các phương pháp tạo biến dị di truyên

Phương pháp lai hữu tính • Khái niệm: “Lai giống là sự giao phối thụ phấn, thụ tinh giữa hai hay nhiều dạng bố mẹ có nền di truyền khác nhau để tạo ra biến dị tái tổ hợp theo mục tiêu

Chương 5 Phương pháp tạo biến dị di

truyền trong chọn giống cây trồng

1 Phương pháp lai hữu tính

• Khái niệm:

“Lai giống là sự giao phối (thụ phấn, thụ tinh) giữa hai hay nhiều dạng bố mẹ có nền di truyền khác nhau để tạo ra biến dị tái tổ hợp theo mục tiêu chọn giống ”

• Sự giao phối có thể xảy ra trong tự nhiên (lai tự

nhiên) hoặc do con người tiến hành (lai nhân

tạo) đều tạo ra biến dị tái tổ hợp và có giá trị

trong chọn giống cây trồng

• Khi bố mẹ khác nhau 2 cặp gen alen ở thế hệ F2

sẽ thu được 2 kiểu gen mới,

• nếu bố mẹ khác nhau 3 cặp gen alen ở thế hệ

F2 thu được 6 kiểu gen mới

• Tổng quát khi lai hai bố mẹ khác nhau n gen

alen, sẽ có 2n giao tử và số kiểu gen là 3n

• Quần thể nhỏ nhất ở F2cần thiết để biểu hiện

các biến dị là 4n cá thể

Ví dụ: Lai 2 bố mẹ khác nhau 3 cặp gen alen tạo

ra các kiểu gen mới như sau:

P 1 AAbbCC x aaBBcc P 2

F 1 AaBbCc

F 2 AABBCC Kiểu gen mới

AABBcc Kiểu gen mới AAbbCC Kiểu gen bố mẹ

AAbbcc Kiểu gen mới aaBBCC Kiểu gen mới aaBBcc Kiểu gen bố mẹ

aabbCC Kiểu gen mới aabbcc Kiểu gen mới

• Phương pháp lai hữu tính tạo giống thường

được ứng dụng đối với cây trồng có cấu tạo hoa

hoàn chỉnh

• Đối với thực vật có cấu tạo hoa hoàn chỉnh gồm

đủ cả nhị và nhuỵ thì cần tiến hành khử đực

(emasculation) ở cây mẹ trước khi tiến hành lai

• Các loài cây trồng có sinh sản đặc thù như: bất

dục đực (male sterility), đơn tính cái

(Gynoecious), tự bất hợp (self - incompatibility)

do yếu tố di truyền gene nhân, tế bào chất hay

do yếu tố môi trường có thể lợi dụng hiện tượng

này để giảm bớt công khử đực, hạt thu được

trên cây mẹ là hạt lai

• Lai hữu tính tạo giống được phân chia thành

lai gần và lai xa:

– Lai gần là lai giữa hai bố mẹ trong cùng loài Ví dụ, lai

giữa các giống trong mỗi loài lúa trồng Oryza sativa

L (châu Á), O glaberrima (châu Phi)…

– Lai xa là sự giao phối giữa hai bố mẹ khác loài hay khác loài phụ Ví dụ: lai hai bố mẹ thuộc hai loài phụ

lúa Indica x Japonica; lai giữa loài khoai tây trồng

(Solanum tuberosum L.) với loài khoai tây dại

(Solanum demissum) hay lai giữa chi (genus) lúa mỳ (Triticum) với mạch đen (Secale) tạo ra cây Triticale

5.1.2 Các phương pháp lai hữu tính

a) Lai đơn (single cross): là lai một lần giữa hai bố

mẹ, phương pháp này ra đời sớm nhất, được

sử dụng rộng rãi và rất hiệu quả đến ngày nay

vì nó đơn giản, ít tốn kém, không yêu cầu

trang thiết bị và cơ sở vật chất lớn

Công thức như sau:

A x B

Ký hiệu: A/B (theo IRRI và USDA)

hoặc A - B (theo CIMMYT)

b) Lai ba (three-way cross)

• Phương pháp sử dụng con lai F1 của của

một lai đơn lai với một bố mẹ khác Công thức lai (A x B) x C

• Ký hiệu A/B//C (theo IRRI và USDA) hoặc

A - B x C (theo CIMMYT)

c Lai kép (double cross):

• Phương pháp lai giữa hai con lai F1 của

hai lai đơn, công thức lai:

(A x B) (C x D)

• Ký hiệu A/B//C/D (theo USDA);

A/B//C///D (theo IRRI);

