NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG MỘT SỐ LOẠI ĐƯỜNG NHẰM TĂNG CƯỜNG ĐỘ BỀN NHIỆT CỦA PHYTASE TÁI TỔ HỢP

Để có thể sinh trưởng và phát triển trong điều kiện môi trường bất lợi (nhiệt độ cao, nồng độ muối cao, điều kiện khô hạn…), các sinh vật thường tích lũy các hợp chất tương thích. Những hợp chất tương thích sẽ giúp tế bào duy trì áp suất thẩm thấu, thể tích tế bào và hàm lượng các chất cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của tế bào. Các hợp chất tương thích thường là các hợp chất hữu cơ nhỏ dễ hòa tan, chúng có thể là các hợp chất polyol, đường, các axit amin, betaine, ectoine và hydroxyectoine Những hợp chất tương thích không chỉ bảo vệ tế bào mà chúng còn bảo vệ protein và ADN chống lại một số điều kiện môi trường bất lợi. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng: sau khi được tách chiết ra khỏi tế bào chúng vẫn có khả năng bảo vệ các enzyme, protein, ADN và thậm chí là cả tế bào chống lại ảnh hưởng của nhiệt độ cao, điều kiện lạnh, khô hạn, điều kiện pH cao hoặc thấp Năm 2011, Ngô Thanh Xuân đã phân lập gen mã hóa enzyme phytase từ Aspergillus niger Xp sau đó chuyển gen và biểu hiện thành công trong tế bào nấm men Pichia pastoris. Phytase tái tổ hợp mang các đặc điểm quý của phytase từ A. niger Xp như hoạt động ở pH thấp, không bị thủy phân bởi các enzyme trong dạ dày, có tiềm năng ứng dụng cao trong sản xuất thức ăn chăn nuôi. Tuy nhiên, ở nhiệt độ cao trên 55 0C thì enzyme mất khoảng 60 % hoạt tính nên gây trở ngại trong quá trình tạo và bảo quản chế phẩm enzyme 6. Chính vì vậy, vấn đề cấp thiết hiện nay là tìm ra các biện pháp nhằm tăng cường độ bền nhiệt của phytase. Xuất phát cơ sở thực tiễn lí luận và phạm vi nghiên cứu của sinh viên chúng tôi đã lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu sử dụng một số loại đường nhằm tăng cường độ bền nhiệt của phytase tái tổ hợp”.

Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn thầy giáo TS Đồn Văn Thược tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em suốt trình nghiên cứu thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn thầy cô khoa Sinh học- Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, đặc biệt thầy cô tổ môn Công nghệ Sinh họcVi sinh tạo điều kiện cho em thời gian học tập nghiên cứu Và gia đình, bạn bè, người thân động viên giúp đỡ em suốt trình thực đề tài Dù có nhiều cố gắng lực cịn hạn chế nên khóa luận em khơng tránh khỏi thiếu sót Em mong nhận được bảo, đóng góp ý kiến thầy để khóa luận em được hoàn chỉnh Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2013 Người viết Vũ Thị Hường Vũ Thị Hường- K59A- Khoa Sinh học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp MỤC LỤC PHẦN MỞ ĐẦU ………… …………………………………… …….……1 1.1 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI .1 1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI……… …………………………… ……… 1.3 NỘI DUNG CÔNG VIỆC …… ……………………………………… 1.4 TỔNG QUAN TÀI LIỆU …… ……… ……………………….…… 1.4.1 Enzyme phân giải phytate- Phytase…… ………… ………….……3 1.4.1.1 Định nghĩa ……… .……………………………………… .3 Nguồn phytase…… .………………………………… ………….…4 1.4.1.3 Độ bền nhiệt phytase ………………………….…………… 1.4.1.4 Ứng dụng phytase…………… …………………………… …7 1.4.1.5 Tình hình sử dụng nghiên cứu phytase Việt Nam …………… 1.4.2 Hợp chất tương thích và vai trò bảo vệ enzyme … …… 11 1.4.2.1 Đặc điểm chất tương thích……… ………………….… 10 1.4.2.2 Nguồn chất tương thích sinh vật…… …………… …… 11 1.4.2 Vai trò chất tưong thích ………………………….…… 12 1.4.2.4 Cơ chế ổn đinh protein nhiệt độ cao……………… .…….……13 4.2.5 Ứng dụng chất tương thích cơng nghệ sinh học… .15 PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU KHOA HỌC …… …………17 2.1 VẬT LIỆU …….……………………………………………… .……… 17 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu ……………………………………… .…….…17 2.1.2 Hóa chất …………………………………………………… …….…17 2.1.3 Thời gian địa diểm ………………………………………… .…… 17 Vũ Thị Hường- K59A- Khoa Sinh học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 2.1.4 Thiết bị .18 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .18 2.2.1 Phương pháp vi sinh ……………………….