PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ DƯỢC LIỆU

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ Sắc ký phương pháp phân tách lý - hóa chất tách khỏi hỗn hợp dựa “phân bố” liên tục chúng pha, pha không chuyển động (pha tĩnh) pha chuyển động (pha động) dịch chuyển qua pha tĩnh theo phương định Trong phương pháp phân tách nay, sắc ký phương pháp hữu hiệu để tách chất khỏi hỗn hợp, hỗn hợp phức tạp thành phần khác hàm lượng trọng hỗn hợp dịch chiết từ hợp chất từ cỏ Từ phương pháp sắc ký đời (1903) nhiều kỹ thuật sắc ký cải tiến pha tĩnh, thiết bị phương pháp phát phát triển áp dụng thực tế để phân tích định tính, định lượng chiết tách chất, đặc biệt thành phần hóa học cỏ Theo định nghĩa, yếu tố quan trọng hệ thống sắc ký định đến khả tách hỗn hợp mẫu xác định pha tĩnh pha động Với pha tĩnh, chế phân tách yếu tố quan trọng Các pha tĩnh sử dụng sắc ký dựa chế phân tách khác nhau: phân bố, hấp thu, rây phân tử, trao đổi ion, điện di, lực Trong đó, chế phân bố hấp thu chế sử dụng chủ yếu Khả phân tách pha tĩnh phụ thuộc nhiều vào mức độ tiếp xúc pha tĩnh với mẫu thử pha động Yếu tố liên quan đến diện tích bề mặt riêng mật độ pha tĩnh Diện tích bề mặt riêng lớn (kích thước tiểu phân pha tĩnh nhỏ) khả phân tách pha tĩnh lớn Mật độ pha tĩnh cao, khả tạo cân pha lớn, hệ phân tách tốt Pha tĩnh thông dụng dùng sắc ký hấp phụ Silica gel Nhôm oxyd chất hập phụ khác dùng mức độ thấp nhiều Sắc ký pha thuận thường dùng sắc ký lớp mỏng kỹ thuật sắc ký cột cổ điển hay cải tiến Với chế phân bố, pha tĩnh (a) chất lỏng thực sự, hay (b) lớp chất lỏng tẩm hay phủ lên bề mặt giá mang rắn, (c) gắn vào giá mang rắn liên kết hóa học (pha liên kết – boned phase) (a) thường pha tĩnh sắc ký phân bố ngược dòng; (b) thường gặp pha tĩnh sắc ký khí sắc ký giấy (c) loại phổ biến nay, thường dùng sắc ký lỏng cao áp, sắc ký lỏng tới hạn Chất lỏng sử dụng làm pha tĩnh chất phân cực (phân bố pha thuận) hay không phân cực (phân bố pha đảo) Phần lớn phân tích HPLC sử dụng pha đảo RP-18 với pha tĩnh mạch hydrocarbon có 18 carbon gắn vào giá mang Silica gel Với pha động, chất pha động có ảnh hưởng quan trọng tới trình phân tách hệ sắc ký Pha động thường hệdung môi gồm có hai (hay nhiều hơn) dung môi phối hợp với theo tỷ lệ thích hợp Một pha động tốt pha động có khả phân tách tốt chất không phức tạp thành phần hay tỷ lệ, rẻ tiền, không độc hai thân thiện với môi trường Thành phần tỉ lệ dung môi pha động không đổi suốt trình phân tích sắc ký (như sắc ký lớp mỏng, sắc ký giấy hay sắc ký lỏng cao áp đẳng dung môi – isocratic) hay thay đổi theo hướng tăng dần độ mạnh hệ dung môi (rửa giải theo gradient sắc ký cột loại) Một yếu tố quan trọng khác tốc độ dòng pha động Tốc độ dòng phải tối ưu hóa để đạt cân pha với số đĩa lý thuyết hệ thống lớn không làm tăng tượng giãn rộng băng chất tách khỏi hỗn hợp Với sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng hy sắc ký cột cổ điển, cần lực mao dẫn hay áp suất thủy tĩnh đủ tạo nên dòng dung môi cho phân tích, sắc ký lỏng áp suất trung bình đặc biệt sắc ký lỏng cao áp cần có áp lực cao định có tốc độ dòng tối ưu Để phát chất tách hệ thống sắc ký người ta quan sát vết tách ánh sáng thường, ánh sáng tử ngoại hay sủ dụng thuốc thử màu (như sắc ký lớp mỏng, sắc ký giấy) hay phát chất đặc tính vật lý chúng (chỉ số khúc xạ, độ dẫn điện, dẫn nhiệt, phổ UV – Vis, IR, MS, NMR ) thiết bị phát (detector) phương pháp sắc ký cột, sắc ký khí, sắc khí lỏng cao áp Độ nhạy phương pháp phát (các detector) cải tiến để phát chất có hàm lượng ngày thấp (ng, pg, fg) Với thiết bị đại, khả tách độ nhạy phương pháp sắc ký ngày cao, lượng mẫu cần để phân tích ngày nhỏ kích thước tiểu phân pha tĩnh kích thước cột ngày nhỏ áp suất dòng pha động ngày cao Có nhiều cách phân loại gọi tên phương pháp sắc ký Ví dụ: - Theo chế trình phân tách, ta có: sắc ký hấp phụ, sắc ký phân bố, sắc ký trao đổi ion, sắc ký loại cỡ (rây phân tử, lọc gel hay thấm gel), sắc ký lực điện di - Theo pha động, người ta phân thành: sắc ký lỏng (liquid chromatography, LC), sắc ký khí (gas chromatography, GC), sắc ký lỏng tới hạn (super – critical fluid chromatograyphy, SFC) - Theo hình dạng pha tĩnh người ta xếp phương pháp sắc ký vào nhóm sắc ký mặt phẳng (palar chromatography, PC) có kỹ thuật sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng sắc ký cột (columm chromatography, CC) có kỹ thuật sắc ký cột cổ điển, sắc ký lỏng cao áp, sắc ký khí - Theo áp lực đẩy dòng dung môi qua pha tĩnh, ta có: Sắc ký lỏng áp suất thấp (low pressure liquid chromatography, LPLC) bao gồm sắc ký cột cổ điển hay cải tiến, sắc ký lỏng áp suất trung bình (medium pressure liquid chromatography, MPLC) sắc ký lỏng áp suất cao (high pressure liquid chromatography, HPLC, sắc ký lỏng cao áp) - Theo phương pháp khai triển sắc ký, người ta phân phương pháp phân tích tuyến, phương pháp chỗ phân tích rửa giải - Trên thực tế, người ta thương gọi tên phương pháp sắc ký theo thói quen không gọi theo cách thống Trong nghiên cứu dược liệu, sắc ký thường sử dụng cho công việc