tài liệu phương pháp sắc ký

Nội dung Chương Phương pháp sắc ký 9.1 Định nghĩa 9.2 Phân loại sắc ký 9.3 Các đại lượng đặc trưng sắc ký 9.3.1 Sắc ký đồ 9.3.2 Mối quan hệ thời gian lưu hệ số phân bố 9.4 Hiệu tách 9.4.1 Độ phân giải 9.4.2 Sự khuếch tán 9.4.3 Chiều cao đĩa 10 9.4.4 Phương trình chiều cao đĩa 11 9.5 Ứng dụng phương pháp sắc ký 12 9.5.1 Phân tích định tính 12 9.5.2 Phân tích định lượng 13 9.6 Câu hỏi ôn tập 14 Chương Phương pháp sắc ký 9.1 Định nghĩa Nguyên lý hoạt động sắc ký trình chiết pha giữ cố định pha động di chuyển qua pha cố định Dung môi rửa giải CỘT SẮC KÝ Dung môi giải hấp Chất lỏng vào cột gọi dung môi rửa giải Chất lỏng khỏi cột gọi dung môi giải hấp Quá trình mà chất khí hay chất lỏng qua cột sắc ký gọi trình rửa giải Cột sắc ký nhồi với hạt có kích thước nhỏ hình vẽ 9-1 Hình 9-1 Ý tưởng đằng sau sắc ký: chất tan A có độ hấp phụ lớn pha tĩnh so với chất tan B, lưu lại cột lâu 9.2 Phân loại sắc ký Trên sở tương tác chất tan pha tĩnh người ta chia sắc ký làm loại sau đây: - Sắc ký hấp phụ: Pha tĩnh chất rắn, pha động chất lỏng hay khí Chất tan hấp phụ bề mặt hạt rắn Các chất tan hấp phụ mạnh di chuyển chậm cột (hình 9-2) Hình 9-2 Sắc ký hấp phụ sắc ký phân bố Hình 9-3 Sắc ký trao đổi ion sắc ký loại cỡ phân tử Hình 9-4 Sắc ký lực - Sắc ký phân bố: Pha tĩnh chất lỏng liên kết với bề mặt rắn, thường SiO2 Pha tĩnh thường chất khí Cân chất tan với pha tĩnh pha lỏng thiết lập sắc ký khí (hình 9-2) - Sắc ký trao đổi ion: Các loại nhựa trao đổi ion, ví dụ nhựa trao đổi anion nhựa trao đổi cation – hay liên kết với pha tĩnh liên kết cộng hóa trị Pha động chất lỏng chứa ion chất tan có điện tích trái dấu liên kết với pha tĩnh lực tĩnh điện (hình 9-3) - Sắc ký loại cỡ phân tử: gọi sắc ký lọc gel hay sắc ký thẩm thấu gel Kỹ thuật sắc ký cho phép tách phân tử dựa kích thước Các chất tan có kích thước lớn qua cột nhanh chóng Trong trường hợp lý tưởng sắc ký loại cỡ phân tử, tương tác pha động chất tan Pha động chất khí hay lỏng qua gel xốp Các lỗ xốp đủ nhỏ để loại phân tử chất tan có kích thước lớn Các phân tử lớn không cần thâm nhập vào lỗ xốp Do vậy, phân tử nhỏ cần nhiều thời gian để qua cột (hình 9-3) - Sắc ký lực: Đây loại sắc ký có độ chọn lọc cao sử dụng tương tác chọn lọc phân tử chất tan phân tử thứ hai, phân tử gắn với pha tĩnh nhờ liên kết cộng hóa trị Ví dụ, phân tử bất động kháng thể với loại protein cụ thể Khi có hỗn hợp chứa hàng nghìn protein qua cột, có protein phản ứng với kháng thể liên kết cột Tất chất tan khác rửa từ cột, protein cần tách tách cách thay đổi độ pH cường độ ion (hình 9-4) 9.3 Các đại lượng đặc trưng sắc ký 9.3.1 Sắc ký đồ Sắc ký đồ đồ thị mô tả phản hồi detector với thời gian rửa giải Hình 9-5 sắc ký đồ hỗn hợp chứa octan, nonan chất chưa biết tách phương pháp sắc ký Hình 9-5 Sơ đồ sắc ký khí lực theo thời gian lưu Thời gian