Bài giảng các giai đoạn của vi nhân giống

GIAI ĐOẠN 0: CHUẨN BỊ CÂY MẸ+ Mô thực vật đang trong quá trình hưu miên * Đối với cây thân gỗ người ta làm trẻ hóa các chồi bằng cách ghép nhiều tầng để mẫu cấy trở nên non hơn... - Sự h

CÁC GIAI ĐOẠN

CỦA VI NHÂN GIỐNG

Giới thi ệ ệ u u

 Vi nhân giống gồm 5 giai đoạn:

– Giai đoạn 0: chuẩn bị cây mẹ.

– Giai đoạn 1: khử trùng mẫu cấy.

– Giai đoạn 2: nhân (giai đoạn tăng sinh mô), tạo

chồi

– Giai đoạn 3: kéo dài, tạo rễ và tiền thuần dưỡng– Giai đoạn 4: thuần dưỡng

GIAI ĐOẠN 0: CHUẨN BỊ CÂY MẸ

+ Mô thực vật đang trong quá trình hưu miên

* Đối với cây thân gỗ người ta làm trẻ hóa các chồi bằng cách ghép nhiều tầng để mẫu cấy trở nên non hơn

GIAI ĐOẠN 1: KHỬ TRÙNG MẪU CẤY

* Khử trùng bề mặt mẫu cấy gồm: rửa mẫu và khử trùng mẫu cấy.

+ Rửa mẫu: Dưới vòi nước chảy từ 30phút đến 2giờ, sau đó rửa mẫu bằng xà bông bột.

+ Khử trùng mẫu cấy bằng: Hypoclorite sodium 0,5 - 5,25% Có thể dùng cồn, nitrate bạc, clorua thuỷ ngân.

* Mẫu cấy có thể bị hoá nâu hoặc hoá đen sau vài ngày nếu để lâu ngày thì mẫu cấy sẽ chết Nguyên nhân do:

+ mẫu cấy chứa các hợp chất hydroxyphenol

+ tanin

+ hoạt động của enzym oxidase có nhân Cu.

Các thao tác c y hoa h ng giai ấ ồ ở đọ an 1

GIAI ĐOẠN 2: NHÂN (GIAI ĐOẠN

TĂNG SINH MÔ)

* Tạo phôi soma:

- Từ 1 tế bào đơn -> phôi -> cây nguyên vẹn.

- Phôi soma được tạo ra từ tế bào soma nhưng hình thái giống phôi hữu tính.

- Phôi soma thường được sinh ra từ mô sẹo

*

* Tăng cường sự phát triển chồi bên:

- Chồi bên và chồi ngọn -> cây con

- Chồi bên được hình thành trên chồi ban đầu -> chồi đơn hoặc cụm chồi.

- Sự hình thành mô sẹo có thể xảy ra cùng với

sự phát triển của chồi và những chồi bất định có nguồn gốc từ vùng phân sinh trong mô sẹo sẽ phát triển thành cây con Cytokinin nồng độ 1-30mg/l

có thể kích thích tăng sinh chồi bên.

- Cây con được tạo ra và được chuyển sang giai đoạn 3 để cảm ứng ra rễ.

*

* Sự phát triển chồi bất định:

Chồi bất định có nguồn gốc từ mô sẹo

Mô sẹo là thể trung gian giữa mẫu cấy và cây con

Số lượng cụm chồi có thể tăng lên qua những lần phân cắt trong việc cấy chuyền Cây con có thể chuyển sang giai đoạn 3 để tạo rễ.

GIAI ĐOẠN 3:

KÉO DÀI, RA RỄ INVITRO VÀ ĐIỀU KIỆN

RA RỄ

*

* Khi chuyển chồi sang môi trường ra rễ thì

cần phải tách thành những đơn vị riêng rẽ Đây là giai đoạn chồi cảm ứng ra rễ và phát triển thành cây con hoàn chỉnh, giai đoạn này có thể kéo dài 2-

0,05-* Môi trường với hàm lượng khoáng thấp so với môi trường ban đầu Đường rất cần thiết cho

sự ra rễ của cây tốt nhất là glucose.

* Môi trường lý tưởng cho sự ra rễ là có pH trung tính họăc hơi acid, có khả năng giử nước nhưng lại phải thông thoáng.

* Nhiệt độ kích thích sự ra rễ tốt nhất là 25-28 0 c.

GIAI ĐOẠN 4: SỰ THUẦN DƯỠNG

Khi chuyển từ invitro ra nhà lưới hoặc điều kiện ngoài đồng cần chú ý tình trạng cây con và điều kiện môi trường bên ngoài của nơi thuần dưỡng

MẪU CẤY

MỞ ĐẦU

 Vi nhân giống là sự nuôi cấy vô trùng các bộ phận,

cơ quan, mô … trong môi trường nuôi cấy được xác định.

 Trong các phương pháp nhân giống vô tính, cấy mô cho hệ số nhân nhanh và hiệu quả kinh tế cao nhất.

 Mẫu cấy đóng vai trò quan trọng là một trong các bước cơ bản của vi nhân giống.

