Nghiên cứu sinh tổng hợp và thu nhập poly y glutamic axit và hướng ứng dụng trong thực phẩm

MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Khoa học công nghệ ứng dụng đời sống ngày quan tâm giới nói chung Việt Nam nói riêng Những ứng dụng khoa học công nghệ vào sống ngày thể quan trọng lĩnh vực Các hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên dần thay hợp chất có nguồn gốc hóa học Sự phát triển công nghệ sinh học giúp xã hội phát triển theo hướng thích ứng với tự nhiên, trình tổng hợp hợp chất tự nhiên từ vi sinh vật điểm đến nhà nghiên cứu Các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên thu nhận từ vi sinh vật nhờ việc tổng hợp từ chu trình sống chúng So với hợp chất tổng hợp đường hóa học, tổng hợp phương pháp sinh học có ưu điểm vượt trội như: an toàn cho sức khỏe người, thân thiện với môi trường có tính chất bền vững Axit poly γ-glutamic (γ-PGA) có tính chất polyme, tạo cách sử dụng axit glutamic thông qua phương thức tổng hợp hóa học để tạo ra, cách thứ hai sử dụng vi sinh vật có khả tổng hợp polyme từ trình sinh trưởng phát triển vi sinh vật Bản chất polyme có khả phân hủy, không độc với người, tự nhiên nên γ-PGA nghiên cứu ứng dụng nhiều lĩnh vực.Trong ngành công nghiệp xử lý môi trường γ-PGA sử dụng làm chất kết tụ, hỗ trợ trình lắng, thay dần chất kết tụ có nguồn gốc hóa học Trong công nghiệp sản xuất thực phẩm γ-PGA sử dụng dạng phụ gia ổn định chất lượng sản phẩm, y dược γ-PGA dùng chất mang, chất giữ ẩm Theo số tài liệu nghiên cứu cho thấy vi khuẩn Bacillus có khả sinh tổng hợp γ-PGA sản phẩm nước mà phân lập từ sản phẩm thực phẩm truyền thống Việt Nam Tương Bần, Tương Nam Đàn, Nước Mắm, Chao… Từ thực trạng nghiên cứu γ-PGA sản xuất ứng dụng Việt Nam cho thấy cần có nghiên cứu rộng tính chất ưu việt vi khuẩn Bacillus sản phẩm vi khuẩn tạo Hơn việc tạo sản phẩm có nguồn gốc từ trình lên men xu hướng phát triển, tính an toàn, khả ứng dụng cao, ảnh hưởng đến môi trường sống Để đáp ứng nhu cầu đề tài “Nghiên cứu sinh tổng hợp thu nhận axit poly γ glutamic hướng ứng dụng thực phẩm” đời nhằm khai thác những điểm mạnh vi khuẩn Bacillus tạo sản phẩm đáp ứng nhu cầu thiết xã hội Mục tiêu nghiên cứu luận án:  Nghiên cứu công nghệ sản xuất axit poly γ glutamic từ vi sinh vật  Ứng dụng chế phẩm axit poly γ glutamic vào sản phẩm thực phẩm Nội dung nghiên cứu gồm  Phân lập, tuyển chọn định danh chủng vi sinh vật có khả sinh tổng hợp γ-PGA từ sản phẩm thực phẩm lên men truyền thống  Khảo sát tối ưu điều kiện nuôi cấy cho chủng lựa chọn để thích hợp sinh tổng hợp axit poly γ glutamic  Tinh sạch, thu nhận khảo sát đặc điểm axit poly γ glutamic  Bước đầu ứng dụng thử nghiệm axit poly γ glutamic vào số sản phẩm thực phẩm Những đóng góp luận án  Luận án nghiên cứu cách có hệ thống công nghệ thu nhận axit poly γ glutamic từ việc phân lập, tuyển chọn chủng giống vi sinh vật, tối ưu hóa điều kiện nuôi vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA, tách, tinh sạch, thu nhận đến việc xác định cấu trúc đặc tính γ-PGA  Bước đầu ứng dụng có hiệu γ-PGA việc ổn định trạng thái, màu sắc, hương vị nước cam chế biến bảo quản, cải thiện độ giòn, dai, màu sắc sản xuất giò  Bố cục luận án: Luận án gồm 120 trang với 36 bảng số liệu 53 hình 130 tài liệu tham khảo nước; đó: Mở đầu (2 trang); Chương Tổng quan (37 trang), Chương Vật liệu phương pháp nghiên cứu (11 trang), Chương Kết thảo luận (58 trang), Chương Kết luận (1 trang), Danh mục công trình nghiên cứu với báo công bố (1 trang), Tài liệu tham khảo (10 trang) Chương TỔNG QUAN Phần tổng quan tài liệu tổng hợp nghiên cứu nước nước đề cập đến vấn đề sau: 1.1 Giới thiệu axit poly gamma glutamic 1.2 Tình hình nghiên cứu γ-PGA giới Việt Nam 1.2.1 Tình hình nghiên cứu γ-PGA giới 1.2.2 Tình hình nghiên cứu γ-PGA Việt Nam 1.3 Cơ chế sinh tổng hợp γ-PGA 1.4 Tính chất γ-PGA 1.5 Phân loại γ-PGA 1.6 Hệ vi khuẩn sinh tổng hợp γ-PGA 1.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp γ-PGA 1.7.1 Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng 1.7.2 Ảnh hưởng yếu tố ngoại cảnh đến trình lên men 1.7.3 Phương pháp lên men γ-PGA 1.8 Xác định đánh giá chất lượng γ-PGA 1.8.1 Định tính định lượng γ-PGA 1.8.2 Thu nhận tinh γ-PGA 1.8.3 Đánh giá cấu trúc khối lượng phân tử γ-PGA 1.8.4 Xác định khối lượng phân tử γ-PGA 1.9 Ứng dụng γ-PGA 1.9.1 Trong lĩnh vực môi trường 1.9.2 Trong lĩnh vực y dược 1.9.3 Trong lĩnh vực nông nghiệp 1.9.4 Trong lĩnh vực công nghiệp thực phẩm Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 2.1.1 Nguồn phân lập: tương Bần, tương Nam Đàn, chao Đại Bình Dương, mắm Rươi Tứ Kỳ, Natto - Nhật Bản Thua Nao -Thái 2.1.2 Hóa chất: Agarrose (Merck), ethidium bromide, PCR buffer (BioLabs), dNTP (BioLabs), Taq polymerase (BioLabs), kit tinh sản phẩm PCR (Promega), cặp mồi đọc trình tự 16SF 16SR (Invitrogen), marker protein (hãng Sigma) 2.1.3 Môi trường nuôi cấy: môi trường LB đặc hiệu E 2.1.4 Dụng cụ thiết bị: Máy đo mật độ quang - Ultrospec 2000 uv/vis (Pharmacia Biotech); Máy li tâm lạnh -Avanti TM 30 Centifuge Beckman (Đức); Máy đo cấu trúc - Texture Analyser TA.XT Plus (Đức); Máy đo phổ hồng ngoại Nicole 6700 FT-IR (Đức); Thiết bị lên men phòng thí nghiệm BioTron (Hàn Quốc) 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp vi sinh sinh học phân tử: sử dụng kit API 50CHB (BioMérieux, Pháp) giải trình tự gen 16S rRNA 2.2.2 Khảo sát, đánh giá yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp γ-PGA theo phương pháp đơn yếu tố 2.2.3 Phương pháp toán học - tối ưu điều kiện nuôi cấy theo quy hoạch thực nghiệm - Box-Behnken với phần mềm Desgin Expert 2.2.4 Phương pháp phân tích hóa lý, hóa sinh: Đo quang, HPLC, GPC, SDS-PAGE, đo độ quay cực, đo huyền phù Krop 2.2.5 Phương pháp đánh giá cảm quan 2.2.6 Nghiên cứu đánh giá mức độ ảnh hưởng γ-PGA đến chất lượng giò lụa phương pháp đo lực nén, lực cắt cường lực gel Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập tuyển chọn vi khuẩn có khả sinh tổng hợp Poly γ-glutamic Từ mẫu, phân lập môi trường thạch LB, sau quan sát hình thái khuẩn lạc, hình thái vi khuẩn, kết sau thu 27 chủng vi khuẩn tổng số 40 chủng vi sinh vật qua phương pháp hình thái, nhuộm bào tử, nhuộm gram Tiến hành nuôi cấy 27 chủng vi khuẩn môi trường đặc hiệu, thu chủng phân lập chủng có khả phát triển mạnh môi trường đặc hiệu sau 72 h nuôi cấy Từ chủng thu thông qua nuôi cấy môi trường đặc hiệu E, cho thấy hai chủng B5 T1 hai chủng tạo độ nhớt lớn từ 5,2 – 5,3cp Hình 3.1 Sự tạo màng chủng vi khuẩn môi trường đặc hiệu Phương pháp sử dụng độ nhớt để đánh giá khả sinh tổng hợp γ-PGA chủng mang tính chất định tính, nhiều nghiên cứu sử dụng thước đo γ-PGA Tuy chưa thể kết luận có γ-PGA thành phần dịch nhớt, để chứng minh dịch nhớt có γ-PGA, tiến hành kết tủa phần dịch nhớt thủy phân kết tủa HCL 6N, dịch sau thủy phân đem thẩm tách loại muối chạy sắc ký mỏng dịch sau thẩm tích với mẫu chuẩn axit glutamic chất hiển thị màu ninhydrin Kết cho thấy băng chạy dịch nhớt sau thủy phân từ chủng B5 xuất vết vị trí tương đương với vết axit glutamic chuẩn Điều chứng tỏ dịch nhớt canh trường lên men có chứa γ-PGA Để đánh giá xác khả sinh γ-PGA, chủng tạo màng lần đem nuôi môi trường đặc hiệu thu nhận sau 24 h Đem xử lý định lượng γ-PGA đo phổ hấp thụ quang vùng tử ngoại Nghiên cứu cho thấy cho thấy hàm lượng γ-PGA tạo thành cao hai chủng B5 T1 với giá trị 5,564 g/l 5,041 g/l sau 96h nuôi cấy khả sinh γ-PGA mạnh thời điểm 96h chủng phân lập Dựa kết đo độ nhớt, đo hàm lượng γ-PGA phương pháp phổ tử ngoại đặc điểm hình thái thấy hai chủng vi khuẩn có mã hiệu B5 T1 có khả sinh tổng hợp γ-PGA lớn số chủng vi khuẩn phân lập Trên sở lựa chọn hai chủng vi khuẩn B5 T1 để nghiên cứu sinh tổng hợp γPGA 3.2 Định danh chủng vi khuẩn sinh γ-PGA 3.2.1 Định danh theo đặc điểm hình thái kết hợp với sử dụng kit API 50CHB Dựa vào kết phân loại theo đặc tính: hình thái khuẩn lạc, tế bào, khả sinh bào tử, khả nhuộm Gram, nhu cầu oxy, ảnh hưởng pH, nồng độ muối Đánh giá khả sử dụng loại đường chủng với Kit API 50 CHB đối chiếu với phần mềm nhận dạng API PLUS để đánh giá thu kết bảng 3.6 Bảng 3.6 Kết sử dụng carbon vi khuẩn B5 T1 Kit API 50 CHB Khả Khả sử sử dụng dụng TT Phép thử TT Phép thử B5 T1 B5 T1 Đối chứng 25 Esculin + + Glycerol + + 26 Salixin + + Erythritol 27 Xelobiose + + D-Arabinose 28 Mantose + + L-Arabinose + + 29 Lactose + + Ribose + + 30 Melibiose + D-Xylose + 31 Saccarose + + L-Xylose 32 Trehalose + + Adonitol 33 Inulin -Metyl-D9 34 Melezitose Glucozit 10 Galactose 35 Rafinose + + 11 Glucose + + 36 Tinh bột + + 12 Fructose + + 37 Glycogen + + 13 Manose + + 38 Xylitol 14 Sorbose 39 Gentiobiose + + 15 Rhamnose 40 D-Turanose + 16 Dulxitol - - 41 D-Lyxose - - 17 18 19 Inozitol Mannitol Sorbitol -Metyl-DManozit -Metyl-DGlucozit N-AcetylGlucosamin Amygdalin Arbutin + + + + + + 42 43 44 D-TAgartose D-Fucose L-Fucose - - - - 45 D-Arabitol - - + + 46 L-Arabitol - - - + 47 D-TAgartose - - 20 21 22 23 24 + 48 2-ketogluconat + + 49 5-ketogluconat (+): Phản ứng dương tính (-): Phản ứng âm tính Sau kết hợp việc đánh giá dựa đặc điểm sinh lý, sinh hóa phần mềm API PLUS cho thấy chủng vi khuẩn B5 có độ tương đồng với B subtilis 98% độ tương đồng vi khuẩn T1 với loài B subtilis 73% 3.2.2 Định tên phương pháp sinh học phân tử: Trình tự đoạn gen giải trình tự hệ thống máy ABI 3103XL, xác định đoạn gen 16S rRNA chủng B5 có 1250 bp T1 1516bp (phụ lục) Phân tích mối quan hệ phát sinh loài tiến hành dựa thuật toán Maximum Likelihood, sử dụng phần mềm Phylogeny với liệu ngân hàng gen NBCI, cho thấy chủng vi sinh vật B5 T1 có quan hệ gần (98-99%) với loài B subtilis Hình 3.6 Cây phát sinh chủng (B5) dựa trình tự gen mã hóa 16S rRNA Kết định danh hai phương pháp hóa sinh phương pháp sinh học phân tử cho thấy chủng vi khuẩn B5 chủng vi khuẩn có độ tương đồng 98-99% với B Subtilis BA-71 Từ kết trên, luận án đề xuất định tên cho chủng vi khuẩn Bacillus subtilis B5 Đối với chủng T1 sau định danh phương pháp hóa sinh cho thấy có độ tương đồng là 73% phương pháp sinh học phân tử cho kết có độ tương đồng với B subtilis C-3-9 (9899%) nên chưa thể