các phương pháp tạo biến dị di truyên

1 Phương pháp lai hữu tính Chương Phương pháp tạo biến dị di truyền chọn giống trồng • Sự giao phối xảy tự nhiên (lai tự nhiên) người tiến hành (lai nhân tạo) tạo biến dị tái tổ hợp có giá trị chọn giống trồng • Khi bố mẹ khác cặp gen alen hệ F2 thu kiểu gen mới, • bố mẹ khác cặp gen alen hệ F2 thu kiểu gen • Tổng quát lai hai bố mẹ khác n gen alen, có 2n giao tử số kiểu gen 3n • Quần thể nhỏ F2 cần thiết để biểu biến dị 4n cá thể • Phương pháp lai hữu tính tạo giống thường ứng dụng trồng có cấu tạo hoa hoàn chỉnh • Đối với thực vật có cấu tạo hoa hoàn chỉnh gồm đủ nhị nhuỵ cần tiến hành khử đực (emasculation) mẹ trước tiến hành lai • Các loài trồng có sinh sản đặc thù như: bất dục đực (male sterility), đơn tính (Gynoecious), tự bất hợp (self - incompatibility) yếu tố di truyền gene nhân, tế bào chất hay yếu tố môi trường lợi dụng tượng để giảm bớt công khử đực, hạt thu mẹ hạt lai • Khái niệm: “Lai giống giao phối (thụ phấn, thụ tinh) hai hay nhiều dạng bố mẹ có di truyền khác để tạo biến dị tái tổ hợp theo mục tiêu chọn giống ” Ví dụ: Lai bố mẹ khác cặp gen alen tạo kiểu gen sau: P1 AAbbCC x aaBBcc P2 F1 AaBbCc F2 AABBCC Kiểu gen AABBcc Kiểu gen AAbbCC Kiểu gen bố mẹ AAbbcc Kiểu gen aaBBCC Kiểu gen aaBBcc Kiểu gen bố mẹ aabbCC Kiểu gen aabbcc Kiểu gen • Lai hữu tính tạo giống phân chia thành lai gần lai xa: – Lai gần lai hai bố mẹ loài Ví dụ, lai giống loài lúa trồng Oryza sativa L (châu Á), O glaberrima (châu Phi)… – Lai xa giao phối hai bố mẹ khác loài hay khác loài phụ Ví dụ: lai hai bố mẹ thuộc hai loài phụ lúa Indica x Japonica; lai loài khoai tây trồng (Solanum tuberosum L.) với loài khoai tây dại (Solanum demissum) hay lai chi (genus) lúa mỳ (Triticum) với mạch đen (Secale) tạo Triticale 5.1.2 Các phương pháp lai hữu tính a) Lai đơn (single cross): lai lần hai bố mẹ, phương pháp đời sớm nhất, sử dụng rộng rãi hiệu đến ngày đơn giản, tốn kém, không yêu cầu trang thiết bị sở vật chất lớn Công thức sau: AxB Ký hiệu: A/B (theo IRRI USDA) A - B (theo CIMMYT) c Lai kép (double cross): • Phương pháp lai hai lai F1 hai lai đơn, công thức lai: (A x B) (C x D) • Ký hiệu A/B//C/D (theo USDA); A/B//C///D (theo IRRI); A – B x C - D (theo CIMMYT) Dòng Dòng Tester Dòng * * * b) Lai ba (three-way cross) • Phương pháp sử dụng lai F1 của lai đơn lai với bố mẹ khác Công thức lai (A x B) x C • Ký hiệu A/B//C (theo IRRI USDA) A - B x C (theo CIMMYT) d Lai đỉnh (topcross): thường sử dụng để xác định khả kết hợp chung nhằm loại bỏ dòng/giống khả tổ hợp tạo giống ưu lai Các dòng/giống mang lai thử lai với vài ba giống ổn định khả kết hợp chung (thường có khả kết hợp chung thấp) phổ di truyền rộng gọi tester (vật liệu thử) Kiểu lai gọi lai thử (line x tester) e Lai dialen (diallel cross): kiểu lai số dòng/giống nghiên cứu (thường từ 6-8 dòng/giống) mà mẫu giống lai với mẫu giống lại Lai luân giao dùng để xác định khả kết hợp chung khả kết hợp riêng dòng/giống chọn giống ưu lai Dòng n Hình 5.1 Sơ đồ lai đỉnh Griffing (1956) đưa phương pháp lai sau: • Phương pháp 1: Lai thuận, lai nghịch tự phối (bố mẹ) số tổ hợp lai = p2 • Phương pháp 2: Lai chiều tự phối (bố mẹ) số tổ hợp lai = p(p + 1)/2 • Phương pháp 3: Lai thuận, lai