1.2. Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu động thái hàm lượng prolin và glycine betaine trong mầm đậu tương ở điều kiện thiếu nước và khả năng phục hồi sau thiếu nước. Nghiên cứu động thái hoạt độ một số enzym trong mầm đậu tương ở điều kiện mặn và khả năng phục hồi sau nhiễm mặn. 1.3. Những đóng góp mới của đề tài 1) Lần đầu tiên ở Việt Nam tiến hành nghiên cứu sâu về ảnh hưởng của 2 tác nhân môi trường gây stress điển hình: thiếu nước và nhiễm mặn tới một số biến đổi bên trong của quá trình nảy mầm: hoạt độ các enzym phân hủy chất dự trữ trong hạt nảy mầm, enzym chống oxy hóa, hàm lượng các chất bảo vệ tế bào khỏi stress (prolin, glycinbetain) trong suốt quá trình nảy mầm bị stress và động thái hoạt động của chúng sau thời gian bị stress. 2) Nghiên cứu động thái hoạt động của các chất chống stress và các chất thúc đẩy hạt nảy mầm có thể góp phần làm rõ mối quan hệ của phản ứng tự vệ và khả năng sinh trưởng ở giai đoạn đầu tiên của quá trình phát triển cá thể của đậu tương nói riêng và thực vật nói chung. Đồng thời nghiên cứu góp phần làm rõ và sâu sắc thêm vai trò sinh lí của các chất chống stress. 3) Cho phép so sánh ảnh hưởng của 2 loại tác nhân stress tới quá trình nảy mầm và sinh trưởng mầm và khả năng phục hồi sau stress của chúng. II. TổNG QUAN TÀI LIệU 2.1. Đặc điểm thực vật học và hóa sinh hạt đậu tương Đậu tương có tên khoa học là (Glycine Max (L.) Merrill) thuộc họ Đậu (Fabaceae), họ phụ cánh bướm (Papilionoidace) có bộ NST 2n = 40. Cây đậu tương là cây trồng cạn thu hạt, gồm các bộ phận chính: rễ, thân, lá, hoa, quả và hạt. Rễ đậu tương là rễ cọc, gồm rễ cái và các rễ phụ, trên rễ có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium japonicum, có khả năng cố định đạm của không khí tạo thành đạm dễ tiêu. Các công trình nghiên cứu cho thấy những giống có khả năng cộng sinh và có đủ nốt sần thường làm cho hàm lượng protein cao, cho nên trồng cây đậu tương có tác dụng cải tạo đất. Thân cây đậu tương là thân thảo, ít phân cành dạng bụi, lá đậu tương là lá kép với 3 lá chét, nhưng đôi khi cũng có 4 5 lá chét. Đậu tương là cây tự thụ phấn, hoa đậu tương nhỏ, không hương vị, có màu tím, tím nhạt hoặc trắng, hoa mọc từ nách lá hoặc ngọn, quả đậu tương thuộc loại quả ráp, thẳng hoặc hơi cong, có nhiều lông khi chín có màu vàng hoặc xám. Hạt đậu tương không có nội nhũ mà chỉ có một lớp vỏ bao quanh một phôi lớn. Hạt có hình tròn hoặc bầu dục, tròn dài, tròn dẹt, ovan... Vỏ hạt thường nhẵn và có màu vàng nhạt, vàng đậm, xanh, nâu, đen... đa số là hạt màu vàng. Khối lượng hạt rất đa dạng dao động từ 20 400 mg hạt. Màu sắc rốn hạt ở các giống là khác nhau, đây là một biểu hiện đặc trưng của giống. Thời gian sinh trưởng của cây đậu tương thường chia ra nhóm chín sớm, trung bình và muộn.
TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU ĐỘNG THÁI HÀM LƯỢNG PROLIN, GLYCINBETAIN VÀ HOẠT ĐỘ MỘT SỐ ENZYM TRONG MẦM ĐẬU TƯƠNG Ở ĐIỀU KIỆN THIẾU NƯỚC VÀ NHIỄM MẶN Người hướng dẫn khoa học :PGS.TS Nguyễn Văn Mã TS Trần Khánh Vân Người thực : Th.S Nguyễn Thị Thao I MỞ ĐẦU 1.1 Lý chọn đề tài Theo báo cáo Chương trình Lương thực Thế giới dự đoán rằng: tượng thời tiết cực đoan lũ lụt, hạn hán, cháy rừng bão nhiệt đới gây thiệt hại cho ngành nông nghiệp, đe dọa an ninh lương thực cho hàng triệu người Việt Nam quốc gia chịu ảnh hưởng nặng nề biến đổi khí hậu có đường bờ biển dài vùng châu thổ thấp Hơn nữa, Việt Nam phụ thuộc nhiều vào nông nghiệp Nhiệt độ mơi trường ấm lên mặt tạo thuận lợi cho phát triển số trồng định, mặt khác gây bất lợi cho trồng khác Năng suất trồng chậm lại kết kiện liên quan đến biến đổi khí hậu lượng mưa giảm nhiệt độ tăng cao, diện tích đất nhiễm mặn tăng lên Vì vậy, ngồi việc phải chống đỡ, thực vật cần phải có khả “sống chung” với điều kiện khí hậu ngày cực đoan Nghiên cứu giống trồng chịu hạn, chịu mặn biện