kết luận chủng T1 thuộc loài B subtilis 3.3 Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp γ-PGA 3.3.1.Nghiên cứu tiền chất thích hợp cho sinh tổng hợp γ-PGA Những nghiên cứu sinh tổng hợp γ-PGA cho thấy tiền chất để tạo thành γ-PGA chủ yếu hợp chất glutamic, glutamat hay bột đậu tương Việc bổ sung đậu tương dạng bột vào canh trường lên men không làm tăng lượng γ-PGA, bổ sung đậu tương gây ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng vi khuẩn, ảnh hưởng đến hình thành γ-PGA Trong môi trường có chứa natri glutamat, hàm lượng γ-PGA tạo thành cao môi trường có chứa glutamic Như sử dụng natri glutamat làm nguồn tiền chất trình tạo γ-PGA thay cho axit glutamic toàn trình nghiên cứu 3.3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ B subtilis loài vi khuẩn ưa ấm có khả sinh trưởng phát triển tốt dải nhiệt độ từ 30oC đến 45oC Để tìm chế độ nhiệt thích hợp cho sinh tổng hợp γ-PGA, tiến hành sử dụng môi trường nghiên cứu có natri glutamat, điều kiện nuôi tĩnh, lên men nhiệt độ 30oC; 35oC; 40oC 45oC 50oC để nuôi cấy, thu nhận kết 24h lần, kết thúc trình lên men sau thời gian 120h Kết nghiên cứu thể qua đồ thị hình 3.9 Kết nghiên cứu cho thấy chủng B subtilis B5 có khả sinh tổng hợp γ-PGA cao nhiệt độ 40oC, tạo γ-PGA đạt giá trị lớn 9,07 g/l thời điểm 96h lên men 3.3.3.Ảnh hưởng tốc độ lắc Tốc độ lắc trình lên men khảo sát tốc đô từ – 200 v/p, tốc độ lắc thông số đánh giá mức độ cung cấp khí cho môi trường lên men Hình 3.9 Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình sinh tổng hợp γ-PGA Hình 3.10 Ảnh hưởng tốc độ lắc đến trình sinh tổng hợp γ-PGA Kết biểu diễn hình 3.10 cho thấy: lượng γ-PGA đạt giá trị lớn tốc độ v/p (10,36 g/l ), tốc độ lắc cao xu hướng hình thành γ-PGA giảm Đối với mẫu nuôi tĩnh không tạo áp lực tác động lên lớp vỏ tế bào, nên hình thành γ-PGA không bị ảnh hưởng, việc cung cấp oxy hòa tan cho môi trường lên men bình tam giác mẫu thí nghiệm vừa đủ để vi khuẩn sinh trưởng tổng hợp γ-PGA Do vậy, phương án nuôi tĩnh lựa chọn cho trình nghiên cứu quy mô thí nghiệm 3.3.4 Ảnh hưởng pH Nghiên cứu ảnh hưởng pH môi trường tới chủng B subtilis B5, tiến hành khảo sát giá trị pH từ – Kết cho thấy ảnh hưởng pH đến phát triển sinh trưởng vi khuẩn B subtilis B5 thể rõ giá trị pH = pH =9, khả sinh tổng hợp γ-PGA hầu không thấy Sự hình thành γ-PGA tăng mạnh khoảng pH từ đến thời gian 96h Giá trị γ-PGA cao (13,03 g/l) thời điểm 96h môi trường có pH = 3.3.5 Ảnh hưởng nguồn carbon đến khả sinh tổng hợp γ-PGA Nguồn carbon phần cốt lõi để tạo lên khung tế bào vi sinh vật giúp sinh trưởng, phát triển, sinh tổng hợp γ-PGA, nguồn carbon phù hợp giúp phát triển vi khuẩn Bacillus subtilis B5 phát triển tốt, tạo tiền đề cho sinh tổng hợp γ-PGA Sau nghiên cứu lựa chọn nguồn carbon lactose, glucose, saccarose axit citric, lựa chọn nguồn carbon sử dụng axit citric nồng độ 1,5% (15g/l) làm thông số cho trình nghiên cứu 3.3.6 Ảnh hưởng nguồn Nitơ Khảo sát ảnh hưởng nguồn nitơ đến trình sinh tổng hợp γPGA với nguồn nitơ thông dụng rẻ tiền NH4Cl, cao nấm men, NH4NO3, kết trình sinh tổng hợp γ-PGA đạt nồng độ cao 13,5 g/l sử dụng nguồn nitơ NH4NO3 Hình 3.13 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến hình thành γ-PGA Như trình sinh tổng hợp γ-PGA sử dụng NH4NO3 làm nguồn nitơ cho trình tổng hợp γ-PGA, thay nguồn nitơ dùng môi trường E NH4Cl 3.3.7 Ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống Tỷ lệ cấp giống yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men Tỷ lệ cấp giống cao hay ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp Nghiên cứu với tỷ lệ cấp giống đến trình lên men dao động khoảng 1% đến 15% với thời gian lên men 96h cho thấy: Lượng giống cấp với tỷ lệ 5% cho lượng γPGA lớn 16,48 g/l, hai tỷ lệ cấp giống 1% 15% lượng γPGA tạo thành nhỏ dao động khoảng g/l Vì tỷ lệ cấp giống 5% lựa chọn làm thông số cho nghiên cứu 3.3.8 Ảnh hưởng nồng độ natri-glutamat Các nghiên cứu việc thay L-glutamic nồng độ 20 g/l natri glutamat nồng độ 20 g/l Sau thay đổi điều kiện, môi trường, chế độ nuôi cấy, nồng độ γ-PGA tạo thành có phần cải thiện Để tạo điều kiện cho hình thành γ-PGA cực đại với nguồn tiền chất mới, nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ tiền chất đến lượng γ-PGA hình thành cho thấy với nguồn tiền chất Natri – Glutamat với nồng độ 25 g/l tạo nên lượng γ-PGA cao sử dụng natri – glutamat nồng độ 20g/l tạo thành γ-PGA = 20,5 g/l 3.4 Tối ưu điều kiện ảnh hưởng đến sinh tổng hợp γ-PGA Dựa vào số liệu khảo sát ảnh hưởng yếu tố nhiệt độ, thời gian, nồng độ tìền chất, pH, nguồn carbon, tỷ lệ cấp giống nghiên cứu tối ưu hóa yếu tố ảnh hưởng đến hình thành γ-PGA Theo nguyên tắc ma trận Box – Behnken, ta tiến hành 29 thí nghiệm với thay đổi đồng thời bốn yếu tố quanh giá trị trung bình Từ phân tích phương sai, phần mềm đưa phương trình hồi quy theo giá trị thực mô hình nghiên cứu sau: Hàm lượng γ- PGA = - 2356,079 + 49,003X1 + 0,267X2 1,375X3 – 0,022X1X2 + 0,055X2X3 - 0,542X1X2 - 0,009X2X2 0,115X3X2 – 21,617X4X2 X1, X2, X3 X4 yếu tố nhiệt