lưu, tr , cấu tử thời gian cần thiết để cấu tử tiếp cận với detector kể từ lúc bơm vào cột Thể tích lưu, Vr , thể tích pha động cần thiết để rửa giải chất tan khỏi cột Pha động chuyển động dọc theo cột chất tan với thời gian tm Thời gian lưu hiệu chỉnh, , chất tan thời gian cần thiết để chất tan di chuyển theo chiều dài cột trừ thời gian cần thiết để dung môi qua cột Thời gian lưu hiệu chỉnh: = tr – t m (9-1) Trong sắc ký khí, tm thường lấy thời gian cần thiết để CH4 chuyển động qua cột (hình 95) Với hai cấu tử 2, lưu tương đối, tỉ số thời gian lưu hiệu chỉnh chúng: Sự lưu tương đối: α= (9-2) , nên α>1 Sự lưu tương đối lớn, khả tách hai cấu tử khỏi lớn Sự lưu tương đối không phụ thuộc vào tốc độ chảy sử dụng để xác định pic tốc độ chảy thay đổi Đối với pic sắc ký đồ, thừa số dung tích, k’, định nghĩa: Thừa số dung tích: k’ = (9-3) Các cấu tử lưu lại cột lâu thừa số dung tích lớn Để theo dõi hiệu suất cột sắc ký, tốt kiểm tra đo thừa số dung tích, số đĩa tính đối xứng pic Việc thay đổi tham số giảm hiệu suất cột Ví dụ tham số lưu: Một hỗn hợp gồm benzen, toluen metan bơm vào cột sắc ký khí Metan cho tín hiệu 42s, benzen 251s toluen bị rửa giải 333s Hãy xác định thời gian lưu hiệu chỉnh thừa số dung tích cho chất tan lưu tương đối Giải Thời gian lưu hiệu chỉnh: Benzen: = tr – tm = 251 – 42 = 209s Toluen: = tr – tm = 333 – 42 = 291s Thừa số dung tích: Benzen: k’ = = = 5.0 Toluen: k’ = = = 6.9 Sự lưu tương đối diễn tả dạng tỉ số thời gian lưu hiệu chỉnh toluen benzen: α= = = 1.39 9.3.2 Mối quan hệ thời gian lưu hệ số phân bố Thừa số dung tích phương trình 9-3 tương đương với: k’ = = = (9-4) Cs nồng độ chất tan pha tĩnh, Vs thể tích pha tĩnh, Cm nồng độ chất tan pha động Vm thể tích pha động Tỉ số Cs/Cm tỉ số nồng độ chất tan pha tĩnh pha động Nếu cột chuyển động đủ chậm để đạt cân bằng, tỉ số Cs/Cm hệ số phân bố, K, giới thiệu chương chiết Do đó, biểu diễn phương trình 9-4 dạng: k’ = K = = (9-5) liên quan đến thời gian lưu tới hệ số phân bố thể tích pha tĩnh pha động Do , lưu tương đối diễn đạt: α= = = (9-6) Điều có nghĩa lưu tương đối hai chất tan tỉ lệ với tỉ số hệ số phân bố chúng Mối liên hệ sở vật lý phương pháp sắc ký Thể tích lưu,Vr , thể tích pha động cần thiết để rửa giải chất tan cụ thể khỏi cột: Thể tích lưu: Vr = tr×uv (9-7) uv tốc độ chảy pha động (thể tích đơn vị thời gian) Thể tích lưu chất tan cụ thể không đổi phạm vi tốc độ chảy 9.4 Hiệu tách 9.4.1 Độ phân giải Các chất tan chuyển động qua cột sắc ký có xu hướng phân bố đường cong Gauxơ với độ lệch chuẩn σ (hình 9-6) Thời gian sử dụng để di qua cột dài, pic sắc ký tù Thông thường người ta đo độ rộng độ cao nửa chiều cao pic w1/2 Từ phương trình đường cong Gauxơ thấy w1/2 = 2.35σ w = 4σ Hình 9-6 Đường cong Gauxơ lý tưởng để đo w w1/2 Các giá trị w thu cách ngoại suy tiếp tuyến với điểm uốn xuống đường sở Hình 