pháp nâng cao khả chống chịu trồng chủ đề nhiều nhà khoa học quan tâm Kết nghiên cứu Giri J (2011) glycinbetain điều kiện stress [12], kết nghiên cứu Diego Ariel, Marta Rosalia Gulotta, Carlos Alberto Martinez Marco Antonio Oliva prolin glycine betaine prosopis alba điều kiện stress muối [11], kết nghiên cứu Nguyễn Hữu Cường, Nguyễn Thị Kim Anh, Đinh Thị Phòng, Lê Thị Muội, Lê Trần Bình (2003) mối tương quan hàm lượng prolin tính chống chịu lúa cho thấy vai trị nhóm chất trì áp suất thẩm thấu [1] Nghiên cứu Điêu Thị Mai Hoa, Nguyễn Phương Thảo, Lê Thị Thanh Hiếu (2011) ảnh hưởng áp suất thẩm thấu cao đến nảy mầm, hoạt tính enzyme α-amylase tích lũy prolin mầm đậu xanh (Vigna radiata) [3] Trần Thị Phương Liên (1999) nghiên cứu số giống đậu tương có khả chịu nóng hạn [5] cho thấy trồng chịu tác động stress môi truờng có biến đổi sinh lý, sinh hố thích nghi Kết nghiên cứu tác giả Atitop, Akimosva, Talamosva, Topchiepva tính chống chịu thực vật thời gian đầu tác động nhiệt độ bất lợi cho thấy biểu rõ hai giai đoạn chống chịu điều kiện bất lợi môi trường gồm: phản ứng không đặc thù giúp thực vật chống chịu để tồn phản ứng đặc thù để thực vật thích nghi [13] Hướng nghiên cứu sâu tìm hiểu trình, chế phản ứng chống chịu nhiều nhà khoa học ý nhiều điều chưa thỏa mãn, chưa đủ sức đáp ứng sở khoa học cho việc canh tác hiệu bối cảnh tồn giới phải khơng ngừng nâng cao suất phẩm chất trồng điều kiện khắc nghiệt môi trường Nhiệm vụ đặt tiếp tục làm rõ luận điểm trước ảnh hưởng tác nhân stress môi trường, góp phần làm rõ thêm phản ứng sâu sinh lí đặc điểm q trình chống chịu hai loại tác nhân stress nước ta lồi thực vật có nhiều giá trị đời sống xuất Nghiên cứu tảng cho nghiên cứu sâu lĩnh vực phân tử nghiên cứu ứng dụng nâng cao khả chống chịu trồng Vì vậy, chúng tơi lựa chọn đề tài “Nghiên cứu động thái hàm lượng prolin, glycinbetain hoạt độ số enzym mầm đậu tương điều kiện thiếu nước nhiễm mặn” 1.2 Mục tiêu nghiên cứu - Nghiên cứu động thái hàm lượng prolin glycine betaine mầm đậu tương điều kiện thiếu nước khả phục hồi sau thiếu nước - Nghiên cứu động thái hoạt độ số enzym mầm đậu tương điều kiện mặn khả phục hồi sau nhiễm mặn 1.3 Những đóng góp đề tài 1) Lần Việt Nam tiến hành nghiên cứu sâu ảnh hưởng tác nhân mơi trường gây stress điển hình: thiếu nước nhiễm mặn tới số biến đổi bên trình nảy mầm: hoạt độ enzym phân hủy chất dự trữ hạt nảy mầm, enzym chống oxy hóa, hàm lượng chất bảo vệ tế bào khỏi stress (prolin, glycinbetain) suốt trình nảy mầm bị stress động thái hoạt động chúng sau thời gian bị stress 2) Nghiên cứu động thái hoạt động chất chống stress chất thúc đẩy hạt nảy mầm góp phần làm rõ mối quan hệ phản ứng tự vệ khả sinh trưởng giai đoạn q trình phát triển cá thể đậu tương nói riêng thực vật nói chung Đồng thời nghiên cứu góp phần làm rõ sâu sắc thêm vai trị sinh lí chất chống stress 3) Cho phép so sánh ảnh hưởng loại tác nhân stress tới trình nảy mầm sinh trưởng mầm khả phục hồi sau stress chúng II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm thực vật học hóa sinh hạt đậu tương Đậu tương có tên khoa học (Glycine Max (L.) Merrill) thuộc họ Đậu (Fabaceae), họ phụ cánh bướm (Papilionoidace) có NST 2n = 40 Cây đậu tương trồng cạn thu hạt, gồm phận chính: rễ, thân, lá, hoa, hạt Rễ đậu tương rễ cọc, gồm rễ rễ phụ, rễ có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium japonicum, có khả cố định đạm khơng khí tạo thành đạm dễ tiêu Các cơng trình nghiên cứu cho thấy giống có khả cộng sinh có đủ nốt sần thường làm cho hàm lượng protein cao, trồng đậu tương có tác dụng cải tạo đất Thân đậu tương thân thảo, phân cành dạng bụi, đậu tương kép với chét, đơi có - chét Đậu tương tự thụ phấn, hoa đậu tương nhỏ, khơng hương vị, có màu tím, tím nhạt trắng, hoa mọc từ nách ngọn, đậu tương thuộc loại ráp, thẳng cong, có nhiều lơng chín có màu vàng