độ, thời gian, tiền chất pH yếu tố ảnh hưởng nhiều đến trình sinh tổng hợp γ-PGA sau khảo sát qua số thí nghiệm Giá trị chuẩn Fisher (F) 24,70 mô hình hoàn toàn có ý nghĩa với độ tin cậy 99,99% (p 0,05) điều có nghĩa mô hình tương thích với thực nghiệm Đánh giá dựa giá trị hệ số xác định bội (R-square) hệ số xác định bội hiệu chỉnh (Adj R-square), hai thông số đặc trưng cho mức độ phù hợp mô hình việc giải thích thí nghiệm Trong nghiên cứu giá trị R-square = 0,9611 Adj Rsquare = 0,9222 > 0,9 điều chứng tỏ mô hình lựa chọn phù hợp để giải thích kết nghiên cứu thí nghiệm Mô hình cho thấy tương quan yếu tố: nhiệt độ - thời gian; nhiệt độ - tiền chất, ảnh hưởng nhiều đến trình sinh tổng hợp γ-PGA Hình 3.16 Biểu đồ bề mặt đáp ứng thời gian nhiệt độ thay đổi Hình 3.17 Biểu đồ bề mặt đáp ứng nhiệt độ tiền chất thay đổi Tối ưu hóa mô hình nghiên cứu Hai 12 phương án tối ưu lý thuyết lựa chọn sau: Phương án 1: Nếu xét góc độ tính toán để tối ưu hàm lượng γ-PGA hay nói cách khác đặt mức độ quan trọng tiêu đến mức cao nhất, phần mềm cho phương án sau thời gian 115,97 giờ, điều kiện pH ban đầu 8,04 hàm lượng tiền chất 30 g/l nhiệt độ nuôi 39,41oC, thu nồng độ γ-PGA cao 26,40 g/l phương án có giá trị mong đợi (Desirability) 0,978 Dựa kết tối ưu tiến hành thực nghiệm kiểm chứng nhiệt độ 39,5oC, pH = 8, nồng độ tiền chất 30g/l với điều kiện khác tương tự sau 116 nuôi cấy nồng độ γ-PGA thu 26,04 g/l Phương án 2: Nếu xét tính tối ưu để áp dụng sản xuất quy mô lớn, cần phải xem xét yếu tố thời gian ngắn, đầu vào nguyên liệu thấp, cho sản lượng tối ưu, tiến hành đặt mức độ quan trọng thời gian, tiền chất lên mức độ quan trọng nhất, sản lượng γ-PGA mức khá, nhiệt độ mức trung bình giá trị 11 ảnh hưởng pH mức độ vừa phải Sau chạy phần mềm tối ưu ta thông số nhiệt độ = 39,74oC; thời gian thu nhận 97,02 giờ; nồng độ tiền chất 25 g/l pH=8,0 hàm lượng theo phần mềm tính tinh toán 23,71 g/l phương án đạt giá trị mong đợi 1,000 Dựa kết tính toán lý thuyết, tiến hành thực nghiệm kiểm chứng với thông số nhiệt độ 40oC, pH = nồng độ tiền chất = 25 g/l sau thời gian 97 thu nhận γ-PGA có nồng độ 25,02 g/l cao với tính toán lý thuyết 1,31 g/l So sánh hai phương án đưa theo tối ưu hóa lý thuyết thực nghiệm ta thấy, thời gian chênh lệch phương án 19 (giảm 16%), chênh lệch tiền chất g/l (giảm 16,7%) hàm lượng γPGA thu chênh lệch 1,02 g/l (tăng 3,9%) Như xét góc độ hiệu kinh tế phương án tối ưu phương án Do phương án với thông số nghiên cứu: nhiệt độ 40oC, pH = nồng độ tiền chất = 25 g/l sau thời gian 97 thu nhận γ-PGA = 25,02 g/l phương án chọn cho nghiên cứu sau đề tài 3.5 Nghiên cứu động học trình lên men Trước vào nghiên cứu sinh tổng hợp γ-PGA quy mô pilot (100lít/mẻ) tiến hành nghiên cứu động học trình lên men quy mô phòng thí nghiệm BioTron quy mô 5-7 lít/mẻ, kết biểu diễn hình 3.20: Hình 3.20: Đồ thị biểu diễn động học trình tổng hợp γ-PGA Kết cho thấy, trình sinh trưởng chủng B5 theo giai đoạn Từ đến 24h sinh khối tế bào tăng chậm, giai đoạn chủng B5 thích ứng dần với môi trường lên men, khẳng định pha tiềm phát Giai đoạn từ 24h đến 72h sinh khối tế bào tăng mạnh từ 15,1 đến 54,6 g/l, cho thấy tế bào sinh sản nhanh, chất dinh dưỡng chủ yếu tổng hợp sinh khối Trong khoảng thời 12 gian từ 72h-120h, quần thể vào pha cân bằng, sinh khối tế bào giữ mức ổn định số tế bào chết số tế bào sinh Giai đoạn cuối từ 120h đến 144h sinh khối bào bắt đầu giảm, chứa nhiều chất trao đổi thứ cấp gây ức chế sinh trưởng, môi trường dinh dưỡng dần cạn kiệt Quá trình sinh tổng hợp PGA tăng mạnh từ 72 đến 96h bắt đầu giảm vào cuối pha cân Điều thấy tạo thành sinh khối mạnh sau 48h lên men tạo lượng enzym PGA synthetase lớn làm xúc tác cho trình tổng hợp γ-PGA Trong giai đoạn cuối pha cân phần γ-PGA vi khuẩn sử dụng làm chất dinh dưỡng nên hàm lượng giảm Trong toàn trình sinh trưởng phát triển, giá trị pH môi trường không thay đổi so với giá trị ban đầu 3.6 Nghiên cứu yếu tố ngoại cảnh đến sinh tổng hợp γPGA chủng B5 quy mô 100 lít/mẻ 3.6.1 Ảnh hưởng chế độ khuấy sục khí Đánh giá mức độ phát triển vi sinh vật canh trường cách mật độ quang OD bước sóng 600nm thời gian 96h, kết thể bảng 3.9: Bảng 3.9 Ảnh hưởng khuấy sục khí đến mật độ vi khuẩn (CFU/ml) Chế độ cấp khí 0h 24h 48h 72h 96h γ-PGA (g/l) Tĩnh Khuấy 350 v/p Sục khí 10lít/phút Khuấy 350 v/p + sục khí 10 l/ph 1x106 1x106 1x106 4x106 7x108 8x108 5x108 1x109 2x109 7x103 1x109 1x109 2x102 4x107 5x107 3,8 ±0,02 19,7±0,03 24,1±0,02 1x106 2x109 6x109 1x109 7x107 25,3±0,05 Qua kết bảng 3.9 nhận thấy: nghiên cứu quy mô 100 lít/mẻ, xét góc độ suất cao, nên kết hợp phương pháp khuấy trộn sục khí khả sinh tổng hợp γ-PGA cao so với phương pháp lên men tĩnh, khuấy sục khí 3.6.2 Sự thay đổi hàm lượng oxy hòa tan trình lên men Khảo sát cho thấy nồng độ oxy hòa tan thiết bị lên men giảm mạnh thời gian từ đến 24h nồng độ oxy hòa tan giai đoạn 24 đến 48h thấp, tiêu thụ oxy cho trình sinh 13 trưởng phát triển vi khuẩn làm lượng oxy hòa tan dịch giảm xuống cực tiểu, đồng nghĩa với sinh trưởng vi sinh vật đạt cực đại