nghịch, không tự phối số tổ hợp lai = p(p - 1) • Phương pháp 4: Lai chiều không tự phối số tổ hợp lai = p(p - 1)/2 A B C D A AxA AxB AxC AxD B BxA BxB BxC BxD C C xA CxB CxC CxD D D xA DxB DxC DxD Hình 5.2 Sơ đồ lai dialen theo phương pháp Griffing g Lai thuận nghịch (reciprocal cross): hai cặp lai đơn mà vị trí bố mẹ đổi cho Lai thuận nghịch sử dụng để xác định khác hay không tế bào chất hai bố mẹ; có khác tính kết hạt hai bố mẹ có ưu lai F1 nhau, lúc nên chọn có hạt nhiều làm mẹ A♀ x B♂ Lai thuận B♀ x A♂ Lai nghịch h Lai lại (backcross) lai lai (làm mẹ) với hai dạng bố mẹ Kiểu lai gọi “lai tích luỹ” Lai lại áp dụng chuyển gen mong muốn vào giống hay dòng ưu tú chuyển gen kháng bệnh, lấy lại gen nhân dòng bố (mẹ) lai chuyển gen bất dục đực tạo dòng bất dục đực CMS, giảm bớt gen không mong muốn bố mẹ trình lai Hình 5.3 Lai thuận nghịch h) Lai trở lại nhờ marker (Marker-assisted backcrossing - MAB) • Phương pháp MAB tiến hành kết hợp phương pháp truyền thống (sử dụng phương pháp lai lại) phương pháp đại (sử dụng chọn lọc marker phân tử) Sau tiến hành lai lại, hệ (BC1F1), cá thể có kiểu gen mong muốn chọn lọc thông qua biểu marker Các cá thể sử dụng để lai lại cho hệ sau tự thụ tuỳ thuộc vào mục tiêu chọn giống c Lai hồi quy: kiểu lai hai hay nhiều cặp lai tích luỹ với với mục đích bổ sung nhiều đặc tính tốt cho lai a Lai nhiều bậc (convergent cross): kiểu lai lai đơn với giống có đặc tính mong muốn, lai nhận tiếp tục lai với giống khác có đặc tính tiếp tục lai với nhiều giống mà giống có ưu điểm riêng Beloturca x Potapca Alpha x Xaroza Albidum-24 x Liutexen55/11 Xaratopca-29 Hình 5.7 Sơ đồ lai tạo giống lúa mì Xaratopca-29 (A.P Sekhudin) d Lai phức tạp: Lai lai hay thụ phấn hỗn hợp hạt phấn số dạng bố cho giống mẹ k) Lai nhiều bố mẹ (multi-parent hybridization) Phương pháp lai cặp bố mẹ tạo lai đơn cuối lai lai đơn với Hình 5.8 Sơ đồ lai nhiều bố mẹ TGST ngắn g Lai quy tụ gen dựa marker phân tử (pyramiding) Tương tự phương pháp trên, lai quy tụ gen dựa marker phân tử ADN liên kết với gen mục tiêu giúp cho việc chọn lọc dễ dàng Để tiến hành phương pháp nghiên cứu cần tạo dòng đẳng gen (NIL – nearly isogenic line) Sau đó, dòng NIL tiến hành lai với Khi chọn lọc sử dụng marker liên kết với gen mong muốn để chọn lọc 10 11 12 Năng suất cao 10 1112 Kháng rầy nâu bạc 10 11 12 10 1112 Dòng/ giống quy tụ gen quy định tính trạng mong muốn lúa TGST ngắn – Habataki; Năng suất cao – Habataki; Kháng rầy nâu – ADR52; Kháng bạc – O longistaminata Phương pháp lai tế bào soma (Somatic hybridization) tiến hành lai mức độ tế bào Các bước lai tế bào soma: • Bước 1: Phân lập tế bào soma từ mô con, tinh – Cây bố mẹ nuôi cấy in vitro tạo môi trường MS (Murashige Skoog) có bổ sung thêm hóa chất khác phù hợp với yêu cầu nuôi cấy loài Cây bố mẹ trồng điều kiện nhà kính, nhà lưới đồng ruộng Mô sử dụng nuôi tạo calus để tách tế bào trần (protoplast) – Phân lập protoplast enzyme cellulase C1, xylanase, pectin lyase, xử lý enzyme gây tổn thương protoplast cần có nghiên cứu để tránh tổn thương nghiên cứu Shigetaka Ishii (1988) phân lập protoplast tế bào lúa môi trường bổ sung thêm AgNO3 tăng số dòng nhân suất protoplast giảm Bổ sung thêm superoxide dismutase catalase