NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG MỘT SỐ LOẠI ĐƯỜNG NHẰM TĂNG CƯỜNG ĐỘ BỀN NHIỆT CỦA PHYTASE TÁI TỔ HỢP

Để có thể sinh trưởng và phát triển trong điều kiện môi trường bất lợi (nhiệt độ cao, nồng độ muối cao, điều kiện khô hạn…), các sinh vật thường tích lũy các hợp chất tương thích. Những hợp chất tương thích sẽ giúp tế bào duy trì áp suất thẩm thấu, thể tích tế bào và hàm lượng các chất cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của tế bào. Các hợp chất tương thích thường là các hợp chất hữu cơ nhỏ dễ hòa tan, chúng có thể là các hợp chất polyol, đường, các axit amin, betaine, ectoine và hydroxyectoine Những hợp chất tương thích không chỉ bảo vệ tế bào mà chúng còn bảo vệ protein và ADN chống lại một số điều kiện môi trường bất lợi. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng: sau khi được tách chiết ra khỏi tế bào chúng vẫn có khả năng bảo vệ các enzyme, protein, ADN và thậm chí là cả tế bào chống lại ảnh hưởng của nhiệt độ cao, điều kiện lạnh, khô hạn, điều kiện pH cao hoặc thấp Năm 2011, Ngô Thanh Xuân đã phân lập gen mã hóa enzyme phytase từ Aspergillus niger Xp sau đó chuyển gen và biểu hiện thành công trong tế bào nấm men Pichia pastoris. Phytase tái tổ hợp mang các đặc điểm quý của phytase từ A. niger Xp như hoạt động ở pH thấp, không bị thủy phân bởi các enzyme trong dạ dày, có tiềm năng ứng dụng cao trong sản xuất thức ăn chăn nuôi. Tuy nhiên, ở nhiệt độ cao trên 55 0C thì enzyme mất khoảng 60 % hoạt tính nên gây trở ngại trong quá trình tạo và bảo quản chế phẩm enzyme 6. Chính vì vậy, vấn đề cấp thiết hiện nay là tìm ra các biện pháp nhằm tăng cường độ bền nhiệt của phytase. Xuất phát cơ sở thực tiễn lí luận và phạm vi nghiên cứu của sinh viên chúng tôi đã lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu sử dụng một số loại đường nhằm tăng cường độ bền nhiệt của phytase tái tổ hợp”.

LỜI CẢM ƠN

Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn thầy giáo TSĐoàn Văn Thược đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trìnhnghiên cứu và thực hiện đề tài

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô khoa Sinh học- Trường Đại học

Sư phạm Hà Nội, đặc biệt là các thầy cô trong tổ bộ môn Công nghệ Sinh

học-Vi sinh đã tạo mọi điều kiện cho em trong thời gian học tập và nghiên cứu Vàgia đình, bạn bè, những người thân đã động viên giúp đỡ em trong suốt quátrình thực hiện đề tài

Dù đã có nhiều cố gắng nhưng do năng lực còn hạn chế nên trong khóaluận của em không tránh khỏi những thiếu sót Em rất mong nhận được sự chỉbảo, đóng góp ý kiến của các thầy cô để bài khóa luận của em được hoànchỉnh hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 4 năm 2013

Người viết

Vũ Thị Hường

MỤC LỤC.

PHẦN 1 MỞ ĐẦU ………… ……… …….……1

1.1 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI 1

1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI……… ……… ……… 2

1.3 NỘI DUNG CÔNG VIỆC …… ……… 2

1.4 TỔNG QUAN TÀI LIỆU …… ……… ……….…… 3

1.4.1 Enzyme phân giải phytate- Phytase…… ………… ………….……3

1.4.1.1 Định nghĩa ……… .……… 3

1 4 1 2 Nguồn phytase…… .……… ………….…4

1.4.1.3 Độ bền nhiệt của phytase ……….……… 7

1.4.1.4 Ứng dụng của phytase……… ……… …7

1.4.1.5 Tình hình sử dụng và nghiên cứu phytase ở Việt Nam ……… 8

1.4.2 Hợp chất tương thích và vai trò trong bảo vệ enzyme … .…… 11

1.4.2.1 Đặc điểm của các chất tương thích……… ……….… 10

1.4.2.2 Nguồn các chất tương thích ở sinh vật…… ……… …… 11

1.4.2 3 Vai trò của các chất tưong thích ……….…… 12

1.4.2.4 Cơ chế ổn đinh protein ở nhiệt độ cao……… …….……13

1 4.2.5 Ứng dụng của các chất tương thích trong công nghệ sinh học… .15

PHẦN 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU KHOA HỌC …… …………17

2.1 VẬT LIỆU …….……… .……… 17

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu ……… .…….…17

2.1.2 Hóa chất ……… …….…17

2.1.3 Thời gian địa diểm ……… .…… 17

2.1.4 Thiết bị 18

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.2.1 Phương pháp vi sinh ……….……… …… … 18

2 2.1.1.Phương pháp nhân giống vi sinh vật

18

2 2.1.2.Phương pháp lên men sản xuất phytase trong nồi lên men 18

2.2.2 Các phương pháp hóa sinh

19

2.2.2.1 Phương pháp xác định hoạt tính phytase………

19

2.2.2.2 Phương pháp loại đường khỏi dịch enzyme thô……… 21

2.2.2.3 Phương pháp xác định protein tổng số trong dịch enzyme……… 21

2.2.2.4 Phương pháp kiểm tra độ bền nhiệt của enzyme 23

PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 Nghiên cứu sản xuất phytase tái tổ hợp trong nồi lên men……… …24