…………… …… … 18 2.1.1.Phương pháp nhân giống vi sinh vật .18 2.1.2.Phương pháp lên men sản xuất phytase nồi lên men .18 2.2.2 Các phương pháp hóa sinh .19 2.2.2.1 Phương pháp xác định hoạt tính phytase……… 19 2.2.2.2 Phương pháp loại đường khỏi dịch enzyme thô………………… 21 2.2.2.3 Phương pháp xác định protein tổng số dịch enzyme……… 21 2.2.2.4 Phương pháp kiểm tra độ bền nhiệt enzyme .23 PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Nghiên cứu sản xuất phytase tái tổ hợp nồi lên men……… …24 3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng chất bổ sung đến độ bền nhiệt phytase thô đã loại đường xử lí nhiệt 90 0C…………………… … 25 3.2.1 Loại đường dịch phytase theo phương pháp kết tủa (NH4)2SO4 thẩm tách …………………………………………… …… 25 3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng chất bổ sung đến độ bền nhiệt phytaseđã loại đường …………………………………… ……………… 25 2.3 Khảo sát ảnh hưởng chất bổ sung nồng độ khác đến độ bền nhiệt phytase………………………… … 27 3.3 Ảnh hưởng nồng độ glucose và saccharose đến độ bền nhiệt phytase thô chưa loại đường 90 0C………………………………… … 32 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ………………………………… …33 Vũ Thị Hường- K59A- Khoa Sinh học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 4.1 Kết luận…………………………………………………………… ….33 4.2 Đề nghị ……………………………………………………………… .…33 TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………… .…….34 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Kí hiệu Diễn giải ADN Acid Deoxyribo Nucleic CS Cộng IU International unit (đơn vị quốc tế) M Mol OD Optical density (mật độ quang) PVC Phosphat vô TCA Trichloracetic acid Kí hiệu sơ đồ hình 1.3 ΔGG Năng lượng tự aq Nước U Trạng thái mở xoắn protein F Trạng thái cuộn gấp protein S Dung dịch có chứa chất tương thích Vũ Thị Hường- K59A- Khoa Sinh học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Phản ứng xúc tác phytase phân giải phytic……… …….3 Hình 1.2 Cơ chế ổn định chất tương thích dựa mơ hình ưu đãi… … 13 Hình 1.3 Chất tương thích làm tăng lượng mở xoắn protein…… …14 Hình 2.1 Đồ thị chuẩn thể mối tương quan hàm lượng Pvc OD 700 nm ……………………………………….…………………… ……20 Hình 2.2 Đồ thị chuẩn thể mối tương quan hàm lượng BSA (µg/ml) với OD595 …………………………………………………………………… ……22 Hình 3.1 Hai pha nuôi cấy sản xuất phytase nồi lên men……… 24 Hình 3.2 Ảnh hưởng chất tương thích đến độ bền nhiệt phytase ở nồng độ 150mM………………………………………………………… … 26 Hình 3.3 Ảnh hưởng maltose đến độ bền nhiệt phytase xử lí ở 90 0C 15 phút………………………………………… ….… … .……27 Hình 3.4 Ảnh hưởng sorbitol đến độ bền nhiệt phytase xử lí ở 90 0C 15 phút……………………………………………….… .……28 Hình 3.5 Ảnh hưởng saccharose đến độ bền nhiệt phytasekhi xử lí ở 90 0C 15 phút……………………………………… ……… … .……28 Hình 3.6 Ảnh hưởng trehalose đến độ bền nhiệt phytase xử lí ở 90 0C 15 phút………………………………………………… .………29 Vũ Thị Hường- K59A- Khoa Sinh học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.7 Ảnh hưởng glucose đến độ bền nhiệt phytase xử lí ở 90 0C 15 phút………………………………….……… .……… ….… 30 Hình 3.8 Ảnh hưởng saccharose glucose đến độ bền nhiệt phytase thô…………………………………………………………… .…… ……… 32 Vũ Thị Hường- K59A- Khoa Sinh học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp PHẦN I: MỞ ĐẦU 1.1 LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI Để sinh trưởng phát triển điều kiện môi trường bất lợi (nhiệt độ cao, nồng độ muối cao, điều kiện khô hạn…), sinh vật thường tích lũy hợp chất tương thích Những hợp chất tương thích giúp tế bào trì áp suất thẩm thấu, thể tích tế bào hàm lượng chất cần thiết cho sinh trưởng phát triển tế bào Các hợp chất tương thích thường hợp chất hữu nhỏ dễ hịa tan, chúng hợp chất polyol, đường, axit amin, betaine, ectoine hydroxyectoine [23, 31, 38] Những hợp chất tương thích khơng bảo vệ tế bào mà chúng cịn bảo vệ protein ADN chống lại số điều kiện môi trường bất lợi Nhiều nghiên cứu chứng minh rằng: sau được tách chiết khỏi tế bào chúng có khả bảo vệ enzyme, protein, ADN chí tế bào chống lại ảnh hưởng nhiệt độ cao, điều kiện lạnh, khô hạn, điều kiện pH cao thấp [23, 25, 31, 36] Năm 2011, Ngô