm RT-PCR. Chuẩn bị 1. Pha đệm điện di TAE 1X 2. Chuẩn bị bản gel 1%: Cân 1g agarose cho vào trong lọ, bổ sung 100 mL TAE 1x vào lọ. Cho lọ vào lò vi sóng để hoà tan agarose. Sau khi agarose đã tan hoàn toàn, bổ sung 1 μL Ethidium Bromide, lắc đều, để lọ ở nhiệt độ phòng tới nhiệt độ khoảng 60 oC. 3. Dán băng dính xung quanh khay gel và đặt lựơc. Đổ gel vào khuôn (dày khỏang 1 cm). Để khuôn ở nhiệt độ phòng 30 phút để đông gel. 4. Lấy các tube PCR 5. Cho vào mỗi tube 5 μL đệm cài gel (Loading Dye x6, trộn đều và spin trong 5 giây. Chạy điện di và kiểm tra kết quả 1. Sau 30 phút để khuôn ở nhiệt độ phòng thì tiến hành rút lược (cầm chính giữa lược, rút đều tay để không vỡ giếng), bỏ băng dính ở xung quanh khuôn gel. 3 2. Đặt cả khay khuôn gel vào bể điện di, đổ dung dịch đệm TAE 1x phủ ngập gel (gel ngập sâu khoảng 1mm). 3. Nhỏ 15 μL mẫu PCR vào giếng Ngoài các mẫu PCR, luôn phải nhỏ thêm 1 giếng DNA marker làm chuẩn. 4. Cắm nguồn điện cho máy điện di, đặt điện thế 100V và thời gian 30 phút. 5. Sau 30 phút, tắt máy điện di, đặt bản agarose lên máy phát tia cực tím và quan sát kết quả. Sản phẩm PCR với cặp mồi BegoA For1/BegoARev1 sẽ có kích thước ~1.2 kb 6. Chụp ảnh 4 Bài 2. ELISA kiểm tra PRSV 1. Giới thiệu Pappaya ringspot virus (PRSV) là virus RNA, thuộc chi Potyvirus. Virus gây bệnh đốm hình nhẫn trên đu đủ và khảm lá trên nhiều cây hạ bầu bí Kỹ thuật kiểm tra PRSV là PTA-indirect ELISA dùng kháng huyết thanh thô 2. Vật liệu và chuẩn bị 1. Chày và cối sứ (để nghiền mẫu) 2. Pipet tự động cỡ 20 µL (để hút kháng huyết thanh, kháng thể thứ cấp), cỡ 100 (hoặc 200) µL (để hút dịch chiết cây, dịch kháng thể, dịch chất nền) và 1000 µL (để hút các loại đệm) 3. Cốc mỏ hoặc lọ cỡ khoảng 50 - 100 mL (để ủ dịch kháng huyết thanh) 4. Nước cất 5. Máy đọc ELISA (tùy chọn), tủ ấm 6. Mẫu cây khỏe và mẫu cây biết rõ nhiễm bệnh (làm đối chứng). Đối với mỗi lần thử, luôn cần 3 mẫu cây khỏe và 3 mẫu cây bệnh. 3. Thao tác 1. Cố định dịch cây vào bản ELISA: Nghiền khoảng 0,1 g mô lá với 1 mL đệm chiết mẫu bằng chày và cối sứ sạch. Dùng pipet cho 100 µL dịch chiết vào giếng của bản ELISA (có thể cắt đầu típ để dễ hút dịch chiết). Nếu có điều kiện, dịch chiết nên được cho vào tube eppendorf loại 1,5 hoặc 2 mL và li tâm để lắng cặn. Ủ bản ELISA trong hộp ẩm qua đêm ở 4-6 O C trong hộp ẩm. Sáng hôm sau, rửa bản ELISA 3 lần bằng đệm rửa. Ở bước này, protein của cây và virus trong dịch cây (nếu có) sẽ liên kết không đặc hiệu vào thành giếng. 