NỘI DUNG

1 Nguyên lý vi nhân giống:

3 Mẫu nuôi cấy

Có thể lấy từ nhiều bộ phận trên cây mẹ:

Vị trí trên cây có thể được lấy mẫu để nuôi cấy

Mẫu cấy từ mắt

Khử trùng mẫu cấy

* Phẩm chất của mẫu cấy

 Mẫu cấy lấy ở trên mặt đất thì sạch hơn dưới đất.

 Mẫu nuôi cấy càng nhỏ càng ít nhiễm bệnh.

 Mô bên trong ít nhiễm hơn mô bên ngoài.

* Tuổi của mẫu nuôi cấy tùy thuộc vào tuổi của cành được lấy mẫu:

phía trên

phía trên

Tuổi của mẫu nuôi cấy

* Ảnh hưởng của vị trí trên cây mẹ

Lấy mẫu cấy tùy thuộc vào dạng kiểu cành:

 Topophysis: các phản ứng sinh lý ở các vị trí khác nhau.

 Cyclophysis: các phản ứng sinh lý do tuổi.

 Periphysis: các phần có cùng tuổi và cùng vị trí

mà chịu ảnh hưởng của các điều kiện vật lý khác.

Ảnh hưởng của vị trí trên cây mẹ

Các phân sinh mô có khoảng cách xa chồi và rễ thì càng già

AB>AC>AD>AE>AF B: già nhất, F: non nhất

KẾT LUẬN

 Phẩm chất của mẫu cấy sẽ quyết định sự thành công của mẫu vật nuôi cấy vào môi trường.

 Mẫu cấy càng non sự thành công càng lớn.

 Tạo được cây sạch bệnh.

YẾU TỐ NGOẠI CẢNH ẢNH HƯỞNG

LÊN QUÁ TRÌNH NUÔI CẤY MÔ

MỞ ĐẦU

Ánh sáng

Nhiệt độ

Ẩm độ

ÁNH SÁNG

Cường độ ánh sáng

- Giai đoạn tạp dưỡng cây con: 30 µmol.m-2s-1

- Mô tự dưỡng: 65-250 µmol.m-2s-1

- Nhà kín: 100-1500 µmol.m-2s-1

- Cây chuyển từ giai đoạn dị dưỡng sang tự dưỡng: 3000-10000 lux

Quang kỳ

- Đa số sử dụng chế độ ngày dài (16 giờ chiếu sáng).

- Tạo mô sẹo cần điều kiện tối.

- Sự tạo rễ không cần ánh sáng.

- Tạo phôi soma một số loài cần điều kiện tối.

Hệ thống chiếu sáng

NHIỆT ĐỘ

Nhiệt độ đặc trưng cho mô

Temperature (C) 15 20 25 30 35

-Olive embryo growth

Grape leaf culture

Peach shoot tips

Ảnh hưởng của nhiệt độ trên Citrus callus

0 0.5 1 1.5 2

Nhiệt độ cho rễ

Species where rooting better at warmer temperatures

Nhiệt độ tối ưu của các giai đoạn sinh trưởng

trong nuôi cây mô

Hình thành và duy trì huyền phù của

Tạo mô sẹo và sự tăng trưởng của tế

ẨM ĐỘ

- Biên độ ẩm độ của phòng được điều chỉnh từ 20-93± 3%.

- Khoảng trống bên trên bình chứa mẫu thường bão hòa nước.

- Ẩm độ tương đối trong bình có thể điều chỉnh bằng nồng độ agar, làm lạnh ở đáy bình hoặc làm cho bình thông thoáng

Ẩm độ và khí khổng

Effects of humidity on Rose stomates

Ánh sáng, nhiệt độ và ẩm độ tối ưu cho một số loài thực vật

Quang kỳ (giờ/ngày)

Cường độ ánh sáng (lux)

Nhiệt độ (°C)

Ẩm độ (%)

Nuôi cấy đỉnh sinh

Tạo mô sẹo và tạo phôi

TÓM LẠI

- Các yếu tố ngoại cảnh có thể ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp lên sự sinh trưởng phát triển của mô nuôi cấy.

- Tùy vào từng loài và từng giai đoạn sinh

trưởng phát triển của mô cần tối ưu hóa các yếu tố ngọai cảnh khác nhau.

Các ch t i u hòa sinh ấ đ ề

- Kích thích quá trình t o r Kích thích quá trình t o r ạ ễ ạ ễ

Cytokinin -Kích thích s thành l p ch i và c quanKích thích s thành l p ch i và c quanựự ậậ ồồ ơơ

Abscisic acid - T o phôi vô tính(somatic embryogenesis) và bi n đ i - T o phôi vô tính(somatic embryogenesis) và bi n đ i phôi thành cây conạạ ế ổế ổEthylene Ng n c n s sinh tr ng và phát tri n c a mô c y Ng n c n s sinh tr ng và phát tri n c a mô c y ăă ả ựả ự ưởưở ểể ủủ ấấ

Nguyễn Bảo Toàn, PhD, Nhân giống vô tính