xám Hạt đậu tương khơng có nội nhũ mà có lớp vỏ bao quanh phơi lớn Hạt có hình trịn bầu dục, trịn dài, trịn dẹt, ovan Vỏ hạt thường nhẵn có màu vàng nhạt, vàng đậm, xanh, nâu, đen đa số hạt màu vàng Khối lượng hạt đa dạng dao động từ 20 - 400 mg/ hạt Màu sắc rốn hạt giống khác nhau, biểu đặc trưng giống Thời gian sinh trưởng đậu tương thường chia nhóm chín sớm, trung bình muộn 2.2 Nguyên nhân thiếu nước thực vật ảnh hưởng thiếu nước tới thực vật Nguyên nhân gây thiếu nước thực vật: Nguyên nhân thứ 1: lượng nước dự trữ cho hấp thụ đất bị cạn kiệt nên hút đủ nước cân nước Nguyên nhân thứ 2: độ ẩm khơng khí q thấp làm cho q trình nước q mạnh gia tăng gradient nước không gian bên khoang khí khổng khơng gian bên ngồi lá, nước tăng nhanh dẫn đến cân nước Nguyên nhân thứ 3: xảy trạng thái sinh lý không cho phép hút nước môi trường không thiếu nước Rễ không lấy nước q trình nước diễn nên cân nước Cây không hút nước môi trường nhiệt độ thấp, nồng độ dung dịch mơi trường q cao Khi có chênh lệch gradient nồng độ, khơng khơng thể hút nước mà cịn làm cho nước từ tế bào chất ngồi Ảnh hưởng thiếu nước đến thực vật Tác động hạn lên chủ yếu theo hai hướng là: làm tăng nhiệt độ gây nước Nước yếu tố giới hạn trồng, vừa sản phẩm khởi đầu vừa sản phẩm trung gian cuối trình chuyển hố sinh học Nước mơi trường để phản ứng trao đổi chất xảy Sự tác động hạn, gây nên tượng co nguyên sinh làm cho bị héo Hạn hán làm giảm mạnh quang hợp Khi hàm lượng nước khoảng 40 - 50% quang hợp bị đình trệ cản trở sinh trưởng Như vậy, ảnh hưởng cực đoan hạn bất cứ giai đoạn sinh trưởng trồng ảnh hưởng đến yếu tố cấu thành suất sản lượng trồng Đặc biệt, giai đoạn nảy mầm giai đoạn đầu chu kỳ sinh trưởng phát triển Sau kết thúc ngủ nghỉ, hạt bắt đầu tăng tính thủy hóa keo ngun sinh chất, giảm tính ưa mỡ độ nhớt keo, dẫn đến biến đổi sâu sắc đột ngột trình trao đổi chất hạt liên quan đến nẩy mầm Đặc trưng tăng hoạt tính enzym thủy phân phân giải polysacarit, protein hợp chất phức tạp khác thành chất đơn giản dẫn đến thay đổi hoạt động thẩm thấu Các sản phẩm thủy phân dùng làm nguyên liệu cho q trình tăng lên mạnh mẽ phơi hạt, vừa làm tăng áp suất thẩm thấu hạt giúp cho q trình hút nước vào hạt nhanh chóng Tuy nhiên, giai đoạn nảy mầm hạt giai đoạn quan trọng mẫm cảm với nhiều yếu tố môi trường bất thuận đặc biệt hạn mặn Khi gieo hạt áp suất thẩm thấu (ASTT) cao, hạt bị cản trở hút nước q trình sinh lý, hóa sinh hạt bị ức chế nảy mầm bị kìm hãm [9] Nếu thiếu nước giai đoạn làm giảm tỷ lệ mọc mầm ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng mầm, tốc độ nảy mầm hạt chậm lại, rễ mầm ngắn, khả sinh trưởng mầm kém, mầm hình thành cịi cọc, mầm nhanh lá, ảnh hưởng đến khả sinh trưởng phát triển trưởng thành sau này… Ngồi ra, thiếu nước q lâu, mầm bị khô, héo chết, dẫn đến giảm đáng kể tỷ lệ nảy mầm tạo thành 2.3 Tình hình nhiễm mặn ảnh hưởng muối tới thực vật Tình hình đất nhiễm mặn Chưa có số liệu xác diện tích đất nhiễm mặn giới mà có ước tính nhà khoa học đất giới Dregne (1977) ước tính có khoảng tỷ đất bị nhiễm mặn Massoud ( 1974) ước tính giới có 932 triệu đất nhiễm mặn Trong đó, có 316 triệu nước phát triển Theo Dudal Pumell (1986), đất nhiễm mặn chiếm khoảng 7% diện tích đất giới Việt Nam với đường bờ biển dài 3.620 km trải dài từ Bắc vào Nam, hàng năm vùng trồng lúa ven biển chịu thiệt hại nhiều xâm thực nước biển (Lê Sâm, 2003) Theo thống kê diện tích đất ngập mặn năm 1992 494.000 ha, đến năm 2000 606.792 ha, đến năm 2005 gần 676.000 [17] Nguyên nhân mặn muối biển, phổ biến mặn NaCl Thực tế, vùng đất mặn cuả nước ta bỏ hoang hoá trồng trọt số hạn chế với suất thấp Chính mà việc nghiên cứu chất sinh lý tính chống chịu mặn thực vật có ý nghĩa lớn sản xuất nông nghiệp, đặc biệt việc tạo giống có tính chống chịu mặn việc tìm biện pháp tăng cường tính chống chịu mặn cho Đã có nhiều