3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất bổ sung đến độ bền nhiệt của phytase thô đã loại đường khi xử lí nhiệt ở 90 0 C……… …

25

3.2.1 Loại đường trong dịch phytase theo phương pháp kết tủa bằng (NH 4 ) 2 SO 4 và thẩm tách ……… …… 25

3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất bổ sung đến độ bền nhiệt của phytaseđã loại đường ……… ……… 25

3 2.3 Khảo sát ảnh hưởng của các chất bổ sung ở các nồng độ khác nhau đến độ bền nhiệt của phytase……… … 27

3.3 Ảnh hưởng của nồng độ glucose và saccharose đến độ bền nhiệt của phytase thô chưa loại đường ở 90 0 C……… … 32

PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ……… …33

4.1 Kết luận……… ….33 4.2 Đề nghị ……… .…33 TÀI LIỆU THAM KHẢO……… …….34

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

IU International unit (đơn vị quốc tế)

OD Optical density (mật độ quang)

TCA Trichloracetic acid

Kí hiệu trong sơ đồ hình 1.3

U Trạng thái mở xoắn của protein

F Trạng thái cuộn gấp của protein

S Dung dịch có chứa chất tương thích

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Phản ứng xúc tác của phytase trong phân giải phytic……… …….3 Hình 1.2 Cơ chế ổn định chất tương thích dựa trên mô hình ưu đãi… … 13 Hình 1.3 Chất tương thích làm tăng năng lượng mở xoắn protein…… …14 Hình 2.1 Đồ thị chuẩn thể hiện mối tương quan giữa hàm lượng Pvc và OD700

Hình 3.7 Ảnh hưởng của glucose đến độ bền nhiệt của phytase khi xử lí ở

90 0C trong 15 phút……….……… .……… ….… 30

Hình 3.8 Ảnh hưởng của saccharose và glucose đến độ bền nhiệt của phytase

thô……… .…… ……… 32

PHẦN I: MỞ ĐẦU

1.1 LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Để có thể sinh trưởng và phát triển trong điều kiện môi trường bất lợi(nhiệt độ cao, nồng độ muối cao, điều kiện khô hạn…), các sinh vật thườngtích lũy các hợp chất tương thích Những hợp chất tương thích sẽ giúp tế bàoduy trì áp suất thẩm thấu, thể tích tế bào và hàm lượng các chất cần thiết cho

sự sinh trưởng và phát triển của tế bào Các hợp chất tương thích thường làcác hợp chất hữu cơ nhỏ dễ hòa tan, chúng có thể là các hợp chất polyol,đường, các axit amin, betaine, ectoine và hydroxyectoine [23, 31, 38]

Những hợp chất tương thích không chỉ bảo vệ tế bào mà chúng còn bảo

vệ protein và ADN chống lại một số điều kiện môi trường bất lợi Nhiềunghiên cứu đã chứng minh rằng: sau khi được tách chiết ra khỏi tế bào chúngvẫn có khả năng bảo vệ các enzyme, protein, ADN và thậm chí là cả tế bàochống lại ảnh hưởng của nhiệt độ cao, điều kiện lạnh, khô hạn, điều kiện pHcao hoặc thấp [23, 25, 31, 36]

Năm 2011, Ngô Thanh Xuân đã phân lập gen mã hóa enzyme phytase

từ Aspergillus niger XP sau đó chuyển gen và biểu hiện thành công trong tế bào nấm men Pichia pastoris Phytase tái tổ hợp mang các đặc điểm quý của phytase từ A niger XP như hoạt động ở pH thấp, không bị thủy phân bởi các

enzyme trong dạ dày, có tiềm năng ứng dụng cao trong sản xuất thức ăn chănnuôi Tuy nhiên, ở nhiệt độ cao trên 55 0C thì enzyme mất khoảng 60 % hoạttính nên gây trở ngại trong quá trình tạo và bảo quản chế phẩm enzyme [6].Chính vì vậy, vấn đề cấp thiết hiện nay là tìm ra các biện pháp nhằm tăngcường độ bền nhiệt của phytase

Xuất phát cơ sở thực tiễn lí luận và phạm vi nghiên cứu của sinh viên

chúng tôi đã lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu sử dụng một số loại đường nhằm tăng cường độ bền nhiệt của phytase tái tổ hợp”.