cải thiện sống sót protoplast rõ rệt • Bước 2: Lai tế bào soma kiểm tra tế bào lai – Dùng pipet hút tế bào trần (khoảng 150µl) đưa lên miếng giấy nhỏ (cover slip) kích thước 22 x 22 mm, đặt miếng giấy vào đĩa petri (60 x 15mm) Nhỏ giọt nhỏ silicone để giữ miếng giấy, sau phút cố định protoplast Bổ sung 450µl dung dịch PEG (P2) đưa vào nuôi cấy – Kiểm tra tế bào lai phân tích isozyme, xác định độ bội theo phương pháp Grosser (1990), phân tích marker phân tử RAPD sử dụng ADN tách chiết từ tế bào lai tái sinh, đồng thời với bố mẹ chọn lọc tế bào lai thành công • Bước 3: Tái sinh Tách tế bào lai chuyển lên đĩa petri nuôi cấy tạo calus, tạo rễ tái sinh Môi trường điều kiện nuôi cấy tùy thuộc vào loài trồng Điều kiện nhiệt độ, ánh sáng độ ẩm môi trường nuôi cấy điều phù hợp Bước 4: Đánh giá chọn lọc hệ sau lai tế bào soma • Đánh giá chọn lọc hệ sau lai thực tương tự lai hữu tính, đặc thù lai tế bào soma hệ sau lai xảy biến dị soma nuôi cấy biến dị tái tổ hợp lai Do cần xác định nguồn biến dị trình chọn lọc • Lai tế bào soma thường sử dụng lai xa (lai khác loài) xảy bất thụ, trình chọn lọc áp dụng biện pháp khắc phục trở ngại lai bất thụ lai xa hữu tính 1.2 Lai xa ng u t • Do u lai xa tăng a ng ng i c u n, sâu nh… ng nh n i ng nh c xa n t di n p t i, i sau phân li nh, ng c t… nên n c o nh ng i c nh ng c t i i n i • Nguyên lý chọn cặp bố mẹ (5) • Gieo trồng, chăm sóc vườn bố mẹ chọn bố mẹ • Chuẩn bị lai dụng cụ lai • Khử đực bao cách li • Thụ phấn đánh dấu • Chăm sóc thu hoạch hạt lai Những ứng dụng lai xa Lai xa giao phối cá thể hai loài trở lên Ví dụ: lai loài khoai tây trồng (Solanum tuberosum L.) với loài khoai tây dại (Solanum demissum) hay lai chi (genus) lúa mỳ (Triticum) với mạch đen (Secale) tạo Triticale • Kỹ thuật lai giống Khó khăn lai xa • Bất hợp lai, không tạo F1: không hài hòa hệ thống sinh lý • F1 khả sống bất dục NST, Không hài hòa nhân tế bào chất loài • F1 bất dục: bất dục NST hay không hài hòa kiểu gen • Sự suy nhược lai: có trường hợp thu F1 có sức sống cao, hữu dục F2 lại yếu bất dục • Chuyển gen mong muốn từ loài tổ tiên hoang dại loài, chi có quan hệ họ hàng sang giống trồng, đặc biệt gen kháng sâu, bệnh, bất dục, chống chịu • Tận dụng sức sống lai loài định • Tạo loài đa bội khác nguồn mới, triticale • Xác định mối quan hệ tiến hóa loài Phương pháp khắc phục a Cản trở trước thụ tinh - Chọn loài bố mẹ để lai - Số tổ hợp lai: lai thử với số lượng lớn - Lai thuận nghịch - Tăng mức bội thể - Lai gián tiếp - Cải tiến kỹ thuật lai: ghép phôi, hỗn hợp hạt phấn, sử dụng dung môi hữu cơ, cắt bỏ đầu nhụy trước thụ phấn, xử lý chất điều hòa sinh trưởng, cắt ngắn vời ngụy, dung hợp tế bào trần, thụ phấn in vitro Một số thành tựu lai xa b Cản trở sau thụ tinh: - Sử dụng hormon sinh trưởng phấn hỗn hợp - Cứu phôi - Ghép c suy c F2 - Gieo ng i n n i hi ng ng p gen NST cân ng - Lai i u n i i giao o • Cây lương thực - Lúa: chuyển gen kháng c Xa21 i a i O longistaminata, gen virus… i Triticale lai a a ch • Cây ăn i Tangeto lai a i C x paradisi i t C reticulata Ý nghĩa đột biến • • Đột biến chế chủ yếu tạo biến dị di truyền thể sống • Đột biến thực vật thay đổi di truyền đột ngột xảy toàn vật chất di truyền (DNA) • Đối với chọn tạo giống, đột