sau: Định tính Một ứng dụng quan trọng phương pháp sắc ký dược liệu họ định tính thành phần chất dược liệu, dịch chiết dược liệu hay phát tạp chất, chất giả mạo pha trộn dược liệu hay thành phẩm từ dược liệu Khi sử dụng phổ kế làm detector, chúng cung cấp phương tiện hiệu cho định tính chất hỗn hợp Có thể sử dụng phương pháp sắc ký để phát thành phần hỗn hợp với số lượng, Rf hay Rt, màu sắc hay đặc điểm phổ biến chất Khi sử dụng chất chuẩn sắc ký điều kiện, người ta xác nhận có mặt chất dược liệu mà không cần phải phân lập chất Điều giúp cho việc xác nhận dược liệu, tránh nhầm lẫn dược liệu có thành phần hóa học định, đặc trưng cho Ví dụ, hoa Hòe có rutin, Trúc đào có neriolin, Mã tiền có strychnin v.v Các phương pháp sắc ký sử dụng định tính điểm (dấu vân tay) dược liệu Với định tính điểm chỉ, thay cho chất chuẩn, người ta sử dụng dược liệu chuẩn tiến hành chiết xuất, sắc ký điều kiện với dược liệu cần kiểm nghiệm Sự khác biệt sắc ký đồ mẫu chuẩn mẫu thử cho phép đánh giá chất lượng dược liệu Các thành phần lạ mẫu thử mẫu chuẩn dấu hiệu cho thấy dược liệu không đúng, bị pha tạp hay chất lượng Về nguyên tắc, hai mẫu dược liệu loài phải có sắc ký đồ đồng Từ đó, xác nhận mẫu kiểm nghiệm có hay không, có bị giả mạo hay pha tạp hay không Trên thực tế, thành phần chất mẫu có sai biệt định điều kiện di truyền (các chủng, dạng, thứ hay loài phụ, loài lai, loài trồng trọt ) hay điều kiện phát triển (thổ nhưỡng, khí hậu), điều kiện thu hái (tuổi, mùa thu hái) v.v Tùy thuộc vào loài, yêu cầu sử dụng mà chấp nhận khác biệt thành phần đến mức độ Nếu khác biệt lớn, đặc biệt thành phần chính, thường biến thể loài hay mọc vùng có điều kiện cách biệt phải coi dược liệu riêng biệt Định tính điểm sử dụng nhiều thực tế để kiểm nghiệm dược liệu thuốc có nguồn gốc tự nhiên để phát giả mạo hay bị pha trộn dược liệu khác Nhiều chuyên luận Dược điển Việt Nam IV có quy định sử dụng định tính điểm Định lượng Các phương pháp sắc ký phương pháp xác định hàm lượng chất thông dụng phân tích đại Khác với phép định lượng hóa học, phương pháp sắc ký cho phép định lượng riêng chất cụ thể hỗn hợp, với điều kiện phải có chất chuẩn tương ứng Người ta định lượng chất hay định lượng đồng thời nhiều chất lần định lượng chọn điều kiện thích hợp Sắc ký lỏng cao áp, sắc ký khí, điện di mao quản phương pháp thông dụng khả phân tách cao, độ nhạy độ lặp cao Sắc ký lớp mỏng kết hợp với mật độ quang kế coi phương pháp bán định lượng Theo dõi thành phần chất Các phương pháp sắc ký dùng nhu phương pháp theo dõi, đánh giá thay đổi thành phần (và hàm lượng) chất thuốc trồng trọt, dược liệu trình bảo quản hay dịch chiết trình chiết xuất phân tích chất Phân lập chất Một ứng dụng khác phương pháp sắc ký phân lập chất tinh khiết từ dược liệu Các chất tinh khiết phân lập được dùng xác định cấu trúc, chất chuẩn cho định tính, định lượng, nghiên cứu đặc tính dược lý hay độc tính sử dụng làm thuốc (khi chiết xuất, phân lập quy mô lớn) Các phương pháp sắc ký phân lập chất trình bày phần chiết xuất phân lập chất Dưới vài phương pháp sắc ký thông dụnh áp dụng cho phân tích chất từ dược liệu Sắc ký giấy Cơ chế phân tách sắc ký giấy chủ yếu phân bố, pha tĩnh (thường nước) thấm tờ giấy thấm đặc biệt gọi giấy sắc ký Nhờ xoang rỗng sợi cellulose tờ giấy sắc ký khác nhau, phân biệt theo độ thấm dung môi mức độ dày mỏng giấy, với mã hiệu tùy thuộc vào hãng sản xuất Khi tiến hành sắc ký cần chọn loại giấy thích hợp Có phương pháp triển khai sắc ký phẳng sắc ký lên sắc ký xuống tùy thuộc vào chiều pha động Tỷ lệ khoảng cách đường chất phân tích với đường pha động tính từ điểm đặt chất phân tích gọi R f Tỉ lệ đường chất phân tích với đường chất đối chiếu gọi R r, so với Rf, giá trị Rr ổn định nên dễ so sánh Các trị số Rf Rr nhiều hoạt chất quen thuộc dược liệu kèm theo hệ dung môi triển khai thường ghi sẵn tài liệu để tra cứu đối chiếu Kết sắc ký thu với vết chất phân tích phân bố giấy sắc ký gọi sắc đồ Các chất tách sắc đồ phát đánh giá màu sắc, kích thước, hình dạng vết sau quan sát ánh sáng thường ánh sáng đèn tử ngoại trước và/hoặc sau phun thuốc thử màu Để có kết luận chất đối chiếu chất phân tích với chất chuẩn thường phải tiến hành hệ dung môi khác biệt Trong nhiều trường hợp, để kết phân tách tốt hơn, người ta cần phải tiến hành sắc ký hai chiều Muốn vậy, tờ giấy vuông (60 x 60cm 40 x 40cm) người ta chấm dung dịch cần phân tích góc cáhc mép tờ giấy – 6cm Sau triển khai lần thứ với hệ dung môi chuyển tờ giấy sang buồng sắc ký thứ hai, quay tờ giấy góc 90o triển khai lần hai với dung môi thứ hai Sau màu, vết phân bố mặt phẳng đường thẳng Sắc ký giấy phương pháp sắc ký phân bố pha thuận, áp dụng tốt cho chất phân cực từ trung bình tới mạnh glycosid, hợp chất polyphenol, acid hữu phân tử nhỏ, acid amin, monosaccharid oligosaccharid…Ngoài việc phân tích thành phần hỗn hợp, sắc ký giấy dùng để diều chế lượng nhỏ chất cách chấm mẫu thử thành băng Sau triển khai, cắt băng chất tách phản hấp phụ dung môi thích hợp Lặp lại nhiều lần thu lượng chất tinh khiết cần thiết Do khả phân tách hạn