Sau 48h trình tổng hợp γ-PGA vào giai đoạn tăng trưởng, trình sinh trưởng phát triển vi khuẩn vào giai đoạn suy thoái Sau 72h nồng độ γ-PGA độ nhớt dịch lên men tăng đến giá trị cực đại, kìm hãm phát triển vi khuẩn, gây ức chế phát triển vi khuẩn, oxy sử dụng Trong giai đoạn đơn phân glutamic muối chuyển hóa thành chuỗi polyme γ-PGA 3.7 Nghiên cứu số phương án tinh γ-PGA Quá trình tinh γ-PGA sử dụng để nghiên cứu dựa công bố khoa học nước với phương pháp công bố, phương pháp lựa chọn với mục tiêu chí: 3.7.1 So sánh phương pháp tinh dựa tiêu chí hàm lượng protein carbonhydrat Các mẫu nghiên cứu thu được, tiến hành tinh phương pháp quốc tế công bố, sau kiểm tra hàm lượng protein, carbonhydrate hiệu suất thu hồi sau tinh Thu kết bảng 3.10 sau: Bảng 3.10: Hàm lượng protein carbonhydrat lại sau tinh γ-PGA Hàm lượng Carbonhydrat Hiệu suất Mẫu Protein (µg/g) (%) (µg/g) PP 8,1 6,39 78 PP 8,4 5,75 77 PP 9,6 7,01 73 Dựa qui trình, kết sau tinh lựa chọn phương pháp làm phương pháp tinh cho nghiên cứu sau Nếu sử dụng cách sử dụng nhiều cồn hóa chất gây hại cho thể, môi trường (NaOH, HCl) phương pháp lại 3.7.2 Nghiên cứu đánh giá cảm quan sản phẩm γ-PGA sau tinh Đánh giá cảm quan thông số độ nhớt cho mẫu nghiên cứu thấy phương pháp có sử dụng than hoạt tính celite (đất hoạt tính) hai tác nhân có tác dụng hấp thụ màu hấp thụ mùi 14 sản phẩm nên mùi lạ phương pháp lại Do phương pháp tinh γ-PGA lựa chọn cho nghiên cứu phương pháp sau: Hình 1.4 Quy trình tinh γ-PGA theo phương pháp Ho cộng 3.7.3 Kiểm tra mức độ tinh sản phẩm phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Để đánh giá mức độ tinh sản phẩm, việc kiểm tra protein, carbonhydrat có sản phẩm sau tinh sạch, ta kiểm tra axit amin lại sau trình tinh phương pháp sắc ký lỏng cao áp sản phẩm γ-PGA Kết sắc ký cho thấy có hiển diện axit L-glutamic, có peak nhỏ thể lẫn tạp chất sản phẩm sau thủy phân, hình 3.22 3.7.4 Đánh giá chất lượng sản phẩm tinh qua kính hiển vi điện tử quét Mẫu thô lẫn nhiều tạp chất nên cấu trúc γPGA chưa hiển thị rõ cấu trúc khối, hiển thị nhìn thấy dạng phẳng hai chiều, không làm rõ cấu trúc phân tử γ-PGA mẫu tinh mẫu chuẩn Giữa mẫu tinh mẫu chuẩn thấy rõ nét cấu trúc γ-PGA dạng không gian ba chiều Mẫu tinh thể cụm nhỏ liên kết với thành nhiều đám rời rạc tạo khoảng trống, mẫu 15 chuẩn cụm nhỏ có hình bất định liên kết với nhau, nhiên liên kết chặt chẽ tạo khoảng trống, làm cho cấu trúc nhìn trông mịn liền khối Hình 3.24 Ảnh chụp cấu trúc γ-PGA kính hiển vi điện tử quét độ phóng đại 100.000 lần A-mẫu γ-PGA thô; B- mẫu γ-PGA sau tinh sạch; C- mẫu γ-PGA kiểm chứng 3.7.5 Xác định cấu trúc độ γ-PGA thông qua phổ FT-IR phổ H NMR Các phổ FT-IR H NMR γ-PGA sau tinh thu chủng Bacillus subtilis B5 cho thấy: có thể gốc muối carboxyl (COO- giãn bất đối xứng) mẫu γ-PGA phân tích, phổ thể hình thành liên kết C=O nhiên bị che peak giãn COO- Tiếp đến giải phổ có liên quan đến liên kết nhóm NH; CH3; COO-; γ-CH2; α-CH2 nhóm chức khác γ-PGA Những kết cho thấy kết hợp hai phổ FT –IR phổ H NMR để đánh giá cấu trúc phân tử γ-PGA tương đối giống Hình 3.22 Sắc ký đồ HPLC mẫu γPGA thủy phân thành glutamic Hình 3.27 Phổ H NMR γ-PGA tinh thu chủng B.subtilis B5 3.8 Nghiên cứu số đặc tính γ-PGA 3.8.1 Xác định khối lượng phân tử 16 Nghiên cứu xác định khối lượng phân tử mẫu γ-PGA phương pháp điện di SDS Page mẫu sau tinh cho thấy khối lượng phân tử mẫu sau chạy điện di với marker hiển thị màu chuẩn xác định khối lượng phân tử γPGA lớn 176 kDa Đánh giá khối lượng phân tử trung bình sản phẩm γ-PGA sắc ký lọc gel (GPC) kết sau tính toán dựa peak thu nhận khối lượng phân tử trung bình Mw γ-PGA dao động khoảng từ 158 – 426 Kda Đối chiếu so sánh với nghiên cứu γ-PGA tạo chủng Bacillus subtilis cho thấy thông thường có khối lượng phân tử từ 100 – 1.500 kDa 3.8.2 Tỷ lệ đồng phân D – Glutamic L – Glutamic γPGA Từ γ-PGA tạo thành từ B subtilis B5 sau thủy phân băng axit làm sản phẩm đến độ tinh khiết định, tiến hành đo độ phân cực hỗn hợp đồng phân quang học D L glutamic Sau tinh toán cho thấy tỷ lệ D:L glutamic axit 47,97/52,03 hỗn hợp poly γ glutamic axit sản sinh B subtilis B5 Kết lần khẳng định cho nguồn gốc chủng giống sinh tổng hợp γ-PGA B subtilis 3.8.3 Nghiên cứu tính bền axit γ-PGA Nghiên cứu thử nghiệm ảnh hưởng tính chất γ-PGA môi trường axit citric có nồng độ từ – 30g/l qua việc xác định độ nhớt dịch thử nghiệm để đánh giá mức độ ảnh hưởng nồng độ axit đến chất lượng ổn định sản phẩm γ-PGA nồng độ g/l Bảng 3.14 Ảnh hưởng axit đến tính chất sản phẩm Axit citric (g/l) 10 15 20 25 pH 3,45 2,94 2,74 2,6 2,46 Độ nhớt 4,5 ± 4,0 ± 4,0 ± 3,5 ± 3,0 ± 2,5 ± (cp) 0,04 0,03 0,03 0,02 0,01 0,01 γ-PGA 30 2,38 3,0 ± 0,01 Kết nồng độ axit tăng (độ pH giảm) khả tạo nhớt γ-PGA giảm đi, đến nồng độ axit 20g/l biến đổi độ nhớt thay đổi nhiều Qua khảo sát kết luận sử dụng γ-PGA sản phẩm đồ uống có độ axit cao 3.8.4 Nghiên cứu tính bền nhiệt γ-PGA 17 Để tìm hiểu ảnh hưởng nhiệt độ đến độ nhớt γ-PGA hay tính bền nhiệt, tiến hành nghiên cứu với γ-PGA nồng độ g/l để nhiệt độ 25oC; 