biến cung cấp nguồn vật liệu di truyền mang tính trạng để trực p hay gián tiếp tạo giống • t phương p sung cho c phương p n ng c c nhân - c nhân n gây - t n c( c ion c ion i NST, t t a t t n c u c nhân ion t t n a c nh t a): cao m thưa m • • • • a t, phương p t c p ng khi: c Phương pháp đột biến ng n n n nhiên không nh ng mong n nh ng mong n ng liên t t i nh ng không mong n t ng ưu gieo ng n i n t nh ng đơn n nh ng mong n i lai liên t t i nh ng không mong n n n i sinh n ng ng vô nh (cây nh, ăn ) ng ng o (Micke, 1990) nh c c nhân t n c c nhân ĐB Cây ss ng t Cây ss sinh ng Tia gamma 366 204 570 Tia X 65 227 292 36 13 49 17 24 81 14 95 ng ng u gây c c m Trung c c nhân c a c c c ion c c n Tia gamma ng c gây Nguy m ng ng (60Co, 137Cs); ng t ch 0,1Ao Nguy m n n 2800-2900 Ao c m nguy Neutron (nhanh, m, t - - - n ng ch t t n a n t Tên i 10-3 – 10nm c m c nhân c thông c ng/ ng y X quang Tia X Tia a thông t n Ethyl methane sulphonate Không ng ng ng 0,1 – 0,3% u N-methyl-N-nitrozo ure C n, u ng 0,01 – 0,03% N-ethyl-N-nitrozo ure C n, u ng 0,01 – 0,03% Natri azid (NaN3) C n, u ng 0,001 – 0,004M m t nguy m ng t) u ng u ng : u ng u (R) = ng t n c Roentgen (R) = erg/g t t u ng p (rad) = ng t a c n sang i ng c i ng p rad (r) = erg/g t t u gây t (LD50): u ng sau % ng t hoa, t t • Phương p: c ion a n : + i gian u + u ng n + m + t + ng oxy Khi t n u ng p u so i u ng i ưu n n, ng u ng c c n ng ch t ng ch t ng i gian t nh t • t phương u u: y ng n – – – – – • cây: con, t: t u ng t n c n sinh nh sinh ng o nuôi p i c nhau: t ng n c i n ng: t nh giâm, t, y c nhân a c: ng n ngâm u dung ch n c n c n p o nghiêm t + c c ng n nh: m trương t c, a t, a ch, phơi khô t + c c nhân nh ng: ng a t, t , pH, i gian ( g), ch dung ch ( p n ch t c ) + Quy ng t • nh n c n sinh sản t c t n i nh ng đơn gen : ng t ng c nhân gây t n; c M1 t n m; n cây; a ng hat/ a thu riêng; Đem gieo o sau (M2) : Gieo t a c n theo ng; Quan t nh ; n c ch : Gieo c t n M2 nh ng riêng M3; i ng ng không t n t n; Thu hoach M3 : So nh sơ bao m i ng; n n c ng ưu so nh p i u m M5 – M8: p i c so nh u a phương; ng ng i t c ng i • • • • Quy nh n vô nh • - n c t Quy • B : • B : VM3; ng VM2; m ng nh ng t di n ng t n p c phân p t n soma nhân t n nh sơ c t n : ng t p c t a nh nh n ng vô nh n ng đa gen i nh • Công c n nh gieo ng ng p công c n c n y c o gen m t i gian n ng lâu n sinh c i t n theo t sinh mô a nh sinh ng bao m c ng sau: m ng n m ng m nh t t n n n • B –B c nh phân t • B : m, t • B : p t VM1; n p t n n m i VM1, t n p… VM2; ng VM1; c nh n; t i không t nh n 3.Ứng dụng đa bội thể đơn bội thể chọn giống nh Đa a • i a đa i ng sinh t ng NST tăng theo NST đơn i ( n nhiên n o sinh ng i nguyên lên) c i t ng n a đa i • n ng n t n ( – %) n n nuôi ng i i a , a, khoai tây, khoai lang… • n ng ng NST, c t đa i , ng vai quan ng nh nh i nh n a a i nh n ng i sang đa i • Trong n a, đa i m u gen tăng m i p Quan a n c ng t a đa i nhiên đa Xi – xin 36 - 38 37,0 Hungari 44 - 49 48,6 Trung Âu 46 - 55 50,7 Đan 54 - 58 53,5 60 - 62 74,0 63 - 66 71,2 68 59,3 Spitsbergen 77 - 81 74,0 o Peary 82 - 84 85,9 ch Tây nam Greenland o băng Tây c Alaska • đa i nh p cao ng i nên c ng ưu lai cao • c ng ng đa i n o ng n n t n u ng p c đa i nhân