chế, việc thực tốn nhiều thời gian nên phương pháp có tính ứng dụng hạn chế thay sắc ký lớp mỏng, sắc ký lớp mỏng pha đảo hay sắc ký lỏng cao áp Sắc ký lớp mỏng Trong sắc ký lớp mỏng, pha tĩnh trải mặt phẳng với đọ dày thích hợp tử 0,1 mm đến 0,2 mm dung môi dịch chuyển qua pha tĩnh chủ yếu lực mao dẫn Pha tĩnh thông dụng sắc ký lớp mỏng Silica gel với chế phân tách hấp phụ Tuy nhiên, chế phân tách sắc ký lớp mỏng sắc ký phân bố kết hợp hai, chế khác, tùy thuộc vào pha tĩnh dung môi sử dụng Các chất khác sử dụng làm pha tĩnh nhôm oxyd, Kieselguhr, cellulose, polyamid hay loại Silica gel pha đảo Để chuẩn bị sắc ký phân tích, người ta trải lớp mỏng có chiều dày 0,2 – 0,3 mm thật tay hay dụng cụ tráng sắc ký kính Với sắc ký chế hóa, bề dày lớp tráng tới mm Các chất dùng để tráng bột mịn Silica gel nhôm oxyd, Kieselguhr… Bột thêm chất dính (dùng để tráng khô) thêm chất dính (ví dụ, silicagel có trộn thêm CaSO 4) thêm nước để tạo thành hỗn dịch (tráng ướt) Sau tráng ướt, bảng mỏng để sấy hoạt hóa trước sử dụng Hiện nay, có nhiều hãng sản xuất sắc ký tráng sẵn kính, nhôm nhựa, ví dụ hãng Merck Đức, hãng Eastman, Kodak Mỹ Kích thước sắc ký thay đổi tùy mục đích sử dụng, không 20 x 20 cm Ngoài việc nâng cao chất lượng pha tĩnh, hãng sản xuất có cải tiến định tráng sẵn để cải thiện việc phân tách sắc ký vùng đậm đặc để cải thiện việc đưa mẫu lên mỏng Với sắc ký lớp mỏng, đặc biệt sắc ký hấp phụ, sử dụng nhiều hệ dung môi khác Có thể sử dụng dung môi với độ phân cực tăng dần (xem bảng) Muốn có dung môi với giá trị trung gian bảng trên, ta dùng hỗn hợp pha với hai dung môi theo tỉ lệ thích hợp Có nhiều phương thức triển khai sắc ký lớp mỏng khác (như lên, xuống, nằm ngang) kiểu bình sắc ký khác bình đứng thông thường (bình N), bình nằm ngang hay ‘bình’ hẹp đặc biệt (bình S) Tuy nhiên, thông dụng triển khai dung môi từ lên bình sắc ký tính đơn giản dễ sử dụng Cũng sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng hai chiều (trên có kích thước tối đa 20 x 20 cm) sử dụng Hằng số điện môi số dung môi sắc ký thông dụng Dung môi εo Dung môi εo Ether dầu 0,01 Dichlor ethan 0,49 Hexan 0,01 Aceton 0,56 Heptan 0,01 Dioxan 0,56 Cyclo hexan 0,04 Butanol 0,56 Carbon tetrachlorid 0,18 Ethyl acetat 0,58 Ether isopropylic 0,28 Acetonitril 0,65 Toluen 0,29 Pyridin 0,71 Benzen 0,32 Dimethylsulfo xid 0,75 Ether ethylic 0,38 Alcol isopropylic 0,82 Chloroform 0,40 Alcol ethylic 0,88 Methylen chlorid 0,42 Alcol methylic 0,95 So với sắc ký giấy, thời gian triển khai sắc ký lớp mỏng nhanh hơn, lượng mẫu phân tích cần hơn, khả phân tách tốt Ngoài ra, sử dụng thuốc thử mạnh acid sulfuric, nitric đậm đặc… để phát vết Vì thế, sắc ký lớp mỏng phương pháp sử dụng chủ yếu để phát hiện, theo dõi chất hỗn hợp yêu cầu phân tích không đòi hỏi phương pháp đại Một cải tiến sắc ký lớp mỏng người ta giảm kích thước hạt silica gel để tăng diện tích bề mặt riêng làm hiệu phân tách pha tĩnh Kích thước hạt Silica gel trung bình μm so với sắc ký lớp mỏng thông thường la 15 μm Khi quãng đường thời gian sắc ký rút ngắn ½ so với sắc ký lớp mỏng thông thường mà có kết tách tương tự hay chí tốt Các sắc ký gọi sắc ký lớp mỏng hiệu cao (High performance TLC, HPTLC) Kích thước HPTLC thường hay 10 cm Đối với sắc ký lớp mỏng, diện tích mật độ vết tách sắc đồ điều kiện xác định tỷ lệ với lượng chất có vết Vì thế, người ta định lượng chất hỗn hợp phép đo mật độ quang so sánh với giai mẫu chuẩn triển khai sắc ký Người ta cạo vùng pha tĩnh ứng với vết giải hấp hoạt chất chứa dung môi thích hợp, sau định lượng phương pháp thích hợp đo huỳnh quang, đo màu hay đo độ hấp thư tử ngoại Để tách hạt chất từ hỗn hợp, người ta dùng phương pháp sắc ký lớp mỏng điều chế (chế hóa) hay gọi sắc ký lớp dày Để đưa nhiều mẫu lên mỏng, bề dày lớp chất hấp phụ 0,5 – mm, tới mm Mẫu đưa lên mỏng dạng vệt dài (băng) Sau triển khai, định vị băng chất tách cách thích hợp cạo lấy băng chất cần lấy Phải hấp phụ dung môi để thu lấy chất tinh khiết Lặp lại vài sắc ký thu lượng mẫu cần thiết cho việc xác định cấu trúc Trong phân tích dược liệu, sắc ký lớp mỏng phương pháp sử dụng rộng rãi khả phân tách tốt, linh động, dễ thực kinh tế Sắc ký lớp mỏng sử dụng phân tích thành phần dược liệu, định tính chất dược liệu, cao chiết so sánh với chất chuẩn, định tính dược liệu điểm chỉ, theo dõi trình chiết xuất, thăm dò điều kiện phân tích cho sắc ký cột… Khả phân tích sắc ký lớp mỏng đa dạng, từ chất phân cực tới chất phân cực trung bình tới mạnh Rất nhiều nhóm hợp chất tự nhiên có giá trị trị liệu phân tích sắc ký lớp mỏng Tuy khả phân tách không cao không nhạy HPLC hay GC sắc ký lớp mỏng phương pháp phổ biến hữu ích phân tích dược liệu Dược điển nhiều nước (Anh, Châu Âu, Mỹ, Nhật Bản, Trung Quốc, Việt Nam…) sử dụng rộng rãi phương pháp sắc ký lớp mỏng kiểm nghiệm dược liệu chế phẩm từ dược liệu Có nhiều báo tài liệu xuất sắc ký lớp mỏng áp dụng kiểm nghiệm dược liệu, đặc biệt để định tính điểm dược liệu Trong đó, “Plant Drug Analysis – A Thin Layer Chromatography Atlas” Wagner H Bladt S (Bản tiếng Anh nhà xuất