9-7 Độ phân giải pic Gauxơ có diện tích biên độ Đường nét đứt cho thấy pic riêng biệt dòng liền tổng hai đỉnh pic Phần chồng sắc ký đồ phần bóng mờ Trong sắc ký, độ phân giải hai pic với định nghĩa là: Độ phân giải = (9-8) đây, Δtr hay ΔVr tách hai pics (đơn vị thời gian hay thể tích) wav độ rộng trung bình hai pic Ngoài ra, độ phân giải biểu diễn qua việc sử dụng w1/2av chiều rộng nửa chiều cao đỉnh đường cong Gauxơ Hình 9-7 cho thấy chồng chéo hai đỉnh với mức độ khác độ phân giải Đối với phân tích định lượng, độ phân giải > 1,5 điều đợi 9.4.2 Sự khuếch tán Hình 9-8 Sự mở rộng pic di chuyển qua cột sắc ký Khi chuyển động qua cột, lý tưởng pic sắc ký có dạng hình Gauxơ, theo chiều dài cột pic có độ rộng lớn (hình 9-8) Ít lý tưởng hơn, pic sắc ký có dạng không đối xứng Hình 9-9 Thông lượng phân tử khuếch tán qua đơn vị diện tích tỷ lệ thuận với gradient nồng độ hệ số khuếch tán: J =- D (dc / dx) Một nguyên nhân nở pic khuếch tán Hệ số khuếch tán đo di chuyển ngẫu nhiên từ nơi có nồng độ cao đến nơi có nồng độ thấp Hình 9-9 cho thấy khuếch tán tự phát chất tan qua mặt phẳng với gradien nồng độ dc/dx Số mol chất tan qua mét vuông giây gọi thông lượng, J, tỉ lệ thuận với gradien nồng độ: (9-9) Bảng 9-1 cho thấy khuếch tán chất lỏng chậm 104 lần so với khuếch tán pha khí Các phân tử có khối lượng mol lớn ribonuclease albumin khuếch tán chậm từ 10 đến 100 lần so với phân tử nhỏ Giả sử chất tan di chuyển qua cột với m mol đơn vị diện tích cắt ngang cột, nở đường cong Gauxơ mô tả bằng: (9-10) c nồng độ (mol/m3), t thời gian, x khoảng cách dọc theo cột đỉnh pic (đỉnh pic x luôn = 0) So sánh phương trình 9-10 phương trình cho ta thấy độ lệch chuẩn đám là: σ= (9-11) Bảng 9-1 Hệ số khuếch tán 298 K Chất tan Dung môi Hệ số khuếch tán (m2/s) H2O H2O 2,3×10-9 Sucrose H2O 0,52×10-9 Glycine H2O 1,1×10-9 CH3OH H2O 1,6×10-9 Ribonuclease (M = 13700g/mol) H2O (293K) 0,12×10-9 Serum albumin (M = 65000 g/mol) H2O (293K) 0,059×10-9 I2 Hexane 4,0×10-9 CCl4 Heptane 3,2×10-9 N2 CCl4 3,4×10-9 CS2 Không khí (293K) 1,0×10-5 O2 (g) Không khí (273K) 1,8×10-5 H+ H2O 9,3×10-9 OH- H2O 5,3×10-9 Li+ H2O 1,0×10-9 Na+ H2O 1,3×10-9 K+ H2O 2,0×10-9 Cl- H2O 2,0×10-9 I- H2O 2,0×10-9 9.4.3 Chiều cao đĩa Phương trình 9-11chỉ độ lệch chuẩn nở pic Nếu chất tan di chuyển khoảng x với tốc độ chảy ux (m/s) thời gian cần thiết để di chuyển t = x/ux Do vậy, σ2 = 2Dt = 2D Chiều cao đĩa: = = H.x H= (9-12) (9-13) Chiều cao đĩa số tỉ lệ với phương sai, σ2, đám khoảng cách vừa qua, x Tên gọi có nguồn gốc từ lý thuyết chưng cất mà tách thực giai đoạn rời rạc gọi đĩa Chiều cao đĩa gọi chiều cao tương đương với đĩa lý thuyết Chiều cao đĩa xấp xỉ với độ dài cột cần thiết cho cân chất tan pha động pha tĩnh Chiều cao đĩa nhỏ, độ rộng pic sắc ký hẹp Khả tách cấu tử hỗn hợp khỏi cột cải thiện giảm chiều cao đĩa Cột có hiệu tách tốt có nhiều đĩa lý thuyết Các chất tan khác qua cột xác định có chiều cao đĩa khác chúng có hệ số khuếch tán khác Chiều cao đĩa ~0,1 tới mm sắc ký khí, ~10μm sắc ký lỏng hiệu cao mao mạch điện di Chiều cao đĩa có giá trị , σ độ lệch chuẩn pic hình Gauxơ hình 9- x khoảng di chuyển Nếu chất tan thoát từ cột có độ dài L số đĩa N toàn cột chiều dài cột chia cho chiều cao đĩa: N= = = = Bởi x = L σ = w/4 Trong mô tả này, w có thứ nguyên chiều dài số đĩa không thứ nguyên Nếu diễn ta L w (hay σ) dạng đơn vị thời gian thay chiều dài, sỗ đĩa N không thứ nguyên Chúng ta nhận phương trình: Số đĩa cột: N = = (9-14a) 10 Ở tr thời gian lưu pic w độ rộng pic (xem hình 9-7) với đơn vị thời gian Nếu sử dụng độ rộng ứng với nửa chiều cao pic thay độ rộng chân pic nhận được: Số đĩa cột: N = (9-14b) Ví dụ: Tính toán số đĩa Một chất tan có thời gian lưu 407s có độ rộng chân pic 13 s cột có chiều dài 12,2 m Tính số đĩa chiều cao đĩa Giải N= = H= = = 1,57.104 = 7,77×10-4 m = 0,777mm 9.4.4 Phương trình chiều cao đĩa Hình 9-10 Ứng dụng phương trình Van Deemter vào sắc ký khí, A = 1,65mm, B = 25,8 mm.ml/phút; C = 0,0236 mm Phút/ml Chiều cao đĩa, H, tỉ lệ với phương sai pic sắc ký (phương trình 9-13): Chiều cao đĩa nhỏ pic hẹp Phương trình Van Deemter cho ảnh hưởng cột lưu lượng tới chiều cao đĩa: 11 H≈A+ + C×ux (9-15) Trong A, B, C số cột pha tĩnh cụ thể, ux tốc độ chảy (m/s) Hằng số A liên quan đến tác dụng khuếch tán xoáy, mà khuếch tán xoáy lại phụ thuộc kích thước hạt hấp phụ mật độ nhồi cột B liên quan đến hệ số khuếch tán phân tử pha động có chịu ảnh hưởng khuếch tán dọc cột C đặc trưng cho trình hấp phụ giải hấp, trình chuyển khối số yếu tố khác Thay đổi cột pha tĩnh dẫn đến thay đổi A, B C Đối với cột nhồi (packed columns) A, B, C ≠ ba yếu tố ảnh hưởng đến nở pic Đối với cột ống mở (open tubular columns), A = độ rộng pic giảm độ phân giải tăng Trong điện di mao quản (capillary electrophoresis) A C 0, chiều cao đĩa giảm tới cỡ micro hiệu tách tăng lớn 9.5 Ứng dụng phương pháp sắc ký 9.5.1 Phân tích định tính Sắc ký sử dụng rộng rãi để nhận diện có mặt hay vắng mặt cấu tử hỗn hợp Ví dụ, 30 amino axit protein hydrolysate phát với sắc ký đồ Ngoài ra, dựa vào thời gian lưu người ta phân tích định tính chất cần xác định có sắc ký đồ chuẩn Khi cột sắc ký kết nối với detector UV, hồng ngoại hay khối phổ, người ta dễ dàng hơn phân tích định tính 12 Hình 9- Sắc ký đồ phân ch Hình 9- Sắc ký đồ phân ch ph t ; tr u - u u máu chất ma túy áu c th chuẩn MA, MDMA, MDA-d5 (tr 14 ph t ; tr - 13 ph t) 99 9.5.2 Phân tích định lượng Chuẩn hoá diện tích pic: Coi tỷ lệ % diện tích pic chiều cao pic tương ứng với tỷ lệ % khối lượng chất Chủ yếu áp dụng cho phân tích tinh dầu,… Ngoại chuẩn: Đường ngoại chuẩn điểm nhiều điểm Xây dựng đường ngoại chuẩn dựa mối tương quan diện tích píc chiều cao pic với nồng độ chất Nội