50oC; 75oC; 100oC 125oC thời gian 30 phút Hình 3.31 Ảnh hưởng nhiệt độ đến biến đổi độ nhớt dịch γ-PGA Kết nghiên cứu độ nhớt γ-PGA tỷ lệ nghịch với nhiệt độ, bị tác động nhiệt độ cao độ nhớt γ-PGA giảm Mức độ giảm độ nhớt γ-PGA nhỏ khoảng nhiệt độ từ 75-100oC Đây đặc tính ưu việt sử dụng γ-PGA áp dụng cho loại sản phẩm thực tế 3.9 Nghiên cứu hoàn thiện chế phẩm γ-PGA 3.9.1 Nghiên cứu thông số cho sấy phun chế phẩm γ-PGA Sau nghiên cứu thực nghiệm thu kết sấy phun tốt chế phẩm γ-PGA bảng 3.14: Bảng 3.14 Các thông số sấy phun cho chế phẩm γ-PGA Chỉ tiêu Chất trợ sấy: Maltodextrin Nhiệt độ sấy Tốc độ đĩa phun Hiệu suất thu hồi Lưu lượng dịch cấp Đánh giá cảm quan Thông số 5% 160 oC 11.00-12.000 v/ph 85,8 -90,4% lít/h Bột khô, hút ẩm chậm, màu trắng, dễ lấy sau sấy phun Độ hòa tan tốt, không bị vón hòa tan 3.9.2 Đánh giá mức độ an toàn γ-PGA việc sử dụng làm phụ gia thực phẩm Căn theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia (QCVN 421:2011/BYT) phụ gia thực phẩm – với loại phụ gia chất làm dày Căn vào công bố sử dụng γ-PGA sản xuất từ vi khuẩn B 18 subtilis Công ty Ajinomoto công bố đến Cục quản lý thực phẩm dược phẩm Hoa kỳ việc chấp nhận sử dụng γ-PGA từ B subtilis loại phụ gia thực phẩm an toàn Sau áp dụng quy chuẩn kỹ thuật, sản phẩm γ-PGA đem phân tích kiểm nghiệm phòng thí nghiệm đươc nhà nước công nhận Từ kết phân tích số mẫu kiểm tra quan chức năng, sản phẩm γ-PGA Cục vệ sinh An toàn thực phẩm xác nhận công bố phù hợp quy định an toàn thực phẩm cho sản phẩm PGA Liều dùng thấp 0,1% khối lượng sử dụng 3.10 Nghiên cứu ứng dụng γ-PGA ổn định nước cam 3.10.1 Khảo sát chất lượng nguyên liệu Kết khảo sát thể cam nguyên liệu có tỉ lệ vitamin C cao 40mg%, hàm lượng đường tổng số mức 9,0% với hàm lượng axit hữu tổng số 0,6 % Sau đánh giá công thức, tỷ lệ phối trộn nước cam cho thấy với tỷ lệ nước cốt chiếm 30% phù hợp cho trình nghiên cứu 3.10.2 So sánh ảnh hưởng γ-PGA đến độ ổn định nước cam với phụ gia khác 3.10.2.1 Đánh giá ảnh hưởng γ-PGA phụ gia ổn định khác thông qua số huyền phù: Sử dụng γ-PGA loại phụ gia ổn định khác CMC, Xanthan Gum, Agar nồng độ 0,05%, chế biến chế độ công nghệ, sau phối chế, trùng, bảo ôn sau bảo ôn đem phân tích số huyền phù không bền theo phương pháp Krop để đánh giá mức độ phân tách sản phẩm, cho kết đồ thị hình 3.32 Hình 3.32 Biểu đồ so sánh ảnh hưởng γ-PGA phụ gia thường dùng khác việc ổn định cho nước cam 19 Chỉ số huyền phù không bền sử dụng để đánh giá độ ổn định nước cam Nếu số cao đồng nghĩa với chất lượng nước cam ổn định Trước trùng mẫu nước cam có bổ sung CMC có số huyền phù không bền thấp nên độ ổn định cao nhất, độ ổn định mẫu chứa γ-PGA thấp Tuy nhiên, sau trình trùng, độ ổn định nước cam có sử dụng γ-PGA tăng lên rõ rệt cao mẫu chứa CMC Sau trình bảo ôn số huyền phù không bền tất mẫu tăng dần phản ánh độ ổn định giảm mẫu chứa γPGA giữ độ ổn định cao mẫu không bổ sung hóa chất nhiều Hơn nữa, độ ổn định mẫu bổ sung γ-PGA đạt chí vượt so với mẫu bổ sung hai loại phụ gia thông dụng CMC Xanthan gum Do γ-PGA sử dụng làm phụ gia làm ổn định nước cam đầy tiềm năng, giữ cho nước cam trạng thái đồng nhất, không bị lắng cặn, tách lớp 3.10.2.2 Ảnh hưởng γ-PGA phụ gia ổn định nước cam thông qua biến đổi độ nhớt Sự ảnh hưởng chất phụ gia đến chất lượng nước cam chất phụ gia khảo sát cho thấy số độ nhớt mẫu bị giảm sau trình trùng, điều chứng tỏ ảnh hưởng nhiệt độ đến ổn định cấu trúc phụ gia Lý giải cho tượng độ nhớt giảm sau thời gian bảo quan nồng độ axít nước cam ảnh hưởng đến độ bền cấu trúc phân tử phụ gia gây tượng phân cắt mạch làm giảm độ nhớt 3.10.2.3 Ảnh hưởng γ-PGA đến màu sắc sản phẩm nước cam Tổng thể theo mức độ thay đổi màu sắc chung ΔE cho thấy thay đổi màu sắc theo thời gian cho thấy biến đổi nhiều mẫu γ-PGA, mẫu Xanthan Gum mẫu CMC xu hướng biến đổi màu sắc mẫu nước cam màu nhạt đi, thiên màu vàng, mẫu sử dụng Agar mẫu đối chứng màu sắc sản phẩm không thay đổi nhiều, nhiên có xu hướng sẫm màu, chuyển sang màu đen, giảm tính cảm quan sản phẩm 3.10.2.4 Đánh giá tính chất cảm quan sản phẩm nước cam có sử dụng γ-PGA loại phụ gia khác Kết đánh giá cảm quan tiêu chí mùi, vị trạng thái chất ổn định như: Xanthan gum, γ-PGA CMC cho điểm đánh giá cao, sản phẩm chất lượng đồng sau trình bảo ôn Qua 20 đánh giá cảm quan chất lượng sản phẩm sử dụng γ-PGA số phụ gia khác ổn định chất lượng sản phẩm nước cam, cho thấy γ-PGA có khả ổn định môi trường nước có độ axít từ 3g/l đến g/l, tương tự chất phụ gia loại CMC Xanthan Gum 3.10.3 Xác định tỷ lệ bổ sung γ-PGA vào nước cam Tiến hành thí nghiệm với nồng độ γ-PGA 0,05%; 0,10%; 0,15% 0,20% sản phẩm nước cam, sau đem đánh giá chất lượng cảm quan sản phẩm Bảng 3.21 Chất lượng cảm quan nước cam ép đục tỷ lệ bổ sung γ-PGA Nồng độ bổ sung γ-PGA nước cam (%) Chỉ tiêu đánh giá cảm quan ĐC 0,05 0,10 0,15 0,20 Tổng điểm chưa 12 13,5 13,2 12,1 11,7 có hệ số trọng lượng Điểm chất lượng 16,52 17,8 17,41 15,6 15,04 Xếp loại Khá Khá Khá Khá TB Kết thu với nồng độ γ-PGA 0,05% cho điểm chất lượng cao nhất, có điểm cảm quan