1.2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

Nghiên cứu lựa chọn được loại đường phù hợp làm tăng khả năng bềnnhiệt của phytase tái tổ hợp

1.3 NỘI DUNG CÔNG VIỆC

- Sản xuất enzyme phytase tái tổ hợp để thu được lượng enzyme cầnthiết dùng cho nghiên cứu này

- Loại đường khỏi dịch enzyme thô

- Khảo sát ảnh hưởng của các chất tương thích đến độ bền nhiệt củaphytase thô đã loại đường

- Khảo sát ảnh hưởng của một vài hợp chất tương thích đã đựơc lựachọn đến độ bền nhiệt của phytase thô không loại đường

1.4 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Hình 1.1 Phản ứng xúc tác của phytase trong phân giải phytic

Căn cứ vào vị trí nhóm phosphate đầu tiên bị phytase tấn công ở vị trícacbon thứ 3 hay cacbon thứ 6, Ủy ban danh pháp enzyme thuộc Hiệp hội Hóasinh Quốc tế đã chia phytase thành hai nhóm:

Nhóm 1: kí hiệu (EC 3 1 3 8)

Tên đề xuất: 3- phytase

Tên phân loại: myo- inositol hexakisphosphate 3 phosphohydrolaseTên khác: phytase, phytate-3-phosphatase

Nhóm 2: kí hiệu ( EC 3 1 3 2 6)

Tên đề xuất: 6- phytase

Tên phân loại: myo- inositol hexakisphosphate 6 phosphohydrolaseTên khác : phytase, phytate- 6- phosphatase

1.4.1.2 Nguồn phytase

Phytase rất phổ biến trong tự nhiên, nó được tìm thấy ở nhiều loài visinh vật, thực vật, mô động vật

a. Phytase từ vi sinh vật

Phytase từ vi sinh vật thường thấy nhất ở nấm mốc đặc biệt ở các loài

thuộc chi Aspergillus Shieh và Ware (1968) đã phân lập và tuyển chọn từ đất

hơn 2000 loài vi sinh vật để sản xuất phytase Hầu hết các chủng đều sản sinhphytase nội bào, chỉ có 30 chủng sinh phytase ngoại bào và chúng đều là nấm

sợi, trong đó 28 chủng thuộc chi Aspergillus, 1 chủng thuộc chi Penicillum và

1 chủng thuộc Mucor Trong 28 chủng của chi Aspergillus sản sinh phytase,

có 21 chủng thuộc về loài A niger [32] Những nhóm nghiên cứu khác như Howson và Davis (1983), Volfova và CS (1994) khẳng định rằng A niger là

loài có khả năng sản sinh phytase ngoại bào tốt nhất Ngoài ra một số vi khuẩn

như E coli, Bacillus sp [33] và nấm men như Candida krusei, Pichia anomala, Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis, Torulopsis candida, Debaryomyces castelii, Debaryomyces occidentalis, Kluyveromuces fragilis và Schwanniomyces castelii cũng có khả năng sinh phytase.

b. Phytase từ thực vật

Phytase được tìm thấy ở nhiều loại thực vật Phytase có nguồn gốc từphấn hoa Lily hoạt động ở pH tối ưu 8,0 và nhiệt độ tối ưu 55 oC [18] Phytasecũng được tìm thấy trong ngũ cốc, cây họ đậu và hạt có dầu [37] hoặc rau quả

như: lê tàu và lá hành tươi [30] Đặc biệt một số loại hạt ngũ cốc (lúa mì, lúa

mỳ spenta, lúa mạch đen, lúa mạch, triticale- giống cây lai giữa lúa mạch vàlúa mỳ) có phytase với hoạt tính cao có thể đạt trên 5000 IU/kg

c Phytase từ động vật

Phytase được tìm thấy trong cơ thể động vật dạ dày đơn [8, 10, 11] Tuynhiên, phytase trong ruột non động vật dạ dày đơn không có vai trò rõ ràngtrong việc phân giải muối phytate có trong thức ăn [39] Một enzyme có đặctính giống như phytase cũng đã được tìm thấy trong động vật nguyên sinh

Paramecium Trong loài cá Pecca lai sọc ( hybrid stripped bass) cũng tồn tại

phytase hoạt động ở pH tối ưu 3,5- 4,5 [12]

d Phytase tái tổ hợp

Nhằm nâng cao khả năng biểu hiện hoạt tính phytase, gen mã hóa choenzyme phytase đã được phân lập từ các chủng dại và chuyển vào các tế bào

chủ phổ biến như E coli, B subtilis, S cerevisiae, P pastoris, A niger và tế

bào động vật Mỗi hệ biểu hiện có những ưu điểm và hạn chế riêng, tuỳ thuộc

sản phẩm protein mà cần lựa chọn hệ biểu hiện phù hợp B subtilis có khả

năng biểu hiện và bài tiết rất tốt protein có nguồn gốc vi khuẩn ra ngoài môi

trường nuôi cấy E coli có thể biểu hiện hầu hết các protein có kích thước vừa

phải, không quá kỵ nước hay chứa nhiều gốc cystein Tuy nhiên, con đường

bài tiết protein của E coli có nhiều hạn chế Hệ biểu hiện E coli và B subtilis

đều có chung một nhược điểm là mặc dù có khả năng sản xuất protein củasinh vật nhân chuẩn ở mức độ cao, nhưng những protein này thường khôngmang hoạt tính hoặc không hòa tan [13] Hệ biểu hiện trong tế bào động vật cóthể biểu hiện các nhóm protein khác nhau và có ý nghĩa đặc biệt trong y dượchọc Tuy nhiên, quá trình chọn lọc; nhân dòng và nuôi cấy tế bào phức tạp hơnnhiều so với các hệ sử dụng vi sinh vật Hệ biểu hiện trong nấm men là mộtgiải pháp hữu hiệu khắc phục những hạn chế trên