Springer Verlag ấn hành năm 1996) xem có giá trị Sắc ký lỏng cao áp Trong sắc ký lỏng cao áp (HPLC), để tăng hiệu tách cột sắc ký, người ta sử dụng chất nhồi cột với kích thước nhỏ, thường 10 μm với đường kính xoang xốp bên hạt từ 80 – 120 Å cho phân tích phân tử nhỏ 300 Å dùng cho phân tích đại phân tử Do kích thước hạt nhỏ, để dung môi chảy qua với tốc độ dòng tối ưu (khoảng 1ml/phút với cột có đường kính 4,6 mm nhồi pha tĩnh có kích thước 3,7 μm), người ta phải dùng bơm nén với áp suất cao (có thể tới 400 atm) để đẩy dòng dung môi qua cột Vì nên phương pháp gọi sắc ký lỏng cao áp Các loại cột HPLC phân tích thông dụng sử dụng hạt nhồi có kích thước 3,7 μm Gần đây, hạt nhồi có kích thước hạt 1,7 μm sử dụng Cột sắc ký loại có hiệu tách cao so với loại cột chứa hạt nhồi 3,7 μm phải dùng áp suất cao nhiều (tới 1000 atm) để bơm dung môi Các máy sắc ký sử dụng áp suất cao gọi sắc ký lỏng siêu cao áp (ultra high pressure liquid chromatography, UHPLC, hay gọi sắc ký lỏng siêu hiệu năng, Ultra (high) performance liquid chromatography, U(H)PLC)1 Khi áp lực bơm tăng lên cao ảnh hưởng tới cấu trúc pha tĩnh vấn đề thiết bị Người ta cải tiến hình dạng bề mặt pha tĩnh để giảm bớt áp suất bơm dung môi Một số cột có pha tĩnh có thị trường cột đơn khối (monolithic) hay hạt có cấu trúc xốp bề mặt đặc tâm… tăng cường thêm lực chịu nén hạt pha tĩnh Các loại cột dùng cho sắc ký điều chế chất sử dụng hạt nhồi có kích thước hạt tương tự cột phân tích, thường nhồi với hạt có kích thước lớn (5 μm) để làm giảm áp suất bơm dung môi Kích thước cột sắc ký phân tích thay đổi theo hiệu tách nhu cầu phân tích Đường kính cột phân tích thay đổi từ 0,05 – mm, thông dụng 4,6 mm; 3,0 mm hay 2,1 mm Các cột dùng với mục đích điều chế có đường kính lớn từ mm với cột bán điều chế tới 100 mm hay Chiều dài cột thay đổi từ 30 -300 mm Pha tĩnh sử dụng HPLC phong phú đa dạng Các chế tách phân bố, hấp phụ, rây phân tử, trao đổi ion… sử dụng Tuy nhiên, pha tĩnh thông dụng pha tĩnh phân bố (pha đảo hay pha thuận) Các hạt nhồi loại pha tĩnh thường có nhân (giá mang) Silica gel với nhóm OH silanol bề mặt liên kết với chất khác đóng vai trò pha tĩnh thực Loại hạt nhồi thường gọi pha liên kết (bonded phase) Thông dụng loại pha tĩnh RP – 18, RP – với pha tĩnh tương ứng mạch hydrocarbon có 18 hay carbon Các pha tĩnh khác sử dụng Dung môi (pha động) dùng HPLC (pha đảo) thông dụng hỗn hợp nước – methanol nước – acetonitril với tỉ lệ khác Để tăng khả phân giải chất có khả phân ly, dung dịch đệm với pH khác hay acid (acid trifluoroacetic, acetic, formic) hay chất kềm hữu thêm vào pha động Với pha tĩnh sắc ký khác, đặc biệt sắc ký hấp phụ, sử dụng nhiều hệ dung môi khác Detector Có nhiều loại detector sử dụng việc phát chất tách khỏi cột sắc ký lỏng cao áp Các detector phát thay đổi đặc tính dung dịch rửa giải detector số khúc xạ (reflective index, RI), detector điện hóa (electrochemical detector), detector tán xạ bay (evaporating light scattering detector, ELSD), detector UV-Vis đơn bước song (UV detector) hay detector huỳnh quang (fluorescence detector) cho biết có chất khỏi cột vào thời điểm định Các detector quang phổ detector dãy diod quang (photodiode array, PDA), khối phổ (MS) hay cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) việc cho biết chất khỏi cột thời gian sắc ký đồ truyền thống cho biết thêm thông tin quan trọng khác chất tách ra, phổ chất Các thông tin có ích tăng độ tin cậy việc nhận định chất, so sánh với chất chuẩn Phần lớn detector sử dụng HPLC không phá hủy chất (ngoại trừ MS) Các hệ thống sắc ký đại ghép nối tiếp hay song song nhiều detector với để có thêm thông tin xác định chất Ứng dụng phân tích dược liệu Sắc ký lỏng cao áp có nhiều ứng dụng nghiên cứu hợp chất tự nhiên nói chung nghiên cứu dược liệu nói riêng Ưu điểm lớn sắc ký lỏng cao áp phân tích nhiều loại hợp chất khác Tuy hiệu tách sắc ký lỏng cao áp không cao sắc ký khí khả phân tích rộng nhiều Có thể dùng sắc ký lỏng cao áp để phân tích chất từ chất phân cực tới không phân cực, từ chất bay tới chất không bay hơi, từ chất trung tính tới chất điện ly Tính linh hoạt sắc ký lỏng cao áp cao phương pháp khác nhờ chế tách, pha tĩnh pha động đa dạng, phong phú Với hiệu tách cao, khả phân tích rộng vậy, sắc ký lỏng cao áp lựa chọn ưu tiên phân tích hay điều chế chất Sắc ký lỏng cao áp thường sử dụng định lượng riêng lẻ chất hỗn hợp phức tạp dịch chiết dược liệu so sánh diện tích đỉnh với chất chuẩn điều kiện phân tích Với pha tĩnh ngày hoàn thiện đổi để nâng cao hiệu tách, detector ngày nhạy, sắc ký cao ngày dễ dàng phân tích chất hỗn hợp mức ppm tới ppb, chí ppt Sắc ký lỏng cao áp quan tâm phân tích điểm chất hỗn hợp Với sắc ký điểm chỉ, người ta xác định nguốn gốc xuất xứ dược liệu, phân biệt dược liệu với loài tương cận, xác định nguyên liệu khác pha trộn vào dược liệu, xác định sản phẩm dược liệu nhái, giả mạo nhãn hiệu… So với sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng cao áp có hiệu tách cao nên cho kết điểm chi tiết nhiều giá trị Khi kết hợp với thiết bị quang phổ đại, sắc ký lỏng cao áp cung cấp nhiều thông tin giá trị việc xác định chất Nhiều nhà nghiên cứu sử dụng thiết bị ghép nối LC-MS-NMR-CD để phân tích thành phần dịch chiết xác định cấu trúc chất hỗn hợp mà không cần tách riêng chất Một ứng dụng khác sắc ký lỏng cao áp phân lập chất tinh khiết (HPLC điều chế) Về nguyên tắc, sắc ký lỏng cao áp điều chế chia sẻ nguyên lý HPLC phân tích Điểm khác biệt hệ thống sử dụng cột sắc ký lớn hơn, với lượng pha tĩnh nhiều để phân tích nhiều mẫu chất tách khỏi cột thu lại để có chất tinh khiết Theo truyền thống, cột có đường kính lớn 4,7mm xem cột bán điều chế Các cột chế điều chế quy mô phòng thí nghiệm có kích thước thay đổi từ – 10 cm Trong quy mô công nghiệp, cột sắc ký lỏng cao áp điều chế có đường kính tới 100 cm So với sắc ký cột cổ điển, sắc ký lỏng cao áp có chi phí cao nên thường sử dụng trường hợp không tác phương pháp sắc ký cột thông thường hay MPLC Sắc ký khí Sắc ký khí phương pháp sắc ký mà pha động lỏng thay dòng khí liên tục chạy qua pha tĩnh Các chất tách khỏi hỗn hợp tương tác khác chúng với pha tĩnh Do khả hòa tan chất khí, dòng khí không đóng vai trò pha động thực hệ thống sắc ký Nó làm nhiệm vụ lôi chất pha chạy dọc theo pha tĩnh để chúng tương tác với pha tĩnh Vì thế, dòng khí chạy cột sắc ký khí gọi khí mang Đóng vai trò đẩy chất khỏi pha tĩnh sác ký khí nhiệt độ Các chất có nhiệt độ sôi khác bị lưu giữ hay bị lôi dòng khí mang khác Từ chất tách khỏi Do phải hóa để lôi dòng khí mang, chất bay phân tách Vì vậy, sắc ký khí áp dụng cho chất có khả bay nhiệt độ tiến hành sắc ký Cấu tạo hệ thống sắc ký khí đại bao gồm thành phần sau: (a) Khí mang hệ thống điều chỉnh khí, (b) cổng bơm mẫu thiết bị bơm mẫu, (c) cột sắc ký, (d) buồng cột, (e) detector (f) máy tính dùng để điều khiển thiết bị, ghi nhận lưu trữ kết 4.1 Khí mang hệ thống điều chỉnh khí Các khí mang thông dụng nitơ heli Nitơ rẻ tiền sẵn có so với heli Heli cho hiệu tách thường cao Khí mang phải khí lạ khác ảnh hưởng tới phân tích tương tác với chất phân tích, với pha tĩnh hay tạo nên peak lạ sắc ký đồ Độ tinh khiết khí thông thường phải cao 99,95% Các chất không phép có khí mang oxy, khí carbonic, nước halogen Chúng phải lọc trước đưa vào hệ thống sắc ký hệ thống lọc Để có tốc độ dòng tối ưu, hệ thống đo điều chỉnh áp suất, lưu lượng khí sử dụng Hệ thống cho phép điều chỉnh lưu lượng/áp suất dòng khí vào cột cách xác theo yêu cầu phân tích 4.2 Cổng bơm mẫu thiết bị bơm mẫu Là nơi mẫu dạng lỏng bơm vào hệ thống Cổng bơm mẫu gia nhiệt tất thành phần mẫu lỏng hóa vào hệ thống Với sác ký khí mao quản, lượng mẫu thường không vượt 10 l Với sắc ký khí cột nhồi, lượng mẫu bơm lớn Toàn lượng mẫu bơm vào sau hóa vào cột sắc ký (bơm mẫu không chia dòng) hay lượng định vào cột phân tích, phần lại đẩy (bơm mẫu chia dòng) Có thể bơm mẫu vào cổng bơm mẫu tay với xylanh Người ta tự động hóa phận bơm mẫu tự động Trong kỹ thuật head space, mẫu hóa chai đựng mẫu kín bơm vào hệ thống sắc ký dạng khí 4.3 Cột sắc ký Dạng cổ điển cột sắc kýkhí cột nhồi với cột thủy tinh hay thép không rỉ hở hai đầu có đường kính - mm, dài - m, bên nhồi đầy pha tĩnh Tuy nhiên, ngày phần lớn (trên 90%) cột sắc ký khí mao quản Cột mao quản thường làm silica nung chảy có đường kính từ 0,1 - 0,53 mm với chiều dài 10 - 100 m hay Các cột thông thường có đường kính 0,2 mm, 0,25 mm hay 0,32 mm vời chiều dài 25 - 60 m Thành cột mao tráng lên lớp pha tĩnh lỏng với bề dày 0,2 - m (wall coated open tubular, WCOT) hay phủ lớp hạt có lớp pha tĩnh lỏng bao quanh (support coated open tubular, SCOT) lớp pha tĩnh xốp chát hấp phụ hay rây phân tử (porous layer open tubular, PLOT) loại cột mao quản thông dụng WCOT So với cột nhồi, cột mao quản có hiệu tách cao nhiều Một cột mao quản 60 m có 180.000 - 300.000 đĩa lý thuyết so với 4000 đĩa lý thuyết cột nhồi )2m) Loại cột nhồi có đường kính nhỏ (microbore; 0,75 mm) xem dạng trung gian cột nhồi mao quản Pha tĩnh sắc ký khí đa dạng Các pha tĩnh rắn với chế hấp phụ (silacagel, nhôm oxyd), rây phân tử hay gặp cột nhồi Tuy nhiên, pha tĩnh phổ biến pha tĩnh lỏng theo chế phân bố Pha tĩnh lỏng phủ lên giá mang cột nhồi hay tráng lên thành cột mao quản Lượng pha tĩnh cột lớn, khả tách lượng mẫu phân tích cột cao Trong cột nhồi, lượng pha tĩnh chiếm tới 25% khối lượng vật liệu nhồi cột Các chất lỏng sử dụng làm pha tĩnh đa dạng nguồn gốc độ phân cực Hai loại pha tĩnh thông dụng dẫn chất polysiloxan polyethylen glycon Các dẫn chất polysiloxan (methyl polysiloxan, hỗn hợp methyl polysiloxan, phenyl polysiloxan cyano polysiloxan) có độ phân cực từ tới trung bình Các polyethylen glycon pha tĩnh phân cực Tên gọi pha tĩnh khác theo hãng sản xuất OV, SE hay DB cho loại dẫn chất polysiloxan, Carbowax, CP-wax hay DB-wax cho polyethylen glycon với chữ số đứng sau để loại polysiloxan hay polyethylen glycon sử dụng Các pha tĩnh khác dầu apiezon, squalen, alcol có độ sôi cao ester chúng sử dụng Mỗi pha tĩnh đề có nhiệt độ giới hạn chúng, vượt nhiệt độ làm pha tĩnh mau hư hỏng Các dẫn chất polysiloxan, nhiều độ thường không 340 - 3600C, với