màu sắc, mùi vị hình thái cao Lựa chọn công thức tương ứng với tỷ lệ bổ sung γ-PGA cho sản phẩm 0,05% 3.10.4 Ảnh hưởng chế độ trùng tới chất lượng cảm quan nước cam Nhiệt độ 80oC, 90oC thời gian 5, 10, 15 phút sản phẩm có hương tốt màu sắc không đổi vàng đẹp Ở nhiệt độ 100oC thời gian phút màu sắc hương vị không đổi trùng 10 phút 15 phút sản phẩm có mùi nấu chín Do nghiên cứu đưa lựa chọn trùng nước cam nhiệt độ 90oC cho trùng nước cam có sử dụng γ-PGA nồng độ 0,05% thời gian 10-15 phút 3.11 Nghiên cứu ứng dụng γ-PGA cải thiện chất lượng giò 3.11.1 Ảnh hưởng loại phụ gia đến độ dẻo khối thịt xay Nghiên cứu dùng để đánh giá mức độ nhuyễn, độ dẻo khối thịt sử dụng loại phụ gia Các phụ gia sử dụng nghiên cứu gồm γ-PGA, sodium tripolyphosphate (STPP), 21 borac (hàn the), tinh bột biến tính (TBBT) chitosan phụ gia sử dụng không sử dụng ngành chế biến thực phẩm Các phụ gia sử dụng mức giới hạn Bộ Y tế cho phép phụ gia bị cấm danh mục (hàn the) sử dụng theo kinh nghiệm thực tế (0,1 – 0,5%), mục đích việc sử dụng phụ gia bị cấm nhằm so sánh, gợi mở thay đổi việc sử dụng phụ gia an toàn thực phẩm hình 3.36 Hình 3.36 Biểu đồ ảnh hưởng Hình 3.37 Biểu đồ lực nén lực cắt phụ gia tạo cấu trúc đến chất lượng giò thành phẩm khối thịt xay 3.11.2 Ảnh hưởng loại phụ gia đến chất lượng giò 3.11.2.1 Đánh giá chất lượng giò qua thông số lực nén lực cắt Sự thay đổi tính chất, cấu trúc khối thịt xay trình làm giò phần đánh giá mức độ ảnh hưởng loại phụ gia đến trình chế biến thực phẩm Tuy nhiên để phân tích đánh giá cấu trúc sản phẩm cần đánh giá mẫu sản phẩm cuối Các mẫu phụ gia bổ sung vào mẫu giò nghiên cứu sau chế biến điều kiện (bao gói tiêu chuẩn, nhiệt độ, thời gian chế biến, thành phần phụ nhau) mẫu bảo ôn đem phân tích máy đo cấu trúc cho kết hình 3.37 Khi kết hợp hai yếu tố lực nén lực cắt lên sản phẩm giò đánh giá mức độ giòn, cứng sản phẩm Nhìn vào biểu đồ 3.37 lực nén (LN) lực cắt (LC) máy đo cấu trúc phân tích giò thành phẩm cho thấy lực nén mẫu có sử dụng Chitosan γ-PGA lớn nhất, đồng nghĩa với độ đàn hồi độ cứng giò thành phẩm tốt Để đánh giá mức độ đồng nhất, độ đàn hồi cấu trúc giò tiến hành thử nghiệm cường lực gel 22 mẫu sử dụng loại phụ gia khác nhau, kết cho thấy cường lực gel lớn mẫu có sử dụng chitosan thấp mẫu chứa γ-PGA; STPP; Tinh bột biến tính thấp hàn the mẫu đối chứng Qua phân tích cường lực gel lần khẳng định việc sử dụng chitosan γ-PGA làm phụ gia ổn định cải thiện cấu trúc sản phẩm giò lụa ưu việt an toàn 3.11.2.2 Đánh giá chất lượng giò sử dụng loại phụ gia tạo cấu trúc phương pháp cảm quan Các mẫu giò sau đánh giá qua phân tích lực nén, lực cắt phân tích phương pháp cảm quan để đánh giá chất lượng, kết cho thấy: Khả sử dụng loại phụ gia thực phẩm việc ổn định cải thiện chất lượng giò thử nghiệm so sánh γ-PGA loại phụ gia khác sử dụng rộng rãi thị thường sản xuất, cho thấy γ-PGA có khả ổn định trạng thái, cho màu sắc đặc trưng giò tươi, thay phụ gia độc hại hàn the, tạo cấu trúc sản phẩm giò tốt sử dụng hợp chất photphat loại tinh bột biến tính Về mặt ứng dụng thực tiễn hiệu kinh tế chưa đáp ứng chitosan, góc độ định γ-PGA có khả tạo màu cho sản phẩm nên lợi γ-PGA trình ứng dụng 3.11.3 Khảo sát nồng độ γ-PGA đến chất lượng giò Nghiên cứu ảnh hưởng γ-PGA đến khả ổn định, cải thiện cấu trúc giò cho thấy nồng độ 0,1% γ-PGA cải thiện chất lượng giò tốt phụ gia sử dụng thị trường Từ nghiên cứu thực tế cho thấy sử dụng γ-PGA nồng độ 0,20% làm phụ gia chế biến giò, nhằm cải thiện chất lượng giò, thay cho hàn the sử dụng tràn lan thị trường chế biến KẾT LUẬN Sau trình nghiên cứu, luận án thu kết sau: Từ mẫu thực phẩm truyền thống phân lập 27 chủng vi khuẩn tuyển chọn chủng B5 có khả sinh tổng hợp γ-PGA cao từ sản phẩm tương Bần Bằng phương pháp xác định đặc 23 điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa sinh học phân tử định tên chủng B5 B subtilis B5 Bằng phương pháp khảo sát đơn yếu tố phương pháp quy hoạch thực nghiệm bậc Box- Bernken xác định điều kiện tối ưu chủng B subtilis B5 sinh tổng hợp γ-PGA cao: tiền chất natri glutamat 25 g/l, axit citric 15 g/l, NH4NO3 15 g/l, tỷ lệ cấp giống 5%, nuôi tĩnh nhiệt độ 39,7oC, pH = sau thời gian 97 thu nhận γ-PGA có nồng độ 25,02 g/l Đã đưa quy trình thu nhận, tinh chế phẩm γ-PGA dạng bột: Chủng giống Lên men Dịch lên men Bổ sung H2O gia nhiệt (100oC) Tảy màu, tảy mùi Lọc thô Lọc tinh Kết tủa cồn 98% (2 lần, tỷ lệ 3:1) Thẩm tích γ-PGA Sấy phun (maltodextrin 5%, nhiệt độ 160oC 11.000 v/p, lưu lượng cấp dịch l/h) Chế phẩm γPGA dạng bột Hiệu suất thu hồi γ-PGA thực tế triển khai quy mô pilot so với tính toán lý thuyết đạt 95% Đã xác định cấu trúc số đặc tính sản phẩm γPGA thu được: Mw>158 kDa, γ-PGA có chứa α NH+ γ COO-; tỷ lệ đồng phần D:L glutamic – 47,97:52,03; có tính chất nhớt vùng axít từ pH 2,5 đến 7,0; bền nhiệt khoảng 25–125oC đáp ứng tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm, vi sinh vật hàm lượng kim loại nặng Bước đầu thử nghiệm ứng dụng γ-PGA 0,05% ổn định nước cam tự nhiên 0,1- 0,2% sản phẩm giò lụa cho kết tốt Chế phẩm γ-PGA dùng để thay hàn the chế biến bảo quản giò sản phẩm chế biến từ thịt khác Các hướng nghiên cứu tiếp tục dự kiến - Nghiên cứu ứng dụng γ-PGA lĩnh vực nông nghiệp mỹ phẩm - Nghiên cứu tạo γ-PGA từ phụ phẩm nhà máy chế biến thực phẩm - Nghiên cứu sản xuất túi đựng sinh học từ γ-PGA 24 [...]