A – B x C - D (theo CIMMYT)

d Lai đỉnh (topcross): thường được sử

dụng để xác định khả năng kết hợp chung nhằm loại bỏ các dòng/giống không có khả năng tổ hợp trong tạo giống ưu thế lai

Các dòng/giống mang lai thử được lai với vài ba giống ổn định về khả năng kết hợp chung (thường là có khả năng kết hợp chung thấp) và phổ di truyền rộng gọi là tester (vật liệu thử) Kiểu lai này còn được

gọi là lai thử (line x tester)

Dòng 1

Dòng 2

Tester Dòng 3

*

*

*

Dòng n

Hình 5.1 Sơ đồ lai đỉnh

e Lai dialen (diallel cross): là kiểu lai giữa một số dòng/giống nghiên cứu (thường từ 6-8 dòng/giống) mà mỗi mẫu giống được lai lần lượt với các mẫu giống còn lại Lai luân giao dùng để xác định khả năng kết hợp chung và khả năng kết hợp riêng của các dòng/giống trong chọn giống ưu thế lai

Griffing (1956) đưa ra 4 phương pháp lai như sau:

• Phương pháp 1: Lai thuận, lai nghịch và tự phối

(bố mẹ) và số tổ hợp lai = p2

• Phương pháp 2: Lai một chiều và tự phối (bố

mẹ) và số tổ hợp lai = p(p + 1)/2

• Phương pháp 3: Lai thuận, lai nghịch, không tự

phối và số tổ hợp lai = p(p - 1)

• Phương pháp 4: Lai một chiều không tự phối và

số tổ hợp lai = p(p - 1)/2

Hình 5.2 Sơ đồ lai dialen theo phương pháp 1 của Griffing

g Lai thuận nghịch (reciprocal cross): là hai

cặp lai đơn mà vị trí bố mẹ được đổi cho nhau

Lai thuận nghịch được sử dụng để xác định sự

khác nhau hay không về tế bào chất của hai bố

mẹ; khi có sự khác nhau về tính kết hạt của hai

cây bố mẹ có ưu thế lai F1 như nhau, lúc này

nên chọn cây có hạt nhiều làm mẹ

A♀ x B♂ B♀ x A♂

Lai thuận Lai nghịch

Hình 5.3 Lai thuận nghịch

h Lai lại (backcross) là lai giữa con lai (làm mẹ)

với một trong hai dạng bố mẹ Kiểu lai này còn được gọi là “lai tích luỹ”

Lai lại được áp dụng chuyển gen mong muốn vào một giống hay một dòng ưu tú như chuyển gen kháng bệnh, lấy lại gen nhân của dòng bố (mẹ) khi lai chuyển gen bất dục đực trong tạo dòng bất dục đực CMS, giảm bớt gen không mong muốn của một bố mẹ trong quá trình lai

h) Lai trở lại nhờ marker (Marker-assisted backcrossing - MAB)

• Phương pháp MAB được tiến hành kết hợp giữa

phương pháp truyền thống (sử dụng phương pháp lai lại) và phương pháp hiện đại (sử dụng chọn lọc marker phân tử) Sau khi tiến hành lai lại, ngay ở thế hệ đầu tiên (BC1F1), các cá thể

có kiểu gen mong muốn được chọn lọc thông qua biểu hiện của các marker Các cá thể này

có thể được sử dụng để lai lại cho các thế hệ sau hoặc tự thụ tuỳ thuộc vào mục tiêu chọn giống

c Lai hồi quy: là kiểu lai giữa hai hay nhiều

cặp lai tích luỹ với nhau với mục đích bổ sung nhiều đặc tính tốt cho con lai

a Lai nhiều bậc (convergent cross): là

kiểu lai giữa con lai đơn với một giống

có đặc tính mong muốn, con lai nhận

được tiếp tục lai với một giống khác có

đặc tính mới và cứ như thế có thể tiếp

tục lai với nhiều giống mà mỗi giống có

một ưu điểm riêng

Alpha x Xaroza

Albidum-24 x Liutexen55/11

Xaratopca-29 Beloturca x Potapca

Hình 5.7 Sơ đồ lai tạo giống lúa mì Xaratopca-29 (A.P Sekhudin)

d Lai phức tạp: Lai giữa các con lai hay

thụ phấn hỗn hợp những hạt phấn của

một số dạng bố cho một giống mẹ

k) Lai nhiều bố mẹ (multi-parent hybridization)

Phương pháp lai các cặp bố mẹ tạo các lai đơn và cuối cùng lai các lai đơn với nhau