2. Cố định kháng thể thỏ đặc hiệu virus vào bản ELISA: Nghiền mô lá cây khỏe với đệm PBS-T-P-O (tỷ lê nghiền là 1/10, chẳng hạn 1 g mô lá và 10 mL đệm cho 1 bản ELISA). Dịch chiết được nên được li tâm để loại bỏ cặn. Hoà kháng huyết thanh virus trong dịch chiết cây khỏe và ủ ở 37 O C khoảng 45 phút để hấp thụ chéo các kháng thể không đặc hiệu. Sau khi ủ, dùng pipet cho 100 µL dịch kháng huyết thanh đã hấp thụ chéo vào giếng ELISA và ủ bản ELISA ở 37 O C 2-4 giờ trong hộp ẩm. Sau khi ủ, rửa bản ELISA như ở bước 1. Ở bước này, kháng thể thỏ đặc hiệu virus sẽ liên kết với virus. 3. Cố định kháng thể thứ cấp liên kết enzyme (đặc hiệu kháng thể thỏ) vào bản ELISA: Hoà kháng thể thứ cấp liên kết enzyme trong đệm PBS-T-P-O. Dùng pipet cho 100 µL dịch kháng thể thứ cấp liên kết vào giếng ELISA và ủ bản ELISA ở 37 O C 2-4 giờ trong hộp ẩm. Sau khi ủ, rửa bản ELISA như ở bước 1 và 2 lần bằng nước cất. Ở bước này, kháng thể thứ cấp sẽ liên kết với kháng thể thỏ. 4. Cố định chất nền vào bản ELISA và đánh giá kết quả: Hòa 1 viên chất nền với 10 mL đệm chất nền. Dùng pipet cho 100 µL dịch chất nền vào giếng ELISA và ủ bản ELISA ở nhiệt độ phòng trong hộp ẩm. Hộp cần phải để trong tối để giảm tốc độ tự phản ứng của chất nền. Quan sát phản ứng sau 30 phút, 60 phút, 90 phút. Các giếng xuất hiện màu vàng là các giếng chỉ thị mẫu nhiễm virus. Màu của phản ứng có thể được lượng hóa bằng máy đọc ELISA, đo ở bước sóng 405 nm. 5 Đệm dùng trong PTA-ELISA Đệm chiết mẫu = đệm carbonate (pH 9.6) • 1.59 g sodium carbonate (Na2CO3) • 2.93 g sodium bicarbonate (NaHCO3) • 0.20 g sodium azide (NaN3) • Hòa trong 900 ml H2O, điều chỉnh pH = 9.6 với HCl và lên thể tích 1 L. Đệm PBS (pH 7.4) phosphate buffer saline • 8.0 g sodium chloride (NaCl) • 0.2 g monobasic potassium phosphate (KH2PO4) • 1.15 g dibasic sodium phosphate (Na2HPO4) • 0.2 g potassium chloride (KCl) • 0.2 g sodium azide (NaN3) • Hòa tron 900 ml H2O, điều chỉnh pH = 7.4 với HCl hoặc NaOH và lên thể tích 1 L Đệm rửa (đệm PBS-Tween (PBST)) • PBS + 0.5 ml Tween 20 trên lít Đệm PBS-T-P-O (= đệm Conjugate) • PBST + 2% PVP + 0.2% egg albumin (Sigma A-5253) Đệm cơ chất (Substrate buffer) • 97 ml diethanolamine • 600 ml H2O • 0.2 g sodium azide (NaN3) • Điều chỉnh pH = 9.8 với HCl và lên thể tích 1 L Đệm được bảo quản ở 4 ° C trong ít nhất 2 tháng. 6 . trong hộp ẩm qua đêm ở 4-6 O C trong hộp ẩm. Sáng hôm sau, rửa bản ELISA 3 lần bằng đệm rửa. Ở bước này, protein của cây và virus trong dịch cây (nếu có) sẽ liên kết không đặc hiệu vào thành. BegoARev1. Mũi tên dạng hộp biểu diễn vị trí và hướng của các ORF. Dãy chữ trong 2 ngoặc kép là các chuỗi axit amin bảo thủ tương ứng với 2 mồi BegoAFor1 và BegoARev1. 1 Hình 1. Tổ chức bộ gien. (cứ 1 mẫu chiết cần 1ml đệm) đã bổ sung BME (với tỉ lệ 1ml đệm CTAB :10 μL BME) trong bể nhiệt ở nhiệt độ 60 o C trong 30 phút. 2. Lấy 0,1 g mô lá bệnh nghiền với 1ml CTAB bằng chày cối sứ (nghiền