... đồng phân quang học D và L glutamic Sau khi tinh toán cho th y tỷ lệ D:L glutamic axit là 47,97/52,03 trong hỗn hợp poly γ glutamic axit sản sinh bởi B subtilis B5 Kết quả n y cũng một lần nữa khẳng định cho nguồn gốc chủng giống sinh tổng hợp γ-PGA là B subtilis 3.8.3 Nghiên cứu tính bền axit của γ-PGA Nghiên cứu thử nghiệm ảnh hưởng tính chất của γ-PGA trên các môi trường axit citric có nồng độ từ... kết quả trong bảng 3.9 nhận th y: khi nghiên cứu tại quy mô 100 lít/mẻ, nếu xét ở góc độ năng suất cao, nên kết hợp cả phương pháp khu y trộn và sục khí thì khả năng sinh tổng hợp γ-PGA sẽ cao hơn so với các phương pháp lên men tĩnh, khu y hoặc sục khí 3.6.2 Sự thay đổi của hàm lượng oxy hòa tan trong quá trình lên men Khảo sát cho th y nồng độ oxy hòa tan trong thiết bị lên men giảm mạnh trong thời... γ-PGA Kết quả cho th y, quá trình sinh trưởng của chủng B5 theo 4 giai đoạn Từ 0 đến 24h sinh khối tế bào tăng chậm, giai đoạn n y chủng B5 thích ứng dần với môi trường lên men, có thể khẳng định đ y là pha tiềm phát Giai đoạn từ 24h đến 72h sinh khối tế bào tăng rất mạnh từ 15,1 đến 54,6 g/l, cho th y tế bào sinh sản rất nhanh, chất dinh dưỡng chủ y u được tổng hợp sinh khối Trong khoảng thời 12 gian... và nồng độ tiền chất = 25 g/l sau thời gian 97 giờ thu nhận γ-PGA = 25,02 g/l là phương án được chọn cho các nghiên cứu sau của đề tài 3.5 Nghiên cứu động học của quá trình lên men Trước khi đi vào nghiên cứu sinh tổng hợp γ-PGA trên quy mô pilot (100lít/mẻ) tiến hành nghiên cứu động học quá trình lên men n y trên quy mô phòng thí nghiệm BioTron quy mô 5-7 lít/mẻ, kết quả được biểu diễn trên hình 3.20:... lên men tăng đến giá trị cực đại, kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn, g y ức chế sự phát triển của vi khuẩn, rất ít oxy được sử dụng Trong giai đoạn n y các đơn phân glutamic và các muối của nó được chuyển hóa thành các chuỗi polyme γ-PGA 3.7 Nghiên cứu một số phương án tinh sạch γ-PGA Quá trình tinh sạch của γ-PGA được sử dụng để nghiên cứu dựa trên những công bố khoa học của nước ngoài với 3 phương... tạo ra lượng enzym PGA synthetase lớn làm xúc tác cho quá trình tổng hợp γ-PGA Trong giai đoạn cuối pha cân bằng một phần γ-PGA được vi khuẩn sử dụng làm chất dinh dưỡng nên hàm lượng giảm Trong toàn bộ quá trình sinh trưởng và phát triển, giá trị pH của môi trường hầu như không thay đổi so với giá trị ban đầu 3.6 Nghiên cứu các y u tố ngoại cảnh đến sinh tổng hợp γPGA của chủng B5 ở quy mô 100 lít/mẻ... γ-PGA Sau khi nghiên cứu trên thực nghiệm thu được kết quả s y phun tốt nhất đối với chế phẩm γ-PGA trong bảng 3.14: Bảng 3.14 Các thông số s y phun cho chế phẩm γ-PGA Chỉ tiêu Chất trợ s y: Maltodextrin Nhiệt độ s y Tốc độ đĩa phun Hiệu suất thu hồi Lưu lượng dịch cấp Đánh giá cảm quan Thông số 5% 160 oC 11.00-12.000 v/ph 85,8 -90,4% 5 lít/h Bột khô, hút ẩm chậm, màu trắng, dễ l y sau khi s y phun Độ... đến 24h và nồng độ oxy hòa tan ở giai đoạn 24 đến 48h rất thấp, sự tiêu thụ oxy cho quá trình sinh 13 trưởng và phát triển của vi khuẩn làm lượng oxy hòa tan trong dịch giảm xuống cực tiểu, đồng nghĩa với sự sinh trưởng của vi sinh vật đạt cực đại Sau 48h quá trình tổng hợp γ-PGA đi vào giai đoạn tăng trưởng, quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn đi vào giai đoạn suy thoái Sau 72h nồng độ... pha cân bằng, sinh khối tế bào giữ ở mức ổn định số tế bào chết bằng số tế bào được sinh ra Giai đoạn cuối từ 120h đến 144h sinh khối thế bào bắt đầu giảm, có thể do chứa nhiều chất trao đổi thứ cấp g y ức chế sinh trưởng, môi trường dinh dưỡng dần cạn kiệt Quá trình sinh tổng hợp PGA tăng mạnh từ 72 đến 96h và bắt đầu giảm khi đi vào cuối pha cân bằng Điều n y có thể th y sự tạo thành sinh khối mạnh... trên tiêu chí hàm lượng protein và carbonhydrat Các mẫu nghiên cứu thu được, tiến hành tinh sạch trên 3 phương pháp đã được quốc tế công bố, sau đó kiểm tra hàm lượng protein, carbonhydrate và hiệu suất thu hồi sau khi tinh sạch Thu được kết quả trong bảng 3.10 sau: Bảng 3.10: Hàm lượng protein và carbonhydrat còn lại sau khi tinh sạch γ-PGA Hàm lượng Carbonhydrat Hiệu suất Mẫu Protein (µg/g) (%) (µg/g) ... luận án:  Nghiên cứu công nghệ sản xuất axit poly γ glutamic từ vi sinh vật  Ứng dụng chế phẩm axit poly γ glutamic vào sản phẩm thực phẩm Nội dung nghiên cứu gồm  Phân lập, tuyển chọn định... glutamic  Tinh sạch, thu nhận khảo sát đặc điểm axit poly γ glutamic  Bước đầu ứng dụng thử nghiệm axit poly γ glutamic vào số sản phẩm thực phẩm Những đóng góp luận án  Luận án nghiên cứu cách... chủng vi sinh vật có khả sinh tổng hợp γ-PGA từ sản phẩm thực phẩm lên men truyền thống  Khảo sát tối ưu điều kiện nuôi c y cho chủng lựa chọn để thích hợp sinh tổng hợp axit poly γ glutamic