Nấm men là hệ biểu hiện đang được sử dụng rộng rãi hiện nay bởi nó córất nhiều ưu điểm Chúng là sinh vật nhân chuẩn được nghiên cứu rất kỹ vềmặt di truyền, có khả năng tích hợp các gen lạ của các sinh vật nhân thực khácvào genome của mình Ngoài ra, chúng là sinh vật nhân chuẩn duy nhất có khảnăng thực hiện được các thao tác kỹ thuật di truyền phân tử dễ dàng như ở

E coli và có khả năng phát triển rất mạnh trong môi trường nuôi cấy Đặc

biệt, ở nấm men có quá trình sửa đổi sau dịch mã hoàn thiện để trở thành dạngprotein hoạt động và có khả năng tiết protein ra ngoài môi trường hiệu qủa

[17] S cerevisiae là chủng nấm men đầu tiên được sử dụng để biểu hiện gen Tuy vậy, S cerevisiae cũng có một số hạn chế do chưa có hệ vector biểu hiện

hữu hiệu, các plasmid dùng để biểu hiện thường là dạng đa phiên bản copy) nên rất dễ bị đào thải [13] Từ những hiểu biết kỹ lưỡng về hệ biểu hiện

(multi-S cerevisiae, hệ biểu hiện P pastoris đã ra đời và khắc phục được những

nhược điểm trên

P pastoris có khả năng tiết protein ngoại bào lớn và đã được sử dụng để tạo ra nhiều protein của người, động vật và thực vật P pastoris có thể sinh

trưởng trong điều kiện nuôi cấy liên tục trong một thời gian dài và có khảnăng lên men với mật độ tế bào cao Môi trường nuôi cấy không đắt tiền, chỉbao gồm nguồn cacbon như glucose và methanol, biotin, muối, nước Chúng

có thể sinh trưởng trên môi trường pH tương đối thấp và sử dụng nguồncacbon là methanol mà hầu hết các vi sinh vật khác không sử dụng được Do

vậy, P pastoris nuôi cấy ít mẫn cảm với tạp nhiễm của vi sinh vật từ bên ngoài P pastoris có khả năng tổng hợp lượng lớn protein ngoại lai trong peroxisome, thuận tiện cho việc vận chuyển và tiết protein Ngoài ra, P pastoris không là tác nhân gây bệnh, không chứa virus trong tế bào và còn có

một promoter mạnh có thể kiểm soát chặt chẽ được bằng nguồn cacbon Chính

vì vậy, P pastoris thường được chọn để sản xuất các protein tái tổ hợp ứng

dụng trong y học và công nghiệp thực phẩm [17]

Bộ môn Công nghệ Sinh học- Vi sinh đã tiến hành khảo sát và tìm được

nguồn gen phytase (phyA) từ nấm mốc A niger XP Gen phyA đã được tách

dòng và biểu hiện thành công trong nấm men Pichia pastoris X33 Hoạt tính

phytase đạt giá trị cực đại (1329 IU/ml) sau 4 ngày nuôi cấy trên môi trườngBMM [6]

1.4.1.3 Độ bền nhiệt của phytase

Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của các phytase dao động từ 45 đến

75 oC Wyss và CS (1999) nghiên cứu sự ổn định nhiệt độ của ba phosphatase

có nguồn gốc từ nấm và đã kết luận rằng phytase từ A niger không bền với

nhiệt độ hoặc không có khả năng hồi lại hoạt tính sau khi đun nóng gây biếntính Ở 50 và 55 oC nó mất khoảng 70- 80 % hoạt tính Phytase từ A fumigatus cũng không bền với nhiệt độ nhưng có một đặc tính đáng quý là có

khả năng hồi lại hoạt tính ban đầu sau 20 phút làm biến tính ở 90 oC So với

phytase từ A niger và A fumigatus trên thì axit phosphatase từ A niger (hoạt

động ở pH 2,5) có khả năng ổn định với nhiệt độ rất cao; ở 80 oC enzyme chưabị biến tính, chỉ mất hoàn toàn hoạt tính ở 90 oC [40] Phytase từ chủng

Bacillus sp DS11 có nhiệt độ tối ưu ở 70 oC, cao hơn nhiệt độ tối ưu củanhững phytase thông thường Phytase này cũng rất bền với nhiệt: hoạt tính cònlại 100 % sau 10 phút ủ tại 70 oC (với sự có mặt của CaCl2) Khi không cóCaCl2 khả năng bền với nhiệt của phytase từ Bacillus sp DS11 giảm mạnh,hoạt tính bị mất khi nhiệt độ trên 60 oC Ngược lại khi có mặt của CaCl2 nó cóthể bền với nhiệt độ lên tới 90 oC, sau 10 phút, lượng enzyme mất đi khoảng

50 % Nghiên cứu này chỉ ra rằng ion Ca2+ có khả năng giúp phytase ổn địnhcấu trúc, qua đó tăng khả năng chống chịu với nhiệt độ cao [20]

Cũng giống hầu hết các phytase từ A niger, phytase từ chủng tái tổ hợp Pichia pastoris có nhiệt độ hoạt động tối ưu là 60 0C Tại nhiệt độ cơ thể 37

0C phytase tái tổ hợp vẫn thể hiện trên 60 % so với hoạt tính tối đa, như vậyviệc bổ sung enzyme này vào thức ăn chăn nuôi là rất khả thi, khi nó có thểhoạt động tốt ở điều kiện nhiệt độ cơ thể sống.Tuy nhiên, khả năng bền nhiệt

là chưa cao khi nhiệt độ vượt qua 55 0C lượng enzyme mất trên 60 % hoạt

tính Chính vì không bền nhiệt cao, nếu ứng dụng cho thức ăn chăn nuôi,phytase tái tổ hợp cần được sản xuất độc lập ở điều kiện tối ưu [6]