chuẩn: Đường chuẩn nội xây dựng dựa vào mối tương quan nồng độ chất tỷ lệ diện tích pic chất chuẩn với chất nội chuẩn 13 Thêm chuẩn: Chất chuẩn thêm vào mẫu thử Hình 9- Đồ thị tương quan n tính tỷ lệ diện tích pic tỉ lệ lượng chất MA/MDA-d5 m u máu (phương pháp nội chuẩn) 9.6 Câu hỏi ôn tập Nêu yếu tố ảnh hưởng đến độ phân giải chiều cao đĩa lý thuyết sắc ký Nêu thủ tục phân tích định lượng phương pháp sắc ký Hãy giải thích phương pháp nội chuẩn có độ xác cao Cho cột sắc ký có chiều dài 120cm, tiến hành phân tích hai chất A B thu kết sau: Chất Thời gian lưu tr(s) Độ rộng chân pic w(s) A trA = 250 wA =15 (s) B trB = 270 wA =17 (s) Cho biết thời gian lưu pha động tm = 30s Tính (a) Số đĩa lý thuyết cột tách N =? (b) Chiều cao đĩa lý thuyết H = ? (c) Độ phân giải cột tách R = ? Hai chất A B có tách khỏi không? (d) Sự lưu tương đối? (e) Để tách hai chất hoàn toàn khỏi cột sắc ký phải có chiều dài tối thiểu bao nhiêu? 14 [...]... cực kỳ lớn 9.5 Ứng dụng phương pháp sắc ký 9.5.1 Phân tích định tính Sắc ký được sử dụng rộng rãi để nhận diện sự có mặt hay vắng mặt của các cấu tử trong hỗn hợp Ví dụ, hơn 30 amino axit trong protein hydrolysate có thể được phát hiện với sắc ký đồ Ngoài ra, dựa vào thời gian lưu người ta có thể phân tích định tính khi các chất cần xác định có sắc ký đồ chuẩn Khi các cột sắc ký được kết nối với detector... diện tích pic và tỉ lệ lượng chất của MA/MDA-d5 trong m u máu (phương pháp nội chuẩn) 9.6 Câu hỏi ôn tập 1 Nêu các yếu tố ảnh hưởng đến độ phân giải và chiều cao đĩa lý thuyết trong sắc ký 2 Nêu các thủ tục trong phân tích định lượng bằng phương pháp sắc ký Hãy giải thích tại sao phương pháp nội chuẩn có độ chính xác cao nhất 3 Cho một cột sắc ký có chiều dài 120cm, tiến hành phân tích hai chất A và B... chiều cao của đĩa Giải N= = H= = = 1,57.104 = 7,77×10-4 m = 0,777mm 9.4.4 Phương trình chiều cao đĩa Hình 9-10 Ứng dụng phương trình Van Deemter vào sắc ký khí, A = 1,65mm, B = 25,8 mm.ml/phút; C = 0,0236 mm Phút/ml Chiều cao đĩa, H, tỉ lệ với phương sai của pic sắc ký (phương trình 9-13): Chiều cao đĩa càng nhỏ thì pic càng hẹp Phương trình Van Deemter chỉ ra cho chúng ta ảnh hưởng của cột và lưu lượng... khi các chất cần xác định có sắc ký đồ chuẩn Khi các cột sắc ký được kết nối với detector UV, hồng ngoại hay khối phổ, người ta có thể dễ dàng hơn hơn khi phân tích định tính 12 Hình 9- Sắc ký đồ phân ch Hình 9- Sắc ký đồ phân ch ph t ; tr của u - u u máu không có chất ma túy áu c th chuẩn MA, MDMA, MDA-d5 (tr của là 14 9 ph t ; tr của - 5 là 13 5 ph t) là 9 99 9.5.2 Phân tích định lượng 1 Chuẩn hoá... cột tách N =? (b) Chiều cao đĩa lý thuyết H = ? (c) Độ phân giải của cột tách R = ? Hai chất A và B có tách khỏi nhau không? (d) Sự lưu tương đối? (e) Để tách hai chất hoàn toàn ra khỏi nhau thì cột sắc ký phải có chiều dài tối thiểu bằng bao nhiêu? 14