o u n i n cân ng di n • Trong nhiên, đa i tương quan i cao c i t n ng n u m • Sinh ng m t c giai n sinh ng • u c p ng i, n t t lai khăn Đa ng cao c t c ng n • ng n sinh ng m ng i c Đa (%) nh đa i i i ng n (autopolyploid) • Đa i c i theo i a NST n (tam i – n; i – 4n) • o ng n ng i • y i i/ ng ng xanh m n • o u ng n hơn, o o a ng p u n đa Di • ng P AA x aa F1 Aa n i AAAA x aaaa o 0,5 A; 0,5a nh F1 0,167 AA; 0,667 Aa; 0,167 aa phân ly ng ng AAaa Giao i i i F2 i 0,5A 0,5a 0,5A 0,25AA 0,25Aa 0,5a 0,25Aa 0,25aa 10 phân ly F2 c i 0,167AA 0,667Aa 0,167aa 0,167AA 0,0278 AAAA 0,1111 AAAa 0,0278 AAaa 0,667Aa 0,1111 AAAa 0,4444 AAaa 0,1111 Aaaa 0,167aa 0,0278 AAaa 0,1111 Aaaa 0.0278 aaaa Phương p o đa i ng ng n o đa i ng ng nguyên phân: ng c c nhân ng, nh, c gây mê… c ng o nh phân chia m m • conchicine (C22H25NO6) hay N2 O u n p t cao acenapthane c t y m t c a thoi vô c m cho NST n phân chia m c không c o c, o nh o i NST tăng p đôi • Nuôi y mô o đa i ng ng u nh hay m m ng u gen F2 i i 0,25 AA 0,50 Aa 0,25 aa • a o giao không m m 2n • ng giao y ng NST tương o soma • n giao n c m t di n nh ng nh i n i nh m ng đa 0,0278 AAAA (Quadriplex) 0,2222 AAAa (Triplex) 0,5 AAaa (Duplex) 0,2222 Aaaa (Simplex) 0,0278 aaaa (Nulliplex) i ng • Dưa u tam i không • i ng tam i • Nho i • Cây c ăn gia c… n n t t • Giao • u n nh nh thông qua t ng nh m m u nh sau: m m n t không y u y o giao n ng t di n ng m m n hai không y u y o nh giao n c ng p 11 nh đa a nh Đa • i c n (allopolyploidy) nh nh tăng hay u NST c gen a c i hay c chi c nhau) c o nh lai a c i c i sau NST c nhân đôi c gen c ng c u ng in hoa (AABBDD…) Đa i c n n i nhiên t o i i Đa i c n u c cao đa i ng n Tuy nhiên, u c nh n nh a đa i nhân o c o c tương ng NST a c gen a c i P: 2n • • • • • • • ng đa i c ng NST b b G a Tăng i NST a TB sinh ng (1) n b n Tăng i NST a TB sinh ng (1) a b (1) ng nguyên i iA a a a a G ng tăng o sinh ng a a ( • i a a nguyên i a a b b 2n x ng nguyên i iB b b b b b b 2n n Tạo loài trồng Khắc phục cản trở lai xa Phục hồi hữu dục lai xa Tăng khả kháng sâu bệnh điều kiện bất lợi Hình 5.17 Những đường chủ yếu hình thành đa bội 3.3 Đơn bội thể Tạo đơn bội thể • Ý nghĩa: - Sử dụng đơn bội thể rút ngắn nhanh trình đồng hợp tử hóa cách chuyển từ đơn bội sang đơn bội kép - Cây đơn bội biểu tất thông tin di truyền kiểu hình nên dễ dàng nhận biết alen lặn, khả kháng điều kiện bất lợi - Có thể phát đột biến đơn bội, đột biến truyền qua giai đoạn phôi • Các trình sau dẫn đến tạo đơn bội điều kiện in vivo - Mẫu sinh (thụ tinh giả): tế bào đơn bội túi phôi phát triển thành bào tử thể - Phụ sinh: trình thụ tinh bình thường tế bào trứng có nguồn gốc từ gen mẹ bị nhân bố đẩy nhân bố gắn vào tế bào chất mẹ phát triển thành bào tử thể đơn bội - Loại trừ NST: Loại trừ hoàn toàn gen bố mẹ lai dẫn đến đơn bội 12 Phương pháp 1: Tạo đơn bội nuôi cấy bao phấn • Tạo đơn bội thể điều kiện in vitro: - Nuôi cấy bầu noãn không thụ tinh - Nuôi cấy bao phấn, hạt phấn Các bước nuôi cấy bao phấn tạo đơn bội: • Bước 1: Lựa chọn kiểu gen • Bước 2: Trồng chăm sóc cho phấn • Bước 3: Chuẩn bị môi trường nuôi cấy • Bước 4: Thu bao phấn, khử trùng, bảo quản • Bước 5: Nuôi cấy tạo calus tái sinh • Bước 6: Chuyển giá thể, đất đánh giá chọn