1.4.1.4 Ứng dụng của phytase

Ứng dụng trong chăn nuôi

Việc sử dụng phytase trong chăn nuôi với mục đích tăng khả năng tiêuhóa của phosphate có sẵn trong thức ăn (dưới dạng phytate), giảm lượngphosphate gây ô nhiễm môi trường do lượng phosphate dư thừa trong phân tạikhu vực chăn nuôi gia cầm, lợn và ngoài ra còn tăng hiệu quả sử dụng của cáckhoáng chất, protein có trong thức ăn

Phytase được dùng trên 80 % trong thức ăn cho lợn ở Hà Lan và giảmđược 60 % P thải tiết trong phân của lợn [19] Cho đến nay, phytase được sửdụng là một dạng enzyme chính (nhưng không phải duy nhất) bổ sung vàokhẩu phần ăn cho lợn, gia cầm, và cá

Ứng dụng trong quá trình chế biến thực phẩm

Trong những năm gần đây, phytase ngày càng được sử dụng nhiều trongquá trình chế biến thực phẩm cho con người, nhằm giảm lượng phytate trongthực phẩm dẫn tới tăng hàm lượng khoáng chất dễ tiêu Hơn nữa phytase có thểđược ứng dụng để sản xuất thực phẩm chức năng có lợi cho sức khỏe Một sốquá trình chế biến có bổ sung phytase như chế biến bột mỳ, protein thực vật, cácloại ngũ cốc, đậu tương [14]

Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất giấy

Việc loại bỏ axit phytic rất quan trọng trong ngành công nghiệp giấy.Cách loại bỏ axit phytic trong thực vật bằng enzyme sẽ không tạo ra nhữngchất có khả năng gây ung thư và những chất có độ độc cao, giúp cải thiện môitrường cũng như góp phần vào sự phát triển của công nghệ sạch [26] Nhữngenzyme bền nhiệt độ cao thường được sử dụng để phân giải axit phytic trongquá trình chế biến giấy

1.4.1.5 Tình hình sử dụng và nghiên cứu phytase ở Việt Nam

Với tầm quan trọng trong ứng dụng thức ăn chăn nuôi, những năm gần đây

đã có nhiều nghiên cứu về ảnh hưởng của chế phẩm này lên vật nuôi tại Việt Nam.Năm 2002, Nguyễn Thị Hoài Trâm và CS (Viện Công nghiệp Thực phẩm) đãkhảo sát khả năng ứng dụng phytase thương phẩm trong chăn nuôi gà và chothấy việc sử dụng phytase làm tăng 2 % tỷ lệ đẻ trứng, làm giảm 8,4- 11,6 %chi phí thức ăn cho gà con Trần Quốc Việt và Ninh Thị Len (Viện Chăn nuôi)

đã nghiên cứu tác dụng chế phẩm phytase thương mại (Natuphos, BASF) đếnnăng suất và hiệu quả sử dụng thức ăn của lợn con cai sữa và lợn nuôi thịt.Theo các tác giả, sử dụng phytase giúp lợn tăng trọng 16,4 % và giúp giảm chiphí thức ăn được 8 % so với lô đối chứng [5] Nhóm tác giả Hồ Trung Thông,Đặng Văn Hồng (2009) cho biết bổ sung chế phẩm enzyme thương mại cóchứa phytase đã cải thiện được tốc độ sinh trưởng và tiêu tốn thức ăn của lợn

Ở mức bổ sung 2000 IU protease + 56 IU amylase + 250 IU phytase/kg thức

ăn làm tăng trọng lợn lên 7,54 % và giúp giảm được 4,22 % lượng tiêu tốnthức ăn so với đối chứng [4]

Song song với những nghiên cứu thử nghiệm nguồn phytase nhập khẩu,những hướng nghiên cứu sản xuất phytase đã được nhiều tác giả quan tâm.Trần Thị Tuyết và CS (Viện Sinh học Nhiệt đới) đã nghiên cứu lên men bề

mặt cám mỳ để thu phytase sử dụng A niger NRRL 363 (từ Bộ sưu tập giống

của Mỹ) thu được 572,78 IU/g cơ chất lên men sau 2 ngày nuôi cấy, độ ẩmban đầu thích hợp là 60 % Phytase thu được có hoạt tính tối ưu tại pH 5,5 vànhiệt độ tối ưu ở 55 oC [35]

Nguyễn Thùy Châu (Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau Thuhoạch) từ 1/2007 – 12/2009 đã nghiên cứu và hoàn thiện công nghệ sản xuấtphytase bằng hình thức lên men bề mặt Trong nghiên cứu đã sử dụng các

chủng vi sinh vật: A niger ATCC 9142, A ficcum NRRL 3135 từ bộ sưu tập giống của Mỹ; A niger NCIM, Rhizopus microsporus từ Cộng hòa Séc và chủng A niger DL1 phân lập từ Việt Nam Nhóm tác giả đã nghiên cứu qui

trình lên men rắn sản xuất phytase ở qui mô công nghiệp Theo đó chủng sản

xuất được lên men ở nhiệt độ 30 oC trong 7 ngày trên môi trường P3 Cơ chấtsau lên men được tách chiết enzyme bằng dịch oxy già 5 %, enzyme thô đượcthu bằng ly tâm và tủa bằng cồn 96 oC, sấy khô tạo chế phẩm VS1 Khảonghiệm tác động của chế phẩm trên gà cho thấy 200 g chế phẩm VS1 bố sungcho 1 tấn thức ăn có thể thay thế cho 4,2 % lượng dicanxi phosphate trongkhẩu phần thức ăn [1].