nghiên cứu đề cập đến vấn đề này, chất sinh lý tính chống chịu mặn chưa hồn toàn sáng tỏ [16] Tác động mặn đến thực vật Tác hại mặn phụ thuộc vào nồng độ muối, loại muối, đất, giống giai đoạn sinh trưởng phát triển Mặn ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng phát triển cuối ảnh hưởng đến suất trồng Khi đất bị nhiễm mặn ảnh hưởng đến khả hút nước cây, trình vận chuyển chất cây, trình thoát nước trao đổi chất Mặn làm rối loạn trao đổi chất, đặc biệt trao đổi protein [17] 2.4 Vai trò prolin, glycin betanin chống chịu stress môi trường Prolin: (pirolidin cacboxylic) amoniaxit ưa nước có cơng thức phân tử C5H9NO2 Trong phân tử prolin có chứa vịng pirolidin tạo thành kết hợp nhóm amin bậc với cacbon mạch bên Prolin tổng hợp từ glutamine Q trình kích thích axit absisic stress Hiện đường tổng hợp prolin mô tả đầy đủ, phân giải prolin hiểu biết Tỷ lệ prolin điều khiển enzyme P5CS (delta – pyrrolin – – cacboxylat synthetaza) enzyme phân giải PDH (prolin dehydrogennaza) Vai trò prolin chống chịu stress thực vật thể hiện: prolin tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu nội bào tham gia bảo vệ màng, protein [10] nguồn dự trữ lượng, bon, ni tơ TV phục hồi sau stress Glycinbetain (GB): GB chất hữu dễ hồ tan nước khơng độc nồng độ cao GB tích tụ nhiều GB tổng hợp từ chất dẫn xuất axít amin glycine choline Vì có sẵn vai trị hàng đầu GB bảo vệ màng tế bào lá, trì thẩm thấu, đảm bảo hoạt động quan quang hợp có stress, chống ROS Theo kết nghiên cứu La Việt Hồng cộng giống đậu tương DT 51 cho thấy: số điều kiện bất lợi, thực vật nói chung thực nhiều chế để chống chịu có tổng hợp số chất thẩm thấu tương thích prolin, glycin betain Từ phân tích tương quan hàm lượng prolin glycinbetain Kết cho thấy tương quan dương chặt chẽ prolin glycinbetain đậu tương [4] Kết nghiên cứu khác Nguyễn Văn Mã, Nguyễn Thị Minh Ngọc đối tượng đậu tương cho thấy biến động prolin đời sống thực vật [6] 2.5 Vai trò enzym phân giải chất dự trữ hạt mẩm Enzym α - amylaza enzym xúc tác cho trình thủy phân tinh bột, glycogen polyxacarit tương tự Chúng phân giải liên kết 1, 4-glucozit chuỗi mạch polyxacarit tạo thành đextrin phân tử thấp Do tác dụng enzym này, dung dịch tinh bột nhanh chóng bị khả tạo màu với dung dịch iot bị giảm độ nhớt mạnh Hàm lượng đường tan sản phẩm trình thủy phân tinh bột Sự tăng hoạt độ enzym α-amylaza làm tăng hàm lượng đường tan Đường tan chất tham gia điều chỉnh ASTT tế bào Sự gia tăng hoạt độ enzym α-amylaza làm tăng hàm lượng đường tan làm tăng ASTT tăng khả phản ứng hạn Proteaza enzym phân giải protein thành sản phẩm có khối lượng phân tử nhỏ axit amin, chuỗi polipeptit, nguyên liệu khởi đầu cho trình tổng hợp nên protein cấu trúc loại protein chức khác Chất dự trữ chủ yếu hạt đậu tương protein nên enzym proteaza enzym hoạt động chủ đạo q trình biến đổi hóa sinh hạt nảy mầm tạo nguồn nguyên liệu cho hô hấp, cung cấp lượng chất trung gian cho trình tổng hợp chất cần thiết cho nảy mầm sinh trưởng Hàm lượng protein mầm đậu tương cao nên phân giải protein diễn mạnh mẽ pha thấm nước Trong trình nảy mầm hoạt độ protein tăng theo đồng thời lượng protein phân giải ngày nhiều cung cấp lượng nguyên liệu sơ cấp cho mầm đậu tương tổng hợp chất 2.6 Vai trò chất chống oxy hoá Trong thể thực vật điều kiện bình thường, kiểm sốt chặt chẽ enzym chống oxi hoá superoxide dismutaza (SOD), catalaza (CAT), peroxidaza ( POX), ascorbat peroxydaza( APX), glutation reductaza ( GR) có khả làm bất hoạt hay loại bỏ gốc tự chứa oxy như: superoxide ( O2++), hydrogen peroxide (H2O2) gốc hydroxyl tự (OH -) Những dạng ơxy hoạt hố (ROS –reactive oxygen species) sản phẩm chuyển hoá oxy, thể gặp điều kiện sống bất lợi hạn, lạnh, mặn…hàm lượng dạng tăng đột biến, gây tượng “ stress oxy hố” Trong tế bào, chúng làm thay đổi tính thấm, độ dẫn điện, phân giải thành phần photpholipit, dẫn