Hình 5.8 Sơ đồ lai nhiều bố mẹ

g Lai quy tụ gen dựa trên marker phân

tử (pyramiding)

Tương tự như phương pháp trên, lai quy tụ

gen cũng dựa trên marker phân tử ADN

liên kết với các gen mục tiêu sẽ giúp cho

việc chọn lọc được dễ dàng Để tiến hành

được phương pháp này các nghiên cứu

cần tạo ra các dòng đẳng gen (NIL –

nearly isogenic line) Sau đó, các dòng

NIL này được tiến hành lai với nhau Khi

chọn lọc sẽ sử dụng các marker liên kết

với các gen mong muốn để chọn lọc

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12

Dòng/ giống mới quy tụ các gen quy định tính trạng mong muốn ở lúa

TGST ngắn – Habataki; Năng suất cao – Habataki; Kháng rầy nâu – ADR52; Kháng bạc lá – O longistaminata

Phương pháp lai tế bào soma (Somatic

hybridization) được tiến hành lai ở mức độ tế bào

Các bước lai tế bào soma:

• Bước 1: Phân lập tế bào soma từ mô lá của

cây con, tinh sạch

– Cây bố mẹ được nuôi cấy in vitro tạo cây con trên

môi trường MS (Murashige và Skoog) có bổ sung

thêm các hóa chất khác phù hợp với yêu cầu nuôi

cấy của mỗi loài Cây bố mẹ cũng có thể trồng trong

điều kiện nhà kính, nhà lưới hoặc trên đồng ruộng

Mô lá của cây con sử dụng nuôi tạo calus để tách tế

bào trần (protoplast)

– Phân lập protoplast bằng các enzyme như cellulase C1, xylanase, và pectin lyase, khi xử

lý các enzyme có thể gây tổn thương protoplast cần có nghiên cứu để tránh tổn thương như nghiên cứu của Shigetaka Ishii (1988) phân lập protoplast tế bào lúa trong môi trường bổ sung thêm AgNO3 đã tăng số dòng nhân nhưng năng suất protoplast giảm

Bổ sung thêm superoxide dismutase và catalase cải thiện sự sống sót của protoplast

rõ rệt

• Bước 2: Lai tế bào soma và kiểm tra tế bào

lai

– Dùng pipet hút tế bào trần (khoảng 150µl) đưa lên

miếng giấy nhỏ (cover slip) kích thước 22 x 22 mm,

đặt miếng giấy vào đĩa petri (60 x 15mm) Nhỏ một

giọt nhỏ silicone để giữ miếng giấy, sau 5 phút cố

định protoplast Bổ sung 450µl dung dịch PEG (P2)

đưa vào nuôi cấy

– Kiểm tra tế bào lai bằng phân tích isozyme, xác định

độ bội theo phương pháp của Grosser (1990), phân

tích marker phân tử RAPD sử dụng ADN tách chiết từ

các tế bào lai đã tái sinh, đồng thời với bố mẹ chọn

lọc các tế bào lai thành công

• Bước 3: Tái sinh cây

Tách tế bào lai chuyển lên đĩa petri nuôi cấy tạo calus, tạo rễ và tái sinh cây Môi trường điều kiện nuôi cấy tùy thuộc vào loài cây trồng Điều kiện nhiệt độ, ánh sáng và độ ẩm môi trường nuôi cấy được điều chính phù hợp

Bước 4: Đánh giá và chọn lọc các thế hệ sau

lai tế bào soma

• Đánh giá và chọn lọc các thế hệ sau lai thực

hiện tương tự như lai hữu tính, đặc thù của lai tế

bào soma con cái các thế hệ sau lai có thể xảy

ra biến dị soma do nuôi cấy ngoài biến dị tái tổ

hợp do lai Do vậy cần xác định nguồn biến dị

trong quá trình chọn lọc

• Lai tế bào soma thường được sử dụng lai xa (lai

khác loài) do vậy con cái có thể xảy ra bất thụ,

trong quá trình chọn lọc áp dụng các biện pháp

khắc phục trở ngại con lai bất thụ như lai xa hữu

tính

Kỹ thuật lai giống

• Nguyên lý chọn cặp bố mẹ (5)