Thanh Xuân phân lập gen mã hóa enzyme phytase từ Aspergillus niger XP sau chuyển gen biểu thành cơng tế bào nấm men Pichia pastoris Phytase tái tổ hợp mang đặc điểm quý phytase từ A niger XP hoạt động ở pH thấp, không bị thủy phân bởi enzyme dày, có tiềm ứng dụng cao sản xuất thức ăn chăn nuôi Tuy nhiên, ở nhiệt độ cao 55 0C enzyme khoảng 60 % hoạt tính nên gây trở ngại trình tạo bảo quản chế phẩm enzyme [6] Chính vậy, vấn đề cấp thiết tìm biện pháp nhằm tăng cường độ bền nhiệt phytase Xuất phát sở thực tiễn lí luận phạm vi nghiên cứu sinh viên lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu sử dụng số loại đường nhằm tăng cường độ bền nhiệt phytase tái tổ hợp” Vũ Thị Hường- K59A- Khoa Sinh học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Nghiên cứu lựa chọn được loại đường phù hợp làm tăng khả bền nhiệt phytase tái tổ hợp 1.3 NỘI DUNG CÔNG VIỆC - Sản xuất enzyme phytase tái tổ hợp để thu được lượng enzyme cần thiết dùng cho nghiên cứu - Loại đường khỏi dịch enzyme thô - Khảo sát ảnh hưởng chất tương thích đến độ bền nhiệt phytase thô loại đường - Khảo sát ảnh hưởng vài hợp chất tương thích đựơc lựa chọn đến độ bền nhiệt phytase thô không loại đường 1.4 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Vũ Thị Hường- K59A- Khoa Sinh học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp 1.4.1 Enzyme giải phytatePhytase phân 1.4.1.1 nghĩa Định Phyta se enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân myo- inositol hexakisphosphate (axit phytic) thành gốc phosphate đơn vô dẫn xuất đơn giản myo- inositol phosphat Hình 1.1 Phản ứng xúc tác phytase phân giải phytic Căn vào vị trí nhóm phosphate đầu tiên bị phytase cơng ở vị trí cacbon thứ hay cacbon thứ 6, Ủy ban danh pháp enzyme thuộc Hiệp hội Hóa sinh Quốc tế chia phytase thành hai nhóm: Nhóm 1: kí hiệu (EC 3 8) Tên đề xuất: 3- phytase Vũ Thị Hường- K59A- Khoa Sinh học Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Tên phân loại: myo- inositol hexakisphosphate phosphohydrolase Tên khác: phytase, phytate-3-phosphatase Nhóm 2: kí hiệu ( EC 3 6) Tên đề xuất: 6- phytase Tên phân loại: myo- inositol hexakisphosphate phosphohydrolase Tên khác : phytase, phytate- 6- phosphatase 1.4.1.2 Nguồn phytase Phytase phổ biến tự nhiên, được tìm thấy ở nhiều lồi vi sinh vật, thực vật, mơ động vật a Phytase từ vi sinh vật Phytase từ vi sinh vật thường thấy ở nấm mốc đặc biệt ở loài thuộc chi Aspergillus Shieh Ware (1968) phân lập tuyển chọn từ đất 2000 loài vi sinh vật để sản xuất phytase Hầu hết chủng sản sinh phytase nội bào, có 30 chủng sinh phytase ngoại bào chúng nấm sợi, 28 chủng thuộc chi Aspergillus, chủng thuộc chi Penicillum chủng thuộc Mucor Trong 28 chủng chi Aspergillus sản sinh phytase, có 21 chủng thuộc lồi A niger [32] Những nhóm nghiên cứu khác Howson Davis (1983), Volfova CS (1994) khẳng định rằng A niger lồi có khả sản sinh phytase ngoại bào tốt Ngoài số vi khuẩn E coli, Bacillus sp [33] nấm men Candida krusei, Pichia anomala, Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis, Torulopsis candida, Debaryomyces castelii, Debaryomyces occidentalis, Kluyveromuces fragilis và Schwanniomyces castelii cũng có khả sinh phytase b Phytase từ thực vật Phytase được tìm thấy ở nhiều loại thực vật Phytase có nguồn gốc từ phấn hoa Lily hoạt động ở pH tối ưu 8,0 nhiệt độ tối ưu 55 oC [18] Phytase cũng được tìm thấy ngũ cốc, họ đậu hạt có dầu [37] rau Vũ Thị Hường- K59A- Khoa Sinh học ... pháp nhằm tăng cường độ bền nhiệt phytase Xuất phát sở thực tiễn lí luận phạm vi nghiên cứu sinh viên lựa chọn đề tài: ? ?Nghiên cứu sử dụng số loại đường nhằm tăng cường độ bền nhiệt phytase. .. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Nghiên cứu sản xuất phytase tái tổ hợp nồi lên men……… …24 3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng chất bổ sung đến độ bền nhiệt phytase thô đã loại đường. .. phytase? ??… .………………………………… ………….…4 1.4.1.3 Độ bền nhiệt phytase ………………………….…………… 1.4.1.4 Ứng dụng phytase? ??………… …………………………… …7 1.4.1.5 Tình hình sử dụng nghiên cứu phytase Việt Nam …………… 1.4.2 Hợp