đến phá huỷ màng, gây tổn thương ADN quan phận, gây chết tế bào[2] Enzym catalaza peroxidaza enzim phổ biến thực vật, xúc tác phản ứng ơxi hóa sinh học, có vai trị quan trọng q trình hơ hấp chuyển hóa lượng thực vật Đây phương thức giải độc cho khỏi hydrơxyperơxit (H2O2) sinh q trình trao đổi chất, đặc biệt tăng bị stress III ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng nghiên cứu Đậu tương (Glycine Max (L) Merrill) giống trồng phổ biến nước ta giới Ở nước ta, đậu tương trồng sử dụng phổ biến cho người vật nuôi Hàm lượng protein cao hạt đậu nhiều hợp chất có giá trị khiến đậu tương trở thành thực phẩm quan trọng giới Thành phần dinh dưỡng đậu tương phong phú, hàm lượng protein cao nên đậu tương dùng chế biến thực phẩm giàu dinh dưỡng đáp ứng nhu cầu người như: bột ngũ cốc, bột đậu tương, giá đỗ Cây đậu tương dễ trồng, có khả thích nghi tương đối rộng với loại đất trồng nhờ khả cố định đạm vi khuẩn nốt sần cộng sinh rễ Ngoài ý nghĩa mặt dinh dưỡng, kinh tế, đậu tương cịn có tác dụng cao việc cải tạo đất, góp phần cắt đứt dây truyền sâu bệnh luân canh với trồng khác Giống đậu tương DT84 công nhận giống quốc gia năm 1995 Giống DT84 giống trồng phổ biến có tiềm năng suất cao, thích hợp mùa vụ Tuy nhiên, giống DT84 có tính chống chịu trung bình 3.2 Địa điểm tiến hành thí nghiệm: Phịng thí nghiệm môn Sinh học thực nghiệm – Sinh lý Thực vật trường Đại học Sư phạm Hà Nội 3.3 Bố trí thí nghiệm 3.3.1 Chuẩn bị - Dụng cụ: khay nhựa, giấy thấm khử trùng, nước cất - Hoá chất: dung dịch NaCl 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, dung dịch đường 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10% - Hạt giống đậu tương Chọn hạt giống khỏe, đặn, lấy hạt năm nơi nhân - Điều kiện gieo hạt: nhiệt độ thích hợp cho q trình nảy mầm 28 0C, phát triển điều kiện chiếu sáng 10giờ/ ngày 3.3.2 Thí nghiệm thăm dị thời gian thổi khơ liên tục, nồng độ dung dịch NaCl nồng độ dung dịch đường phù hợp nghiên cứu Theo kết nghiên cứu Kozushco (1984): hàm lượng nước bị từ 40% - 50% so với tổng lượng nước khởi động chế chống 10 chịu Vì chúng tơi thăm dị thổi khơ liên tục thời gian khác để xác định thời gian thổi khô làm 40% luợng nước hạt nảy mầm để nghiên cứu [14] Theo Volcova (1984): nồng độ dung dịch đường ảnh hưởng mạnh đến hút nước mầm hạt đậu 8,6% Vì chúng tơi thăm dị tìm nồng độ đường phù hợp nghiên cứu [15] Chúng tơi bố trí thí nghiệm thăm dị: - Sử dụng khay nhựa (kích thước 24 x 16 x (cm)) có lót giấy thấm bên khử trùng Mỗi giống gieo 100 hạt/ khay/1 nồng độ nghiên cứu Mỗi công thức lặp lại lần - Gieo hạt điều kiện cung cấp lượng nước 80- 110% so với khối lượng hạt (đối chứng) - Gieo hạt điều kiện thổi khô liên tục 1h/ ngày, 2h/ ngày, 3h/ ngày, 4h/ ngày, 5h/ ngày, 6h/ ngày, 7h/ ngày luồng khí vơ trùng box cấy - Gieo hạt điều kiện dung dịch NaCl có nồng độ: 0,5% ,1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3%, 3,5%, 4% - Gieo hạt điều kiện dung dịch đường saccaroza có nồng độ: 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10% , 11%, 12% - Chế độ chăm sóc: ban đầu gieo hạt với công thức cung cấp nước, bổ sung dung dịch muối, dung dịch đường cung cấp lượng nước cất dung dịch hoá chất 80 – 110% so với khối luợng hạt hàng ngày Theo dõi tỷ lệ nảy mầm sinh trưởng mầm điều kiện sau 1, 2, 3, ngày gieo hạt 3.3.3 Bố trí thí nghiệm xác định tiêu nghiên cứu 11 Sau lựa chọn thời gian thổi khô, nồng độ dung dịch NaCl nồng độ dung dịch đường nghiên cứu, tiến hành bố trí thí nghiệm: Sử dụng khay nhựa (kích thước 24 x 16 x (cm)) có lót giấy thấm gấp nếp bên khử trùng Mỗi khay gieo 100 hạt đậu tương Mỗi khay ứng với công thức thí nghiệm Mỗi cơng thức lặp lại lần - Gây hạn nhân tạo phương pháp thổi khô Gồm công thức nghiên cứu: ĐC: cung cấp lượng nước đầy đủ (100 - 110% so với khối lượng hạt.) K1: thổi khô sau ngày gieo hạt PHk1: phục hồi ( cung cấp nước trở lại )sau thổi khô lần 1(K1) K2: thổi khô sau ngày gieo hạt PHk2: phục hồi ( cung cấp nước trở lại )sau thổi khô lần 2(K2) K3: thổi khô sau ngày gieo hạt PHk3: phục hồi ( cung cấp nước trở lại )sau thổi khô lần 3(K3) K4: thổi khô sau ngày gieo hạt PHk4: phục hồi ( cung cấp nước trở lại )sau thổi khô lần 4(K4) K5: thổi khô sau 5ngày gieo hạt PHk5: phục hồi ( cung cấp nước trở lại )sau thổi khô lần 5(K5) Chúng tiến hành xác định tiêu nghiên cứu sau thổi khô sau tưới nước phục hồi ngày - Gây hạn sinh lí dung dịch đường Sử dụng khay nhựa (kích thước 24 x 16 x (cm)) có lót giấy thấm bên khử trùng Mỗi khay gieo 100 hạt Mỗi khay ứng với công thức, công thức lặp lại lần ĐC: cung cấp lượng nước đầy đủ (80- 110% so với khối lượng hạt) Đ1: mẫu trồng dung dịch đường sau ngày gieo hạt PHđ1: phục hồi ( trồng nước cất sau trồng dd đường ngày 12 Đ2: mẫu trồng dung dịch đường sau ngày gieo hạt PHđ2: phục hồi ( trồng nước cất sau trồng dd đường 2ngày Đ3: mẫu trồng dung dịch đường sau ngày gieo hạt PHđ3: phục hồi ( trồng nước cất sau trồng dd đường ngày Đ4: mẫu trồng dung dịch đường sau ngày gieo hạt PHđ4: phục hồi ( trồng nước cất sau trồng dd đường ngày Đ5: mẫu trồng dung dịch đường sau ngày gieo hạt PHđ5: phục hồi ( trồng nước cất sau trồng dd đường ngày Chúng tiến hành xác định tiêu nghiên cứu sau gây hạn sau tưới nước phục hồi ngày - Gây mặn nhân tạo dung dịch muối (NaCl) Sử dụng khay nhựa (kích thước 24 x 16 x (cm)) có lót giấy thấm bên khử trùng Mỗi khay gieo 100 hạt Mỗi khay ứng với công thức, công thức lặp lại lần ĐC: cung cấp lượng nước đầy đủ (80- 110% so với khối lượng hạt) M1: mẫu trồng dung dịch muối sau 1ngày gieo hạt PHm1: phục hồi ( trồng nước cất sau trồng dd muối ngày) M2: mẫu trồng dung dịch muối sau ngày gieo hạt PHm2: phục hồi ( trồng nước cất sau trồng dd muối 2ngày) M3: mẫu trồng dung dịch muối sau ngày gieo hạt PHm3: phục hồi ( trồng nước cất sau trồng dd muối 3ngày) M4: mẫu trồng dung dịch muối sau 4ngày gieo hạt PHm4: phục hồi ( trồng nước cất sau trồng dd muối ngày) M5: mẫu trồng dung dịch muối sau ngày gieo hạt 13 PHm5: phục hồi ( trồng nước cất sau trồng dd muối ngày) Chúng tiến hành xác định tiêu nghiên cứu sau gây mặn sau tưới nước phục hồi ngày 14 3.4 Phương pháp xác định tiêu nghiên cứu 3.4.1 Xác định tỷ lệ nảy mầm khả sinh truởng mầm - Xác định tỷ lệ nảy mầm hạt tiến hành thí nghiệm Những hạt nảy mầm hạt có chiều dài rễ mầm đạt từ mm trở lên, khả nảy mầm tính theo cơng thức sau : Tỷ lệ nảy mầm hạt = số hạt nảy mầm/tổng số hạt gieo x 100, đo hàng ngày ngày - Xác định khả sinh trưởng mầm + Chiều dài mầm mầm (mm): dùng thước chia đến mm đo chiều dài mầm từ chóp rễ đến chồi mầm Thời gian đo sau gieo 1, 2, 3, ngày + Khối lượng tươi mầm (g): rửa mầm nước, dùng giấy thấm thấm nước, sau cân cân phân tích thời điểm sau gieo 1, 2, 3, ngày 3.4.2 Xác định hàm lượng prolin phương pháp Bates cs (1973)[7] Nguyên tắc thí nghiệm: dựa phản ứng prolin dung dịch ninhydrin axit tạo hợp chất màu vàng, hấp thụ bước sóng đặc trưng 520nm Cơng thức tính hàm lượng prolin xác định sở tham khảo Reigosa Roger M.J Prolin (µg/g) = X (µg/ ml) x V (ml) x df / w(g) Trong đó: X: giá trị OD520 mẫu V: thể tích dịch chiết df: hệ số pha loãng w: khối lượng mẫu 15 3.4.3 Xác định hàm lượng glycinbetain theo Grieve Grattan (1983) [7] Nguyên tắc thí nghiệm: dựa phản ứng glycine betaine với 1,2diclometan tạo lớp chất hữu xác định mật độ quang học bước sóng 365nm Cơng thức tính hàm lượng glycinbetain: Glycine betaine (mg/ g) = Y(µg/ ml) x V(ml) x df/( 1000 x w (g)) Trong đó: Y: nồng đội glycinbetain tính theo đường chuẩn glycinbetain (µg/ ml) V: thể tích mẫu dịch chiết df: hệ số pha loãng w: khối lượng mẫu 3.4.4 Xác định hoạt độ enzym amylaza theo Nguyễn Văn Mùi [7] Ngun tác thí nghiệm: nhóm khử giải phóng từ thuỷ phân tinh bột khử axit 3,5- dinitrosalixilic, kết