• Gieo trồng, chăm sóc vườn cây bố mẹ

và chọn cây bố mẹ

• Chuẩn bị cây lai và dụng cụ lai

• Khử đực và bao cách li

• Thụ phấn và đánh dấu

• Chăm sóc và thu hoạch hạt lai

1.2 Lai xa

Lai xa là sự giao phối giữa các cá thể của hai loài trở lên

Ví dụ: lai giữa loài khoai tây trồng (Solanum tuberosum

L.) với loài khoai tây dại (Solanum demissum) hay lai

giữa chi (genus) lúa mỳ (Triticum) với mạch đen

(Secale) tạo ra cây Triticale

• ng u trong lai xa tăng ng nh ng

u a ng cây ng i c u n i nh

t n, sâu nh…

• Do c xa nhau n t di n cho nên

i p t i, i sau phân li nh, ng

n c t… nên n c o nh ng

i i c nh ng c t i

Những ứng dụng của lai xa

• Chuyển gen mong muốn từ loài tổ tiên hoang dại hoặc loài, chi có quan hệ họ hàng sang các giống cây trồng, đặc biệt là các gen kháng sâu, bệnh, bất dục, chống chịu

• Tận dụng sức sống con lai ở những loài nhất định

• Tạo ra các loài đa bội khác nguồn mới, như triticale

• Xác định mối quan hệ tiến hóa giữa các loài

Khó khăn khi lai xa

• Bất hợp lai, không tạo ra F1: do không hài hòa

trong hệ thống sinh lý của cây

• F1 không có khả năng sống do bất dục NST,

Không hài hòa giữa nhân và tế bào chất giữa

các loài

• F1 bất dục: sự bất dục NST hay sự không hài

hòa của kiểu gen

• Sự suy nhược của con lai: có trường hợp thu

được F1 có sức sống cao, hữu dục nhưng F2 lại

yếu và bất dục

Phương pháp khắc phục

a Cản trở trước khi thụ tinh

- Chọn loài bố mẹ để lai

- Số tổ hợp lai: lai thử với số lượng lớn

- Lai thuận nghịch

- Tăng mức bội thể

- Lai gián tiếp

- Cải tiến kỹ thuật lai: ghép phôi, hỗn hợp hạt phấn, sử dụng dung môi hữu cơ, cắt bỏ đầu nhụy trước khi thụ phấn, xử lý chất điều hòa sinh trưởng, cắt ngắn vời ngụy, dung hợp tế bào

trần, thụ phấn in vitro

b Cản trở sau khi thụ tinh:

- Sử dụng hormon sinh trưởng

- phấn hỗn hợp

- Cứu phôi

- Ghép

c suy c F2

- Gieo ng i n n i hi ng o ra

ng p gen NST cân ng

- Lai i u n i i giao

Một số thành tựu lai xa

• Cây lương thực

- Lúa: chuyển gen kháng c Xa21

i a i O longistaminata, gen ng virus…

- i Triticale con lai a

ch

• Cây ăn quả

- i Tangeto con lai a i C x paradisi i t C reticulata

2 Phương pháp đột biến

• Đột biến là cơ chế chủ yếu tạo ra biến dị di

truyền ở mọi cơ thể sống

• Đột biến ở thực vật là những thay đổi di truyền

đột ngột xảy ra trong toàn bộ vật chất di truyền

(DNA) của cây

• Đối với chọn tạo giống, đột biến cung cấp nguồn

vật liệu di truyền mang các tính trạng mới để

trực p hay gián tiếp tạo ra giống mới

• t phương p sung cho c phương

p n ng c

Ý nghĩa của đột biến

c p ng khi:

• n n nhiên không nh ng mong n

• nh ng mong n trong cây ng nhưng liên t t i nh ng không mong n

• t ng ưu đang gieo ng n i n t

nh ng đơn n

• nh ng mong n trong cây i nhưng lai liên t t i nh ng không mong n

• n n i cây sinh n ng con ng

vô nh (cây nh, cây ăn )

- c nhân c ( c ion a):

- c ion a t cao u gây ra

n i NST, t t t n m

- c ion t thưa c c m

gây ra u t n m

- c nhân a c

c nhân

ĐB

Cây ss

ng t

Cây ss sinh

ng ng ng

Tia gamma Tia X Trung

c c

c nhân a c

366

65

36

17

81

204

227

13

7

14

570

292

49

24

95

ng ng o nh c c nhân t n c nhau (Micke, 1990)

c c ion a thông ng

Tia X

Tia gamma

y X quang

ng ng

( 60 Co, 137 Cs); n

ng t ch

10 -3 – 10nm 0,1A o

2800-2900 A o Tia c m

Neutron

(nhanh,

m, t)

Nguy m

Nguy m

nguy m

t nguy

m

n ng t

ch

n c m

c c nhân t n a c thông ng

Ethyl methane sulphonate

N-methyl-N-nitrozo ure

N-ethyl-N-nitrozo ure

Natri azid (NaN3)