Ngoài việc ứng dụng các kỹ thuật truyền thống, một con đường khác là

sử dụng công nghệ protein tái tổ hợp để sản xuất enzyme, đây là hướng đi hiệnđại phù hợp để sản xuất enzyme ở qui mô công nghiệp mà các nước tiên tiến

đã và đang thực hiện Hướng đi này giúp nâng cao năng suất sinh tổng hợpenzyme đồng thời lượng enzyme thu được dễ dàng tinh sạch hơn khi sử dụngchủng tự nhiên Tại Việt Nam, trong những năm gần đây cũng đã có một sốnghiên cứu tách dòng và tạo phytase tái tổ hợp Năm 2007, Đỗ Thị Ngọc

Huyền đã tách dòng và thể hiện phyC tái tổ hợp từ Bacillus subtilis trên E coli và thu được lượng enzyme tái tổ hợp ở nồng độ 288 mg/l, gấp 48 lần phytase từ chủng tự nhiên [3] Năm 2008 Nguyễn Văn Viết biểu hiện phyC tái

tổ hợp từ Bacillus subtilis trên E coli BL21 (DE3) đạt tổng năng suất phytase

nội bào và ngoại bào là 92 IU/ml Những kết quả nghiên cứu của các tác giảtrong nước về phytase là hết sức có ý nghĩa Đây chính là động lực và cơ sởcho những nghiên cứu tiếp theo nhằm phát triển, hoàn thiện tiến tới sản xuấtphytase trong nước

1.4.2 Hợp chất tương thích và vai trò trong bảo vệ enzyme.

1.4.2.1 Đặc điểm của các chất tương thích

Các chất tương thích là chất đựơc tích lũy trong các sinh vật ở nồng độcao Chúng tương thích với chức năng của tế bào, giúp cho sinh vật thích nghivới điều kiện khắc nghiệt của môi trường Các phân tử này có chung một sốđặc tính sau [15, 41]:

- Là các chất tan tốt trong nước, nồng độ tích lũy trong tế bào chất củacác chất tương thích cao (lớn hơn 1M)

- Chúng thường là các phân tử lưỡng cực hoặc trung tính, có khối lượngphân tử thấp, không tương tác với protein

- Không làm thay đổi hoạt động của enzyme; giảm thiểu tác động củacác tác nhân hóa học và nhiệt ví dụ như hàm lượng muối cao, nhiệt độ cao, xửlí lạnh– khô đến hoạt tính của enzyme Tuy nhiên khi nồng độ tăng nên quácao thì chúng gây ra ức chế nhỏ đến hoạt tính của enzyme

- Chúng thường là chất chuyển hóa cuối cùng trong quá trình sinh tổnghợp do đó nó đựơc tích lũy với nồng độ cao trong tế bào sinh vật sống trongmôi trường cực trị

Người ta chia các chất tương thích ra ba nhóm chính là [31]:

+ Các chất tan lưỡng cực gồm có betaine, ectoine và hyđroxyectoine,

Nε-acetyl-β-lysine and β-glutamine Các phân tử trong nhóm có tính phân cực,

một đầu tích điện âm còn đầu kia tích điện dương

+ Các chất tan không tích điện là các phân tử có phân cực nhưng khôngmang điện tích Đại diện điển hình cho nhóm này là các loại đường (trehalose,saccharose), các polyol (glycerol, sorbitol), các acid amin không tích điện

+ Các chất tan anion như β-Glutamate, β-Hydroxybutyrate và dẫn xuất,

các anion polyol và đường

1.4.2.2 Nguồn các chất tương thích ở sinh vật

Chất tương thích đựơc tìm thấy trong tế bào nhóm vi sinh sống trongmôi trường cực trị, sinh vật ưa hoặc chịu mặn Chúng có thể đựơc tổng hợptrong tế bào, hoặc vận chuyển từ bên ngoài vào trong tế bào

Ectoine (axit 1,4,5,6-tetrahydro-2-methyl-4-pyrimidinecarboxylic) làthành phần đặc trưng trong tế bào chất của các vi khuẩn ưa mặn, đựơc phát

hiện lần đầu tiên trong vi khuẩn ưa mặn quang dưỡng Halorhodospora halochloris Gần đây, nó đựơc tìm thấy trong một số vi khuẩn ưa mặn trung bình Methylarculamarina, M terricola, và Methylophaga sp Một dạng khác

của ectoine là hydroxyectoine, đã được phát hiện trong vi khuẩn ưa mặn

Sporosarcina pasteurii phát triển trong môi trường độ thẩm thấu cao Nồng độ

ectoine trong tế bào phụ thuộc vào nồng độ NaCl ngoài môi trường và thayđổi theo các giai đoạn [31]