lọc dòng Phương pháp nuôi cấy bao phấn ý Phương pháp 2: tạo đơn bội kích tạo đơn bội tự nhiên • Khử trùng bao phấn non đưa vào môi trường nuôi cấy nhiệt độ thích hợp (280C) • Nhiều yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy bao phấn như: điều kiện xử lý mẫu, môi trường nuôi cấy, kiểu gen vật liệu • Phương pháp kích tạo đơn bội tự nhiên hay gọi phương pháp tạo đơn bội kép (DH) in vivo Geiger (2009) sách chọn tạo giống ngô (Nhà xuất Springer, New York) thông báo thụ phấn ngô có kiểu gen đặc thù gọi kích tạo (inducer), nhận phấn tạo tỉ lệ hạt định có phôi đơn bội (haploid embryo) nội nhũ tam bội Kỹ thuật sử dụng rộng rãi phát triển dòng tạo giống ngô lai thương mại * Lưỡng bội hóa đơn bội tạo đơn bội kép (DH): Phương pháp lưỡng bội hóa đơn bội từ nuôi cấy bao phấn hay kích tạo đơn bội (in vivo) phổ biến sử dụng colchicine (Gayen cs., 1994; Deimling cs., 1997; Eder Chalyk, 2002) Chất alkaloid hoạt động cản trở trình phân chia tế bào dẫn đến không giảm số lượng nhiễm sắc thể phân chia Colchicine có tính độc cao, ngày sử dụng số chất khác thay thuốc trừ cỏ, pronamid, APM, trifluralin, oryzalin, Nitrous oxide gas (Kato, 2002), chất thay không phù hợp xử lý số lượng lớn Hình 5.20 Các bước tạo dòng DH ngô băng Phương pháp in vivo (Nguồn Andrés Gordillo cs., 2010) 13 Tạo biến dị công nghệ tế bào 4.1 Nguồn gốc biến dị tế bào soma a Những thay đổi di truyền xảy trước nuôi cấy mô in vitro: Trong trình phát triển cá thể, phân hoá già hoá mô tế bào số thay đổi di truyền xảy tích luỹ tế bào soma (D'amato, 1985) Nhờ kỹ thuật nuôi cấy mô, tái sinh từ tế bào soma đột biến Các nhà khoa học đưa khái niệm automutagenesis - tự đột biến (đột biến xảy không tác nhân từ bên gây nên đột biến tự - automuctagenesis) 4.2 Các hướng ứng dụng tượng biến dị tế bào sôma Như phân tích trên, việc gây tạo chọn lọc đột biến tế bào soma xảy nuôi cấy in vitro có nhiều ứng dụng đa dạng: - Tạo dòng tế bào nuôi cấy có khả sản xuất chất hoạt tính sinh học với suất cao (xem công nghệ bioreactor) - Tạo giống trồng mang đặc tính biến dị quý, ví dụ, nhà khoa học Đài Loan chọn tạo giống chuối thấp cây, chống chịu bệnh thối rũ nấm Fusarium gây nước ta, Viện Công nghệ sinh học tạo giống lúa DR2 có khả chịu hạn, chịu lạnh phương pháp chọn lọc biến dị tế bào soma in vitro từ giống lúa khả chống chịu Giống công nhận giống quốc gia 5.1 Các phương pháp chuyển gen 5.1.1 Chuyển gen trực tiếp Là phương pháp chuyển trực tiếp gen thiết kế plasmid vào tế bào thực vật có trợ giúp yếu tố hoá học, vật lý tác nhân giới Chuyển gen trực tiếp thông qua số kỹ thuật sau a Chuyển gen xung điện b Chuyển gen nhờ xử lý PEG (polyethylene glycon) c Chuyển gen vi tiêm d Chuyển gen súng bắn gen b Những thay đổi di truyền xảy trình in vitro: Một nguồn biến dị tế bào soma quan trọng thay đổi máy di truyền xảy nuôi cấy tạo mô sẹo phân hoá quan in vitro Chroqui Bercetch (1985) cho biết auxin gây đa bội hoá bên tế bào nuôi cấy (endopolyploidization) Oono (1982) nuôi cấy mô sẹo từ hạt lúa tái sinh từ mô sẹo cho biết BAP có nồng độ 30 mg/l tạo tần số đột biến lớn gấp 50 lần so với BAP nồng độ mg/l Tạo biến dị công nghệ gen (chuyển gen) • Chuyển gen công cụ bổ sung cho chọn tạo giống truyền thống giúp cho việc