Không u

C n, u ng

C n, u ng

C n, u ng

0,1 – 0,3%

0,01 – 0,03%

0,01 – 0,03%

0,001 – 0,004M

u ng

t u ng :

- u ng u (R) = năng ng t ra

n c

Roentgen (R) = erg/g t t

- u ng p (rad) = năng ng t ra

a c n sang i ng c

i ng p

rad (r) = erg/g t t

- u gây t (LD50): u ng sau khi

% cây ng t năng ra hoa, t t

• t u: y ng i cây ng c

– cây: cây con, i cây – t: t u ng n t – t n

– c n sinh ng: nh giâm, t,

nh sinh ng – o trong nuôi y

• Phương p:

- c ion a n :

+ i gian u

+ u ng n

+ m

+ t

+ ng oxy

Khi t n u ng p hơn u so

i u ng i ưu

n n, trong ng u ng

c c n ng ch t

ng ch nhau t ng i gian t

nh

+ ng n ra ngâm u trong dung

ch n c n c n p o nghiêm t

+ c c ng n nh: m trương

t trong c, a t, a ch, phơi khô t

+ c c nhân nh ng: ng a

t, t , pH, i gian ( -g), ch dung ch ( p

n

Quy nh n c t n cây sinh sản

ng t

•

t ng c nhân gây t n;

c cây M1

t n m; n cây; a

ng hat/ bông a cây thu riêng; Đem gieo o

sau (M2)

•

: Gieo t a c cây n theo ng; Quan t nh

; n c ch

•

: Gieo c t n M2

nh ng riêng M3;

i ng ng không t n t n; Thu hoach M3

•

: So nh sơ bao m i ng; n n

c ng ưu so nh p i u m

• M5 – M8: p i c so nh u a phương;

ng ng i t c ng i

• Công c n nh gieo ng như ng

p trên nhưng công c n c n hơn y c o gen m t cho nên i gian n ng lâu hơn

c t n i nh ng đa gen

• c i t n theo t sinh mô a

nh sinh ng bao m c ng sau:

- m ng n

- m ng

- m nh t

- t n n n

Quy nh n c t n cây sinh

n vô nh

Quy nh phân p t n

m, t n i VM1, p…

• B : VM2; ng VM1; c nh nh

p t n; t i không t n

• B : VM3; ng VM2; m ng

nh ng t di n trong ng t

n p c phân p t n soma

nhân cây t n nh sơ c

t n

• B – B : p c nh nh n nh

ng t a ng vô nh

3.Ứng dụng đa bội thể và đơn bội thể trong chọn giống

Đa i

• ng sinh t trong o sinh ng

ng NST tăng theo t i nguyên n a

NST đơn i (

n lên) c i đa

i

• n ng n cây t n ( – %)

n n cây nuôi ng i i như a ,

a, khoai tây, khoai lang…

• n ng ng NST, c t đa i

, ng vai quan ng trong nh nh

i nh n a a i nh

n ng i sang đa i

• Trong n a, đa i m u gen tăng

m năng i p

ng i nên c ng ưu lai cao hơn

• c ng ng đa i trong n o

ng n n t n do trong u

ng p c đa i nhân o u

n i n cân ng di n

• Trong nhiên, đa i tương

n c t nhiên

Xi – xin

Hungari

Trung Âu

Đan ch

Tây nam Greenland

o băng

Tây c Alaska

Spitsbergen

o Peary

36 - 38

44 - 49

46 - 55

54 - 58

60 - 62

63 - 66

68

77 - 81

82 - 84

37,0 48,6 50,7 53,5 74,0 71,2 59,3 74,0 85,9

c i nh đa i

• Đa i c i theo i a NST cơ

n (tam i – n; i – 4n)

• o ng n hơn ng i

• y hơn i i/ ng hơn

ng xanh m n hơn

• o u ng n hơn, trong

o o a ng p u hơn

Đa i ng n (autopolyploid)

m hơn

• Sinh ng m hơn t c giai

n sinh ng

năng n t t lai khăn Đa i

ng cao c t c ng n

• ng n sinh ng m hơn cây

ng i

Di n đa i ng n

P AA x aa AAAA x aaaa

F1 Aa AAaa

Giao o nh F1

0,5 A; 0,5a 0,167 AA; 0,667 Aa; 0,167 aa

phân ly F2

0,5A 0,5a 0,5A 0,25AA 0,25Aa 0,5a 0,25Aa 0,25aa

ng i