hình thành sản phẩm có màu đo quang phổ bước sóng 540nm Cơng thức tính: U/ml = µmol maltose (release) x df / (0,5 x 3) Trong đó: µmol maltose: lượng maltose giải phóng ra, tính dựa vào đường chuẩn maltose df: hệ số pha loãng 0,5: thể tích dịch chiết enzym sử dụng phản ứng 3.4.5 Xác định hoạt độ enzym proteaza theo phương pháp Anson cải tiến theo mô tả Nguyễn Văn Mùi (2001)[7] Nguyên tắc thí nghiệm: proteaza tác dụng với chất casein Sau thời gian protein lại kết tủa axit tricloaxetic, xác địng sản phẩm tạo thành phản ứng màu với thuốc thử Folin – Ciocalteu Sản 16 phẩm đo quang phổ bước sóng 750nm Cơng thức tính hoạt độ ml dung dịch enzym : X( U/ml) = a.8.b/t Trong đó: X: số đơn vị hoạt độ 1ml dịch triết enzym Thể tích hồn hợp phản ứng TCA (ml) a: số µmol tiozin tương ứng với hiệu số giá trị mật độ quang ống thí nghiệm ống đối chứng b: hệ số pha loãng dung dịch enzym 3.4.6 Xác định hoạt độ enzym catalaza phương pháp quang phổ [7] Nguyên tắc: dựa vào khả hấp thụ ánh sáng UV 230 – 250 nm H2O2 Catalaza xúc tác phân huỷ H 2O2 dẫn đến giảm hấp thụ theo thời gian Hoạt độ enzym đo giảm độ hấp thụ Cơng thức tính hoạt độ enzym theo thể tích: U/ ml enzym= 3,45 x df / (0,1 x t) Trong đó: 3,45: tương ứng với 3,45 µmol H 2O2 bị phân huỷ ml hỗn hợp phản ứng, làm giảm độ hấp thụ A240nm từ 0,45 xuống 0,4 df: yếu tố pha loãng 0,1: ml enzym phân tích 3.4.7 Xác định hoạt độ enzym peroxidaza phương pháp so màu sử dụng pyrogallol làm chất theo Nguyễn Văn Mùi [7] Nguyên tắc: peroxidasza phân gải H 2O2 thành H2O O2, có mặt chất cho hiro pyrogallo Sự oxi hố pyrogallo thành sản phẩm có màu purpurogallin đo quang phổ bước song 430 nm với khoảng thời gian đặc hiệu cường độ sản phẩm tỷ lệ với hoạt độ enzym IV NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Chương 1: Động thái hàm lượng chất có vai trị bảo vệ mầm đậu tương điều kiện thiếu nước nhiễm mặn 17 1.1 Động thái hàm lượng prolin mầm đậu tương điều kiện stress 1.1.1 Sự biến động hàm lượng prolin pha gây hạn pha phục hồi sau hạn mầm đậu tương 1.1.2 Sự biến động hàm lượng prolin pha gây mặn phục hồi sau mặn mầm đậu tương 1.2 Động thái hàm lượng glycinbetanin mầm đậu tương điều kiện stress môi trường 1.2.1 Sự biến động hàm lượng glycinbetain pha gây hạn phục hồi sau hạn mầm đậu tương 1.2.2 Sự biến động hàm lượng glycinbetain pha gây mặn phục hồi sau mặn mầm đậu tương Chương 2: Động thái hoạt độ enzym phân giải chất dự trữ mầm hạt đậu tương điều kiện thiếu nước nhiễm mặn 2.1 Động thái hoạt độ enzym amylaza mầm đậu tương chịu stress môi trường 2.1.1 Sự biến động hoạt độ enzym amylaza pha gây hạn pha phục hồi sau hạn mầm đậu tương 2.1.2 Sự biến động hoạt độ enzym amylaza pha gây mặn pha phục hồi sau mặn mầm đậu tương 2.2 Động thái hoạt độ enzym proteaza mầm đậu tương chịu stress môi trường 2.2.1 Sự biến động hoạt độ enzym proteaza pha gây hạn pha phục hồi sau gây hạn mầm đậu tương 2.2.2 Sự biến động hoạt độ enzym proteaza pha gây mặn pha phục hồi sau mặn mầm đậu tương 18 Chương 3: Động thái hoạt độ enzym chống oxi hoá mầm đậu tương điều kiện thiếu nước nhiễm mặn 3.1 Động thái hoạt độ enzym catalaza mầm đậu tương chịu tác động stress môi trường 3.1.1 Sự biến động hoạt độ enzym catalaza pha gây hạn phục hồi sau hạn mầm đậu tương 3.1.2 Sự biến động hoạt độ enzym catalaza pha gây mặn phục hồi sau mặn mầm đậu tương 3.2 Động thái hoạt độ enzym peroxidaza mầm đậu tương chịu stress môi trường 3.2.1 Sự biến động hoạt độ enzym peroxidaza pha gây hạn phục hồi sau hạn mầm đậu tương 3.2.2 Sự biến động hoạt độ enzym peroxidaza pha gây mặn phục hồi sau mặn mầm đậu tương Chương 4: Khả nảy mầm sinh trưởng mầm đậu tương điều kiện thiếu nước nhiễm mặn 4.1 Tỷ lệ nảy mầm sinh trưởng mầm đậu tương pha gây hạn phục hồi sau hạn 4.2 Tỷ lệ nảy mầm sinh trưởng mầm pha gây mặn phục hồi sau mặn IV KẾT LUẬN -Trong trình nảy mầm hạt đậu