mở rộng nguồn gen có lợi từ loài khác chuyển sang loài trồng mong muốn Công nghệ chuyển gen có lợi chuyển gen đơn gen số lượng mà phương pháp truyền thống khó thực 5.1.2 Chuyển gen gián tiếp Phương pháp chuyển gen gián tiếp gen chuyển vào tế bào thực vật qua sinh vật trung gian, thường vi sinh vật virus a Chuyển gen nhờ virus b Chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 14 Phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens • Cơ sở phương pháp dựa tượng nhóm vi khuẩn Agrobacterium mang plasmid gây khối u thực vật gọi Ti-plasmid mô tả hình • Bước 6: bên tế bào chất tế bào ký chủ T-DNA tồn chút T-complex thành thục, phân tử T-strand có độ dài hoàn chỉnh với vỏ số phân tử VirE2 Những phân tử TDNA cấu trúc protein cần thiết cho vận chuyển nhân đến nhân tế bào ký chủ, bước trình biến nạp di truyền; • Bước 7: thâm nhập vào nhân; • Bước 8: vận chuyển nhân; • Bước 9: T- DNA không vỏ bọc; • Bước 10: hòa hợp với di truyền ký chủ Cơ chế trình vi khuẩn chuyển gen vào tế bào • Bước 1: vi khuẩn tiếp xúc với thực vật; • Bước 3: kích thích biểu vùng vir tín hiệu đặc thù ký chủ; • Bước 4: tạo phân tử ADN sợi đơn (T- strand), tổ hợp hoạt động protein VirD1 VirD2; • Bước 5: tế bào vi khuẩn tồn T-DNA phức hợp protein ADN với phân tử VirD2 gắn đầu 5’ T-strand có số protein vir khác chuyển vào tế bào ký chủ hệ thống VirB/D4, bước yêu cầu có tương tác T-pilus với protein đặc thù ký chủ; Các bước chuyển gen nhờ vi khuẩn • Bước 1: Tách nhân vi khuẩn • Bước 2: Gắn ADN cần chuyển vào Ti plamid vi khuẩn • Bước 3: Tách mô chuyển gen • Bước 4: Lây nhiễm vi khuẩn gắn plamid vào mô tế bào • Bước 5: Tái sinh chuyển gen • Bước 6: Đánh giá chuyển gen 15 [...]... lượng lớn Hình 5.20 Các bước tạo dòng DH ở ngô băng Phương pháp in vivo (Nguồn Andrés Gordillo và cs., 2010) 13 4 Tạo biến dị bằng công nghệ tế bào 4.1 Nguồn gốc của các biến dị tế bào soma a Những thay đổi di truyền xảy ra trước khi nuôi cấy mô in vitro: Trong quá trình phát triển cá thể, phân hoá và già hoá của mô và tế bào một số các thay đổi di truyền đã xảy ra và được tích luỹ trong các tế bào soma... bào soma sẽ là các đột biến Các nhà khoa học đưa ra khái niệm automutagenesis - tự đột biến (đột biến xảy ra không do các tác nhân từ bên ngoài gây nên hay là đột biến tự nó - automuctagenesis) 4.2 Các hướng ứng dụng của hiện tượng biến dị tế bào sôma Như đã phân tích ở trên, việc gây tạo và chọn lọc các đột biến tế bào soma xảy ra trong nuôi cấy in vitro có nhiều ứng dụng đa dạng: - Tạo ra dòng tế... sản xuất các chất hoạt tính sinh học với năng suất cao (xem công nghệ bioreactor) - Tạo ra các giống cây trồng mang những đặc tính biến dị quý, ví dụ, các nhà khoa học ở Đài Loan đã chọn tạo được giống chuối thấp cây, chống chịu bệnh thối rũ do nấm Fusarium gây ra ở nước ta, Viện Công nghệ sinh học đã tạo được giống lúa mới DR2 có khả năng chịu hạn, chịu lạnh bằng phương pháp chọn lọc các biến dị tế bào... đánh giá chọn lọc dòng Phương pháp nuôi cấy bao phấn chú ý Phương pháp 2: tạo đơn bội bằng kích tạo đơn bội tự nhiên • Khử trùng bao phấn non rồi đưa vào môi trường nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp (280C) • Nhiều yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy bao