Trehalose đựợc sinh vật sử dụng để chống lại điều kiện khô hạn Chúng

được tìm thấy trong các vi khuẩn ưa mặn Actinopolyspora halophila, Desulfovibrio halophilus, Chromohalobacter israelensis Khác với ectoin, sự

tích lũy trehalose trong tế bào diễn ra tốt hơn ở nồng độ NaCl thấp hơn 0,6 M

[31] Trehalose, là carbohydrate được tìm thấy chủ yếu trong lớp Nấm đảm và

Nấm túi Trong nấm, trehalose được sử dụng một chất bảo vệ chống lại tổnthương tế bào gây ra bởi sự thiếu dinh dưỡng, sốc nhiệt, oxy hóa và áp lựcthẩm thấu, giúp ổn định màng và protein [8]

Các polyol như mannitol và glycerol cũng được tìm thấy trong nấm men

Saccharomyces roxii, Nấm đảm và Nấm túi để đáp ứng với giảm khả năng

thẩm thấu bên ngoài và đáp ứng độ mặn trong một số loại nấm khác[8]

Glycerol cũng đựoc tìm thấy trong Dunaliella Debaryomyces hansenii, Hortea werneckii giúp cho các sinh vật này thích ứng với nồng độ NaCl cao

[31]

Cũng trong nhóm các chất tương thích, các loại đường có trong hầu hếtcác tế bào sinh vật Tuy nhiên, chúng chỉ được tổng hợp chủ yếu ở thực vât, vàsinh vật tự dưỡng

Saccharose là loại đường rất phổ biến trong thiên nhiên, nó đựợc tổnghợp ở vi khuẩn lam, proteobacteria [31] Ngoài ra, nó có nhiều trong lá thân rễ

củ quả của nhiều loại thực vật (mía, củ cải đường) Enzyme tổng hợpsaccharose không có trong các vi khuẩn cổ và các vi khuẩn khác

Maltose còn được gọi là đường maltobiose hoặc mạch nha Maltose làđựợc tạo ra khi amylase phân hủy tinh bột Nó được tìm thấy trong hạt nảymầm như lúa mạch như họ phá vỡ các cửa hàng tinh bột của họ để sử dụngcho thực phẩm

Glucose là một loại đường đơn phổ biến trong cơ thể sinh vật carbohydrate quan trọng trong sinh học của tất cả các tế bào sinh vật Glucose

-là nguyên liệu chính cho quá trình hô hấp tế bào (cả hô hấp hiếu khí và hô hấpkị khí) Tương tự các loại đường khác, nó chỉ đựơc tổng hợp trong ở trong cơthể thực vật

1.4.2.3 Vai trò của các chất tương thích

Các sinh vật và tế bào sống trong các môi trường cực trị thích nghi vớiđiều kiện stress như nhiệt độ cao, thiếu nứơc, áp lực thẩm thấu cao,… bằngcách tích lũy các chất tan hữu cơ như các loại đường, các polyol, các aminoacid… Các chất này được tích luỹ trong tế bào giúp tế bào duy trì áp suấtthẩm thấu, thể tích và hàm lượng các chất cần thiết cho sự sinh trưởng và pháttriển của tế bào Ngoài ra, các chất này cũng có tác dụng bảo vệ đại phân tửdưới tác động của bất lợi của môi

trường; đảm bảo cho chúng có thể thực

hiện chức năng trong tế bào một cách tốt

nhất [23, 24, 25, 30, 36, 38] Đặc tính

bảo vệ các chất tương thích đã đựơc

nghiên cứu và ứng dụng vào bảo quản,

ổn định protein

1.4.2.4 Cơ chế ổn định protein ở nhiệt

độ cao

Có nhiều giả thuyết đựơc đưa ra

để giải thích cho hiện tượng tăng độ bền

nhiệt của protein khi bổ sung chất tương

thích ở nhiệt độ cao Tuy nhiên, chỉ có

giả thuyết “ưu đãi nước” nhận được sự

đồng thuận của nhiều nhà khoa học [29,

31, 34]

Theo thuyết này, khi bổ sung chất

tan vào dung dịch protein ở nồng độ

cao, cả nước và chất tan cùng tương tác

với protein, nhưng phân tử protein loại

trừ “ưu đãi” các chất tan ra khỏi bề mặt

của chúng, và tương tác với các phân tử

nước hình thành lớp vỏ hydrat bao

quanh Hiện tượng ưu đãi nước làm xuất

Hình 1.2 Cơ chế ổn định chất

tương thích dựa trên mô hình ưuđãi; hình dạng của protein trongnước(A), trong dung dịch cóchứa chất tương thích (B)

hiên một áp lực thẩm thấu xung quanh phân tử protein (do sự chênh lệch nồng

độ chất tan trong dung dịch và phần bao quanh phân tử protein) Áp lực nàygiúp cho cấu trúc protein gấp lại và chặt hơn, giảm bề mặt tiếp xúc của chúngvới dung dịch đồng thời kích thước của các khoang bên trong phân tử proteincũng giảm (Hình 1.3), kết qủa là giảm sự biến tính của phân tử protein dướitác dụng của nhiệt độ cao

Để giải thích cho giả thuyết ưu đãi nước và loại trừ chất tan của phân tửprotein có hai mô hình được đưa ra [34]

Mô hình 1: Bull và Brreese cho rằng các chất tương thích có thể tăngsức căng của bề mặt nước, tăng lực gắn kết giữa các phân tử nước do đó khóphá vỡ các liên kết hydro giữa các phân tử nước và giữa nước với protein