tương, xác định chất hình thành sớm giúp hạt nảy mầm chống chịu với điều kiện stress môi trường - Vai trị chất hình thành chế chống chịu giai đoạn khác trình nảy mầm hạt - Ảnh hưởng stress mơi trường đến chất có vai trị quan trọng trình nảy mầm 19 - Biến động chất hình thành giúp chống chịu pha phục hồi trình nảy mầm - So sánh mức độ ảnh hưởng hai loại stress khả phục hồi sau stress trình nảy mầm V TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Hữu Cường, Nguyễn Thị Kim Anh, Đinh Thị Phòng, Lê Thị Muội, Lê Trần Bình (2003), “Mối tương quan hàm lượng prolin tính chống chịu lúa”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 1(1), tr 85 – 91 Mai Văn Chung (2014), “ Các gốc ôxy tự phản ứng bảo vệ đậu”, tạp chí Khoa học Cơng nghệ Nghệ An, số 3, Tr16-19 Điêu Thị Mai Hoa, Nguyễn Phương Thảo, Lê Thị Thanh Hiếu (2011), “Ảnh hưởng áp suất thẩm thấu cao đến nảy mầm, hoạt tính enzyme α-amylase tích lũy prolin mầm đậu xanh (Vigna radiata)”, Tạp chí khoa học, Đại học Sư Phạm Hà Nội, Số 56,Ttr 106 – 114 La Việt Hồng cộng (2014), “Sự tương quan hàm lượng prolin glycinbetain đậu tương vào giai đoạn hoa điều kiện nhiệt độ thấp, mặn han” Tạp chí khoa học giáo dục Trường ĐHSP Đà Nẵng, số 10 (01) Trần Thị Phương Liên (1999), Nghiên cứu đặc tính hóa sinh sinh học phân tử số giống đậu tương có khả chịu nóng, chịu hạn Việt Nam, Luận án tiến sĩ sinh học, Viện công nghệ sinh học Hà Nội Nguyễn Văn Mã, Nguyễn Thị Minh Ngọc (2008), “Hàm lượng prolin trình sinh trưởng đậu tương”, Nghiên cứu khoa học sống, NXB Khoa học Kỹ thuật, Tr.342 – 344 Nguyễn Văn Mã, La Việt Hồng, Ong Xuân Phong (2013), Phương pháp nghiên cứu Sinh lý học Thực vật, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội 20 Nguyễn Tấn Lê, Vũ Đình Ngàn (2010), “ Nghiên cứu đời sống lạc ( Arachis hypogea L.) điều kiện nóng hạn vụ hè Đà Nẵng”, Tạp chí Khoa học Công nghệ, Số 5, Tr.117- 124 Vũ Ngọc Thắng, Nguyễn Ngọc Quất, Nguyễn Thu Huyền, Nguyễn Quang Dũng, Nguyễn Văn Thắng, Vũ Đình Chính (2011), “ Ảnh hưởng hạn đến khả nảy mầm số giống đậu xanh triển vọng”, Tạp chí Khoa học Phát triển, Tập 9, Số 6, Tr.912- 919 10 Delauney A.J, Verma DP.S (1993), “ Proline biosynthesis and osmoregulation in plants” The plant journal, V4 pp: 215- 223 11 Diego Ariel, Marta Rosalia Gulotta, Carlos Alberto Martinez Marco Antonio Oliva (2004), “ The effects of salt stress on growth, nitrate reduction and praline and glycinebetaine accumulation in Prosopis alba”, Braz J Plant Physiol, 16 (01), pp: 39 – 46 12 Giri J (2011), “ Glycinebetaine and abiotic stress tolerance in plants”, Plant Signaling & Behavior 6:11, 1746- 1751 13 Titop, Akimosva, Talamosva, Topchiepva, Tính chống chịu thực vật thời gian đầu tác động nhiệt độ bất lợi (bản dịch) 14 Kozushco (1984), Xác định khả chịu hạn hạt ngũ cốc theo thay đổi thông số chế độ nước (bản dịch) 15 Volcova (1984), Xác định khả chịu nóng chịu hạn tương đối mẫu hạt đậu phương pháp cho nảy mầm dung dịch sacaroza xử lý nhiệt (bản dịch) 16 http://www.tiennong.vn/vn/tt/tinh-chong-chiu-sinh-ly-cua-thuc- vat-doi-voi-dieu-kien-ngoai-canh-bat-thuan_1382.aspx 17.http://www.pgrvietnam.org.vn/UserFiles/File/Cong%20nghe %20sinh%20hoc/NC%20Kha%20nang%20chiu%20man%20v %C3%A0%20da%20dang%20DT%20cua%20lua.pdf 21 ... chọn đề tài ? ?Nghiên cứu động thái hàm lượng prolin, glycinbetain hoạt độ số enzym mầm đậu tương điều kiện thiếu nước nhiễm mặn? ?? 1.2 Mục tiêu nghiên cứu - Nghiên cứu động thái hàm lượng prolin... hồi sau mặn mầm đậu tương 18 Chương 3: Động thái hoạt độ enzym chống oxi hoá mầm đậu tương điều kiện thiếu nước nhiễm mặn 3.1 Động thái hoạt độ enzym catalaza mầm đậu tương chịu tác động stress... gây mặn phục hồi sau mặn mầm đậu tương Chương 2: Động thái hoạt độ enzym phân giải chất dự trữ mầm hạt đậu tương điều kiện thiếu nước nhiễm mặn 2.1 Động thái hoạt độ enzym amylaza mầm đậu tương