polyethylen glycon, nhiệt độ thường không 250 0C 4.4 Buồng cột Nhiệt độ yếu tố có ý nghĩa quan trọng việc tách chất trình sắc ký khí Trong suốt tình phân tích, nhiệt độ cột phải đồng tòan cột Nhiệt độ cột phải ổn định, xác thay đổi theo yêu cầu phân tích Phân tích sắc ký khí thực điều kiện đẳng nhiệt (isothermal) hay nhiệt độ tăng dần theo chương trình nhiệt (gradient) Để đạt điều này, toàn cột sắc ký đặt khoang kín gọi buồng cột Buồng cột cách nhiệt có thiết bị gia nhiệt, theo dõi nhiệt độ phân phối nhiệt, giữ cho nhiệt độ cột phân tích đồng đều, ổn định tuân theo yêu cầu phân tích 4.5 Detector Có nhiều loại detector khác sử dụng sắc ký khí Detector phổ biến detector ion hóa lửa (flame ionization detector, FID), loại detector phổ thông, phát hầu hết chất phân tích, nhạy có khoảng tuyến tính động học rộng, thích hợp cho việc định lượng Loại có thiết kế đơn giản tương đối rẻ tiền Detector MS với nhiều kỹ thuật đo khác ngày trở nên phổ biến tính hiệu dụng Nó phát nhiều chất detector chọn lọc sử dụng kỹ thuật phát chọn lọc ion Phổ khối có độ nhạy cao khoảng tuyến tính động học lớn thích hợp cho việc định lượng Detector MS cung cấp thông tin hữu ích khối lượng phân tử phân mảnh để xác định cấu trúc chất Ngoài ra, có detector phổ thông hay đặc hiệu khác thích hợp cho nhóm hợp chất Tuy nhiên, detector phổ biến Để xác định chất đó, ngòai thời gian lưu (tr), người ta sử dụng số lưu Kovats (hay gọi số Kovats hay số lưu) So với tr, số lưu Kovats ổn định bù trừ sai lệch thiết bị điều kiện phân tích Để xác định số lưu Kovats chất, người ta tiến hành sắc ký chất với chất chuẩn hydrocarbon chọn cho chất rửa giải trước chất lại rửa giải sau chất xác định Chỉ số Kovats tính dựa mối liên hệ (logarit) thể tích lưu (thời gian lưu) hiệu chỉnh chất với chất chuẩn Sắc ký khí phương pháp có hiệu tách cao, cao nhiều so với HPLC phân tích hỗn hợp phức tạp mà HPLC không phân tích Tuy nhiên, nhược điểm sắc ký khí phương pháp sử dụng cho phân tích chất bay Các chất không bay nhiệt độ phân tích (thường không 300 0C) muốn phân tích cần phải biến đổi thành dẫn chất bay cách ethyl hóa (methyl hóa, tolyl hóa, silyl hóa) Điều làm hạn chế khả ứng dụng sắc ký khí Mặc dù sử dụng sắc ký điều chế thực tế, sắc ký khí gần dùng phân tích định tính định lượng Trong phân tích dược liệu, sắc ký khí thích hợp cho phân tích tinh dầu chất bay Đặc biệt, kết hợp với phổ khối kế thư viện phổ, hệ thống GC-MS phân tích cho biết thành phần tinh dầu chất bay nhanh hiệu Các kết phân tích khối phổ hệ thống so sánh với sở dự liệu khối phổ ESI-MS (được gọi thư viện phổ) để xác định chất phân tích Có nhiều thư viện phổ khác lớn thường sử dụng thư viện phồ NIST Hiện phiên NIST-08 Viện Tiêu chuẩn Công nghệ Quốc gia, Mỹ (National Institute of Standards & Technology) Thư viện có 220.460 phổ khối EI-MS 192.108 hợp chất thuộc nhóm: (a) Thuốc, chất chuyển hóa chất độc, (b) Thuốc trừ sâu trừ nấm, (c) chất hữu đất, nước không khí, (d) aminoacid, di- tripeptid, (e) tạp chất thông thường (f) dẫn chất phân tích nhóm Thư viện có 14.802 phồ MS/MS 5.308 ion (3.898 cation 1.410 anion) 224.308 số lưu Kovats 21.847 chất cột không phân cực phân cực Một ứng dụng khác quan tâm phân tích dư lượng chất bảo vệ thực vật lại dược liệu, dioxin chất độc hại thực phẩn, lượng dung môi tồn dư thuốc, chất ô nhiễm môi trường, độc hại cho sức khỏe người (các hợp chất thơm đa vòng ) Các chất thường tồn vời lượng nhỏ hỗn hợp phức tạp, khó để phát hiện, định danh định lượng chúng phương pháp sắc ký khác Điện di mao quản Điện di phương pháp phân tích dựa khác độ linh động điện (linh độ điện di,electrophoretic mobility, ) hai hay nhiều chất hay tiểu phân tĩnh điện điện trường Khi dung dịch chất đặt điện trường, chất phân ly thành ion hay có khả tạo tiểu phân tĩnh điện dịch chuyển phía điện cực trái dấu với Tốc độ dịch chuyển ion hệ thống phụ thuộc vào độ lớn điện trường, chất chất phân tích số yếu tố khác môi trường phân tích Trong hệ, tốc độ dịch chuyển chất phụ thuộc vào độ linh động điện di chất Các chất có điện tích và/hoặc hình dạng kích thước phân tử khác dịch chuyển với tốc độ khác điện trường tách khỏi hệ điện di Có phương thức điện di điện di mặt phẳng điện di mao quản Điện di mặt phẳng phương pháp điện di áp dụng sớm Bản điện di mặt phẳng trắng lớp gel (tinh bột, agar, agarose hay polacrilamid), lớp giấy lọc hay mỏng trải silicagel, cellulose, cellulose acetat, nitrocellulose Tất tẩm dung dịch đệm Lớp gel, giấy hay silicagel làm nhiệm vụ giá mang để giữ dung dịch đệm môi trường ion dịch chuyển Mẫu thử đưa lên lớp gel Hai cực điện trường mạnh tạo dòng điện chiều áp đầu đối diện lớp gel làm chất dịch chuyển cực trái dấu tạo nên băng điện di Các băng phát màu sắc ánh sáng thường, ánh sáng tử ngoại hay dùng thuốc thử tạo màu hay tạo thành chất phát huỳnh quang Do hiệu ứng sinh nhiệt Joule, điện áp dụng điện di mặt phẳng thường khoảng 15 - 40 V/cm để tránh tăng nhiệt mức làm khô dung dịch đệm điện di Có nhiều kỹ thuật khác sử dụng điện di mặt phẳng Sơ đồ thiết bị điện di mao quản Trong điện di mao quản (Electrophoresis, CE), chất phân tách mao quản silica nung chảy chứa đầy dung dịch điện giải Đường kính mao quản thường từ 20 - 100 m, chiều dài mao quản thay đổi thường 20 - 30 cm kể từ đầu vào đến detector Chiều dài tối đa mao quản 100 cm Hai đầu ống mao quản nhúng vào cốc đựng dung dịch điện giải Ở gần đầu mao quản gắn với detector Hai đầu mao quản nối với hai cực nguồn điện chiều (có thể thay đổi điện được) có điện thường vào khoảng - 30 KV (có thể tới 800 V/cm) Điện lớn chất dịch chuyển nhanh không kịp tách khỏi Thay đổi điện đạt việc phân tách tốt thời gian ngắn Trong CE, tất ion dịch chuyển phía cực âm (cathod) lực điện di làm ion dương âm dịch chuyển ngược chiều Hiện tượng dòng điện thẩm (electroosmotic flow, EOF) sinh dung dịch đệm lòng mao quản silica nung chảy Dòng điện thẩm dịch chuyển cathod với tốc độ tới mm/s phụ thuộc vào pH, độ nhớt môi trường thường lớn tốc độ dịch chuyển ion theo linh độ điện di Như vậy, ion dương dịch chuyển nhanh tốc độ điện di vốn có nó, chất trung tính dịch chuyển vào tốc độ dòng điện thẩm ion âm dịch chuyển chậm ngược chiều với chiều điện di Các chất khác tách khỏi dịch chuyển qua detector để phát ghi thành điện di đồ Các detector sử dụng điện di phong phú có độ nhạy cao Detector thông dụng detector tử ngoại Detector gắn trực tiếp mao quản, dùng mao quản tế bào đo hay dùng tế bào đo riêng biệt Nhược điểm phương pháp đo trực tiếp mao quản độ nhạy thấp quãng đường ngắn Các detector huỳnh quang, laser, điện hóa hay dẫn điện sử dụng Việc kết nối máy điện di mao quản với khối phổ kế có khó khăn định mặt giao diện Tuy nhiên thiết bị CE-MS có mặt thị trường, tăng khả ứng dụng điện di mao quản Kỹ thuật ion hóa CE-MS chủ yếu kỹ thuật phun điện (electro spray ionization, ESI) Trong điện di mao quản, kỹ thuật điện di sau sử dụng:  Điện di vùng (zone electrophoresis) kỹ thuật đợn giản áp dụng rộng rãi điện di mặt phẳng vào mao quản Trên mao quản, kỹ thuật gọi điện di mao quản vùng (capillary zone electrophoresis, CZE) Việc thêm vào dung dịch đệm số chất cho kỹ thuật điện di MECK, CIEF, CSE  Sắc ký điện động micell (micellar electrokinetic chromatography, MEKC) phương pháp điện di mẫu thử tách phân bố khác chúng micell (được xem pha tĩnh giả) dung dịch đệm (pha động) Trong MEKC, chất hoạt động bề mặt thêm vào dung dịch đệm nồng độ lớn nồng độ micell tới hạn Trong phần lớn trường hợp, MEKC tiên hành môi trường kiềm Natri dodecyl sulfat (SDS) chất hoạt động bề mặt thường sử dụng  Sắc ký điện động vi nhũ tương (microemulsion electrokinetic chromatography, MEEKC) xem kỹ thuật mở rộng MEKC MEEKC sử dụng vi nhũ tương (thường dầu/nước) làm pha tĩnh giả MEEKC linh động hiệu MEKC, dùng cho chất phân ly trung tính hay phân tích quang hoạt MEEKC dùng nhiều phân tích dược phẩm  Sắc ký điện di mao quản (capillary electrochromatography, CEC): kỹ thuật phát triển gần sử dụng dòng điện thẩm để đưa dung môi rửa giải qua pha tĩnh cột nhồi HPLC có dung môi CEC sử dụng thiết bị điện di thông thường có thêm ưu điểm việc ghép nối với detector khối phổ dễ dàng so với điện di mao quản thông thường Các chất trung tính phân tách với hiệu cao kỹ thuật  Điện di rây mao quản (capillary sieving electrophoresis, CSE): Trong điện di rây mao quản, dung dịch đệm thêm vào chất có tác dụng cản trở vật lý di chuyển phân tử polyethylen oxyd hay dextran Các phân tử lớn protein di chuyển chậm ma sát hay cản trở chất Mức độ bị cản trở phụ thuộc vào khối lượng hay bán kính thủy động phân tử Nếu thêm vào môi trường điện di chất có cấu trúc mạng chiều tương tự sắc ký lọc gel ta cóĐiện di gel mao quản (capillary gel electrophoresis, CGE) Tuy nhiên, điện di mao quản, CSE cho kết lặp lại tin cậy hơn, dễ thay sau điện di nên sử dụng rộng rãi phân tích protein  Ngoài kỹ thuật trên, số kỹ thuật điện di mao quản khác sử dụng Ví dụ như: Điện di hội tụ đẳng điện (isoelectric focusing, IEF), Điện di đẳng tốc (isotachophoresis, ITP) Điện di mao quản có hiệu lực phân tách cao Một yếu tố quan trọng chất di chuyển đồng mao quản tạo nên băng dịch chuyển vùng dịch chuyển dạng parabol sắc ký lỏng cao áp Điều hạn chế dãn rộng băng phân tách, tạo nên đỉnh hẹp điện di đồ làm choh dung lượng peak điện di cao hơn, đồng nghĩa với độ phân giải cao Khi chọn điều kiện điện di thích hợp, độ phân giải phương pháp đạt cao Số đĩa lý thuyết hệ điện di mao quản đạt tới hàng trăm ngàn (thường 100.000 - 250.000 đĩa lý thuyết), chí hàng triệu (có thể tới 30.000.000 đĩa lý thuyết CGE oligonucleotid) Do đỉnh chất tách hẹp nên chúng có cường độ lớn hơn, góp phần làm tăng độ nhạy phương pháp Phương pháp điện di nguyên thủy (điện di vùng) vốn áp dụng cho chất ion hóa Vì thế, hỗn hợp phức tạp gồm chất điện ly trung tính, có chất điện ly di chuyển làm cho điện di đồ trở nên đơn giản hơn, thích hợp với việc định lương Thiết bị điện di mao quản tương đối đơn giản, việc sử dụng tốn vật tư tiêu hao phương pháp sắc ký khác Điện di mao quản có nhược điểm so với phương pháp sắc ký khác Điện di mao quản chủ yếu dùng cho chất điện ly Mặc dù kỹ thuật điện di phân tách phân tử