Giải trình tự gen thế hệ mới và ứng dụng chuẩn đoán bệnh

Nối với các adaptor in vitro Giải trình tự cyclic array >106 đầu đọc/array Hình thành polony array Giải trình tự chu kì... Ilumina sequencing Tiến trình: Chuẩn bị thư viện DNA Khuếch đại

T H S N G U Y Ễ N T H Á I Q U Ỳ N H A N H

0 4 / 2 0 1 4

Giải trình tự gen thế hệ mới

và ứng dụng chuẩn đoán bệnh

Giải mã bộ gen người

2

2010: 5K$,

vài ngày?

2009: Illumina, Helicos

Chiến lược chung

5

5

ACGTG GTAA CGTATA CAC TAG GC CATA

GTAATGG CG CAC CCT TAG

TGG CGTATA CATA …

ACGTG GTAATGG CGTATA CAC CCT TAG GC CATA

Những đoạn DNA ngắn

AC GC TT TC CG CA AC GC

TG GT TC CC

GA GC TG AC CT TG

GT GC AC GC AC GC AT AT

TT CC AA GC

Trình tự DNA ngắn

ACGTGACCGGTACTGGTAACGTACA CCTACGTGACCGGTACTGGTAACGT ACGCCTACGTGACCGGTACTGGTAA CGTATACACGTGACCGGTACTGGTA ACGTACACCTACGTGACCGGTACTG GTAACGTACGCCTACGTGACCGGTA CTGGTAACGTATACCTCT

Trình tự genome

Genome

Phương pháp của Sanger (1977)

Nối với các adaptor in vitro

Giải trình tự cyclic array

>106 đầu đọc/array) Hình thành polony array Giải trình tự chu kì

454 sequensing/Roche

Tiến trình: Chuẩn bị thư viện DNA Emulsion PCR Pyrosequencing

Emulsion PCR

1 Biến tính mảnh DNA

2 Bám dính: MỘT mảnh DNA (ngược) với adaptor trên bead

đường DNA

5 Bám dính: mạch ngược bám lên bead, primer bám lên mạch xuôi

6 Kéo dài: polymerase khuếch đại mạch xuôi

từ hạt bead đến primersite; và mạch ngược từ primer đến bead

7 Lặp lại 4-5-6 (30 -60 chu kì)

Ưu điểm Khuyết điểm

 Chiều dài đọc 400 base

(độ chính xác 99% tại

base thứ 400 và cao hơn

ở các base phía trước)

 Công nghệ cao so với

Sanger sequencing

 Không cần lặp lại cloning

 Thư viện DNA có thể

được mã hóa và tách

riêng trong suốt quá

trình phâ tích kết quả

 Khó phân tích các homopolymer

 Chi phí cao => hạn chế re-sequencing so với SOLID sequencing

Ilumina sequencing

Tiến trình: Chuẩn bị thư viện DNA Khuếch đại bắt cầu Giải trình tự đầu ngược (reversible termination)

Khuếch đại bắt cầu và giải trình tự bằng sinh tổng hợp

Kéo dài bởi Phusion

DNA Polymerase

Khuếch đại bắt cầu

x 35 chu kì

Giải trình tự bằng sinh tổng hợp

Cắt periodate của một của những oligo

Terminal transferase

bổ sung ddNTP blocker

Polony PCR

Solid sequencing

Tiến trình: Chuẩn bị thư viện DNA Emulsion/Wildfire PCR Giải trình tự ligation

Wildfire PCR

26

Sequencing: Fluorescently Labeled

Nucleotides (ABI SOLiD)

Complementary strand elongation: DNA Ligase

27

Sequencing: Fluorescently Labeled

Nucleotides (ABI SOLiD)

5 reading frames, each position is read twice

Helicos single molecule

sequencer

Ion Torrent next generation Sequencer

Pacific Bioscience single molecule sequencer

Oxford nanopore technology

2009

2011

2011

2012

Helicos sequecing

Next next generation sequencing

Cost (1mbp)* Sanger ~800bp Sanger 400kbp 500$

1 Giải trình tự gene hay bộ gen cho các nghiên cứu có liên

quan

2 Phát hiện các đột biến gene (liên quan đến ung thư, kháng

thuốc), các SNP (trong cá nhân hóa các liệu pháp điều trị), các kiểu gene (genotype của virus gây bệnh)…

3 Định danh vi khuẩn hay vi nấm dựa trên giải trình tự DNA

của gene qui định RNA của ribosome (16S của vi khuẩn và 28S của vi nấm) đặc biệt là các tác nhân khó định danh hay thất bại nuôi cấy từ mẫu thử

4 Phân tích đoạn xét nghiệm dấu vân tay DNA (DNA finger

printing) để nhận dạng cá nhân và mối quan hệ cá nhân (pháp y), trong chẩn đoán tiền sanh, trong phát hiện đa dạng loài…

Qui trình chuẩn đoán gen IX factor

gây bệnh hemophilia B

 Bệnh di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể

giới tính X, gây ra do đột biến gen yếu tố

IX

 Đột biến điểm nằm rải rác khắp chiều dài

của gen, chủ yếu ở nam do có 1 NST X

 Chuẩn đoán được đột biến gen yếu tố IX ở

bệnh nhân là nền tảng để phát hiện kiểu

gen dị hợp tử của người nữ

=> chuẩn đoán tiền sinh, phát hiện thai nhi

mắc bệnh

 Gen FIX (8 exon, 7 intron) thiết kế primer cho các vùng promoter, exon, vùng polyA của gen FIX

 DNA máu ngoại vi

 PCR=> giải trình tự từng đoạn

Đột biến T thành C => thay đổi acid amin 23 Leucin thành Prolin

Xác định khả năng gây bệnh của bất thường T >C ở gen FIX làm thay Leucin > Prolin bằng phần mền polyphene2

Khả năng gây bệnh của bất thường cao 0.98/1, độ nhạy 0.74, độ đặc hiệu 0.96

Xuất hiện 2 đỉnh tại vị trí c68 tương

ứng với T và C => mang kiểu gen dị

hợp, 1 allen bình thường nucleotide T

và 1 allen đột biến nucleotide C

Xuất hiện 1 đỉnh tại vị trí c68 tương ứng với T => mang kiểu gen 2 allen bình thường nucleotide T

 Chuẩn đoán, xác định genotype HCV: vùng 5’NC => xác định nguồn gốc nhiễm trùng

 Phát hiện đột biến kháng thuốc HBV (lamivudine): đoạn 550 bp trên gen preS => 204, 204 + 207, 204+180, 204+207+180

 Giải trình tự phát hiện đột biến promoter

Định danh vi khuẩn

T thermophilus 16S

Nuôi cấy vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm

Thu nhận dich đun sôi của vi khuẩn

Primer 16-F và 16-R chứa trình tự đặt hiệu loài trên vi khuẩn (527bp) PCR – điện di – tinh sạch => giải trình tự

NCBI

 Tình trạng phân hủy của mẫu mitDNA sequencing

 Mẫu DNA cổ đại: gấu hang động, mamut, Neanderthal (106 bp )

Trở ngại: nhiễm DNA của con người hiện đại và bacteria

 Công cụ nhạy cảm nhất để có thể phát hiện các đột biến cho dù tỷ lệ đột biến hiện diện trong mẫu thử là rất thấp

 Chẩn đoán tiền sanh phát hiện dị bội của thai nhi bằng phân tích DNA của bào thai hiện diện trong máu mẹ dựa trên ưu điểm độ nhạy cao của kỹ thuật

Photo by Douglas Macdonald Jeju Olle Trail -Korea

THANK-YOU!