phấn như: điều kiện xử lý mẫu, môi trường nuôi cấy, kiểu gen của vật liệu • Phương pháp kích tạo đơn bội tự nhiên hay còn gọi là phương pháp tạo đơn bội kép (DH)... tạo ra tần số đột biến lớn gấp 50 lần so với BAP ở nồng độ 2 mg/l 5 Tạo biến dị bằng công nghệ gen (chuyển gen) • Chuyển gen là một công cụ mới bổ sung cho chọn tạo giống truyền thống và có thể giúp cho việc mở rộng các nguồn gen có lợi từ các loài khác chuyển sang các loài cây trồng mong muốn Công nghệ chuyển gen có lợi thế là có thể chuyển một gen đơn hoặc gen số lượng mà phương pháp truyền thống... sách chọn tạo giống ngô (Nhà xuất bản Springer, New York) đã thông báo rằng nếu thụ phấn các cây ngô có kiểu gen đặc thù gọi là cây kích tạo (inducer), cây nhận phấn tạo ra một tỉ lệ hạt nhất định có phôi đơn bội (haploid embryo) và nội nhũ tam bội Kỹ thuật sử dụng rộng rãi phát triển dòng thuần trong tạo giống ngô lai thương mại * Lưỡng bội hóa cây đơn bội tạo cây đơn bội kép (DH): Phương pháp lưỡng... thay đổi di truyền xảy ra trong quá trình in vitro: Một nguồn biến dị tế bào soma quan trọng là thay đổi trong bộ máy di truyền xảy ra khi nuôi cấy tạo mô sẹo và phân hoá cơ quan in vitro Chroqui và Bercetch (1985) cho biết auxin gây ra đa bội hoá bên trong tế bào nuôi cấy (endopolyploidization) Oono (1982) nuôi cấy mô sẹo từ hạt lúa và tái sinh cây từ mô sẹo cho biết BAP có nồng độ 30 mg/l tạo ra tần... đến đơn bội 12 Phương pháp 1: Tạo đơn bội bằng nuôi cấy bao phấn • Tạo đơn bội thể trong điều kiện in vitro: - Nuôi cấy bầu và noãn không thụ tinh - Nuôi cấy bao phấn, hạt phấn Các bước nuôi cấy bao phấn tạo cây đơn bội: • Bước 1: Lựa chọn kiểu gen • Bước 2: Trồng và chăm sóc cây cho phấn • Bước 3: Chuẩn bị môi trường nuôi cấy • Bước 4: Thu bao phấn, khử trùng, bảo quản • Bước 5: Nuôi cấy tạo calus và... lạnh bằng phương pháp chọn lọc các biến dị tế bào soma in vitro từ một giống lúa không có khả năng chống chịu Giống này đã được công nhận là giống quốc gia 5.1 Các phương pháp chuyển gen 5.1.1 Chuyển gen trực tiếp Là phương pháp chuyển trực tiếp các gen đã được thiết kế trong plasmid vào tế bào thực vật có sự trợ giúp của yếu tố hoá học, vật lý và tác nhân cơ giới Chuyển gen trực tiếp thông qua một số... 2n n Tạo ra các loài cây trồng mới Khắc phục cản trở khi lai xa Phục hồi hữu dục ở con lai xa Tăng khả năng kháng sâu bệnh và điều kiện bất lợi Hình 5.17 Những con đường chủ yếu hình thành đa bội 3.3 Đơn bội thể Tạo đơn bội thể • Ý nghĩa: - Sử dụng đơn bội thể có thể rút ngắn nhanh quá trình đồng hợp tử hóa bằng cách chuyển từ đơn bội sang đơn bội kép - Cây đơn bội biểu hiện tất cả các thông tin di truyền ... lai a i C x paradisi i t C reticulata Ý nghĩa đột biến • • Đột biến chế chủ yếu tạo biến dị di truyền thể sống • Đột biến thực vật thay đổi di truyền đột ngột xảy toàn vật chất di truyền (DNA)... hợp chung (thường có khả kết hợp chung thấp) phổ di truyền rộng gọi tester (vật liệu thử) Kiểu lai gọi lai thử (line x tester) e Lai dialen (diallel cross): kiểu lai số dòng/giống nghiên cứu... ngô băng Phương pháp in vivo (Nguồn Andrés Gordillo cs., 2010) 13 Tạo biến dị công nghệ tế bào 4.1 Nguồn gốc biến dị tế bào soma a Những thay đổi di truyền xảy trước nuôi cấy mô in vitro: Trong