không ion hóa việc phát triển phương pháp áp dụng chúng phân tích hợp chất tự nhiên tương đối hạn chế So với sắc ký lỏng, việc chọn điều kiện phân tích (dung dịch đệm, điện thế) hạn chế linh động so với lựa chọn dung môi pha tĩnh sắc ký Kỹ thuật điện di áp dụng vào phân tích hợp chất tự nhiên (alkaloid, acid amin ) từ sớm (giữa năm 1950) với điện di mặt phẳng Tuy nhiên, không thuận tiện sắc ký lớp mỏng HPLC phát triển sau (1970) nên sử dụng Kỹ thuật chủ yếu sử dụng phân tích đại phân tử (protein, polysaccarid, vật liệu di truyền ) sinh hóa, lâm sàng lĩnh vực liên quan Từ thiết bị điện di mao quản thương mại hóa vào năm 1987, với ưu diểm phân tích phân tử nhỏ, điện di mao quản thu hút quan tâm nhà phân tích hóa hợp chất tự nhiên Trong hợp chất tự nhiên, hợp chất phenol, alcaloid, acid, acid amin thích hợp với phân tích điện di mao quản định tính định lượng Các kỹ thuật điện di thường sử dụng phân tích dược liệu CZE, MEKC CEC [...]... của sắc ký khí là phương pháp này chỉ có thể sử dụng cho phân tích các chất bay hơi Các chất không bay hơi ở nhiệt độ phân tích (thường không quá 300 0C) muốn phân tích được cần phải biến đổi thành dẫn chất bay hơi bằng cách ethyl hóa (methyl hóa, tolyl hóa, silyl hóa) Điều này làm hạn chế khả năng ứng dụng của sắc ký khí Mặc dù vẫn có thể sử dụng trong sắc ký điều chế nhưng trên thực tế, sắc ký khí... mẫu được hóa hơi trong một chai đựng mẫu kín rồi được bơm vào hệ thống sắc ký dưới dạng khí 4.3 Cột sắc ký Dạng cổ điển nhất của cột sắc kýkhí là cột nhồi với một cột thủy tinh hay thép không rỉ hở hai đầu có đường kính trong 2 - 4 mm, dài 1 - 4 m, bên trong nhồi đầy pha tĩnh Tuy nhiên, ngày nay phần lớn (trên 90%) các cột sắc ký khí là mao quản Cột mao quản thường được làm bằng silica nung chảy có... lại trên dược liệu, dioxin và các chất độc hại trong thực phẩn, lượng dung môi tồn dư của thuốc, các chất ô nhiễm môi trường, độc hại cho sức khỏe con người (các hợp chất thơm đa vòng ) Các chất này thường tồn tại vời một lượng rất nhỏ trong hỗn hợp phức tạp, rất khó để phát hiện, định danh cũng như định lượng chúng bằng các phương pháp sắc ký khác 5 Điện di mao quản Điện di là một phương pháp phân... của phương pháp Phương pháp điện di nguyên thủy (điện di vùng) vốn chỉ áp dụng cho các chất ion hóa Vì thế, trong một hỗn hợp phức tạp gồm cả các chất điện ly và trung tính, chỉ có các chất điện ly di chuyển làm cho điện di đồ trở nên đơn giản hơn, thích hợp hơn với việc định lương Thiết bị điện di mao quản tương đối đơn giản, việc sử dụng cũng ít tốn kém về vật tư tiêu hao hơn các phương pháp sắc ký. .. khác Điện di mao quản cũng có những nhược điểm so với các phương pháp sắc ký khác Điện di mao quản chủ yếu được dùng cho các chất có thể điện ly Mặc dù các kỹ thuật điện di có thể phân tách được các phân tử không ion hóa nhưng việc phát triển phương pháp và áp dụng chúng trong phân tích các hợp chất tự nhiên còn tương đối hạn chế So với sắc ký lỏng, việc chọn các điều kiện phân tích (dung dịch đệm,... tách các chất của quá trình sắc ký khí Trong suốt quá tình phân tích, nhiệt độ của cột phải đồng đều trên tòan bộ cột Nhiệt độ cột phải ổn định, chính xác và thay đổi được theo yêu cầu phân tích Phân tích sắc ký khí có thể được thực hiện trong điều kiện đẳng nhiệt (isothermal) hay nhiệt độ tăng dần theo chương trình nhiệt (gradient) Để đạt được điều này, toàn bộ cột sắc ký được đặt trong một khoang... định chỉ số lưu Kovats của một chất, người ta tiến hành sắc ký chất đó với 2 chất chuẩn là hydrocarbon được chọn sao cho một chất được rửa giải trước và chất còn lại được rửa giải ra sau là chất xác định Chỉ số Kovats được tính dựa trên mối liên hệ (logarit) của thể tích lưu (thời gian lưu) hiệu chỉnh của chất đó với 2 chất chuẩn Sắc ký khí là phương pháp có hiệu năng tách rất cao, cao hơn nhiều so với... định tính và định lượng Trong phân tích dược liệu, sắc ký khí rất thích hợp cho phân tích tinh dầu và các chất bay hơi Đặc biệt, khi kết hợp với phổ khối kế và thư viện phổ, hệ thống GC-MS có thể phân tích và cho biết thành phần của tinh dầu và các chất bay hơi rất nhanh và hiệu quả Các kết quả phân tích khối phổ trên hệ thống sẽ được so sánh với một cơ sở dự liệu về khối phổ ESI-MS (được gọi là thư... thường sử dụng nhất  Sắc ký điện động vi nhũ tương (microemulsion electrokinetic chromatography, MEEKC) có thể xem như một kỹ thuật mở rộng của MEKC MEEKC sử dụng các vi nhũ tương (thường là dầu/nước) làm pha tĩnh giả MEEKC linh động và hiệu quả hơn MEKC, có thể dùng cho cả chất phân ly và trung tính hay trong phân tích quang hoạt MEEKC được dùng nhiều trong phân tích dược phẩm  Sắc ký điện di mao quản... dung môi và pha tĩnh sắc ký Kỹ thuật điện di đã được áp dụng vào phân tích các hợp chất tự nhiên (alkaloid, acid amin ) từ khá sớm (giữa những năm 1950) với điện di trên mặt phẳng Tuy nhiên, do không thuận tiện bằng sắc ký lớp mỏng và HPLC phát triển sau đó (1970) nên ít được sử dụng Kỹ thuật này hiện nay chủ yếu được sử dụng trong phân tích các đại phân tử (protein, polysaccarid, vật liệu di truyền )