Mô hình 2: Hiện tượng loại trừ các chất tan ra khỏi bề mặt protein cóliên quan đến kích thước và hình dạng phân tử tương tác với chúng Đối lậpvới các phân tử nước (có kích thứơc nhỏ, có tính phân cực, và các liên kếthydro) dễ dàng xâm nhập vào tất cả các bề mặt của phân tử protein, đa số cácchất tan (có kích thước lớn hơn, phân tử kém linh động mặc dù có nhiều nhómliên kết hydro) nên chúng dễ bị loại trừ ra khỏi bề mặt của protein hơn

Ngoài ra, Bolen và cộng sự cũng đề xuất một giả thuyết khác giải thíchcho cơ chế ổn định enzyme ở nhiệt độ cao của các chất tương thích [21] Theogiả thuyết này, hiệu quả ổn định có nguồn gốc chủ yếu từ lực tương tác của

chất tan với các nhóm tự do của chuỗi chính ở vị trí tháo xoắn, và chuỗi bên

trong phân tử protein Những tương tác này làm cấu trúc của phân tử proteinchặt hơn, giảm entropy của phân tử và kết quả làm tăng nhiệt độ, mức nănglượng để mở xoắn của protein (Hình 1.3)

Hình 1.3 Chất tương thích làm tăng năng lượng mở xoắn protein.

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh, sự tương quan giữa cấu trúc với độbền nhiệt của protein Trên thực tế, hoạt tính xúc tác của các enzyme chịunhiệt thấp do trung tâm hoạt động kém linh hoạt

1.4.2.5 Ứng dụng của các chất tương thích

Bảo vệ các enzyme ở nhiệt độ cao

Nhiều nhà khoa học đã chứng minh khả năng ứng dụng bảo vệ enzyme củacác chất tương thích ở nhiệt độ cao

Saccharose đựơc bổ sung vào các enzyme bovine pancreas ribonucleasechymotrypsinogen and a chymotrypsin ở nhiệt độ cao có vai trò tăng nhiệt độbiến tính của chúng và có tác dụng tăng độ bền nhiệt của các enzyme được bổsung [22] Bên cạnh đó, trehalose cũng là loại đường có hiệu quả bảo vệenzyme ở nhiệt độ cao tốt Hiệu quả bền nhiệt của chúng đựoc chứng minh ởnhiều loại enzyme

Bảo quản sinh vật ở điều kiện lạnh- đông khô

Một số chất tan tương thích được sử dụng trong quá trình bảo quản lạnhnhiều loài sinh vật vi khuẩn như betain và glycerol Hiệu quả bảo quản củabetain cao tốt hơn albumin huyết thanh và trehalose dextran trong thời gian

[9] Khi tiến hành đông khô vi khuẩn có bổ sung 100 mM trehalose, 70% vi khuẩn E coli và 57% của các sinh vật B thuringiensis sống sót Bổ sung

100mM sacchaose thì 56 và 44% vi khuẩn tưong ứng còn sống sót Số lượngcao hơn khi không bổ sung đường (có 8% của vi khuẩn E coli và 14%Bthuringiensis còn sống sót) [24]

Bảo quản thực phẩm

Các loại đường như glucose , saccharose được sử dụng trong bảo quản thực phẩm bằng các gia tăng áp suất thẩm thấu của môi truờng, tạo áp xuất

thẩn thấu cao do đó làm ức chế hoạt động của các sinh vật gây hại, gây thối hỏng thực phẩm.

Ứng dụng trong sản xuất mỹ phẩm và dựơc phẩm

Ectoine có tác dụng bảo vệ da, bảo vệ tế bào Langerhan, và giảm sự tạothành các tế bào dám nắng, giữ ẩm cho da và làm cho da đỡ khô Trên cơ sở

đó, Merck KGaA, Darmstadt, đã sản xuất RonaCare™ Ectoin- kem dưỡng ẩmtrong mỹ phẩm và các sản phẩm chăm sóc da [38]

Công ty Bitop Đức phối hợp với các nhà nghiên cứu tại Cologne Đại họcClinic được khám phá việc sử dụng các chất chất tương thích trong phương phápđiều trị bệnh ung thư nhất định, bảo vệ các mô chống lại hội chứng mạch máu bị

rò rỉ, một tác dụng phụ nghiêm trọng các chất chống Caner [38]

Tạo các sinh vật chuyển gen chống lại stress

Khả năng tổng hợp các chất tương thích của các sinh vật cực trị do một

số gen trong tế bào quy đinh Vì thế, người ta đã đề xuất ra phương án chuyểncác gen đó vào các sinh vật không chịu mặn để giúp chúng chống chịu tốt hơnvới điều kiên môi trường khắc nghiệt Một số nghiên cứu chuyển gen ở thựcvật đã đượcc tiến hành như chuyển gen oxidase choline (cần thiết để tổng hợp

betain) từ Arthrobacter globiformis vào Arabidopsis thaliana cải thiện đựợc khả năng chịu lạnh chịu nhiệt, chịu mặn tốt hơn [7], chuyển gen E coli bet A

và bet B vào cây thuốc lá tăng khả năng chịu lạnh và chiu mặn [16], chèn gen

ectABC của Helongata cũng mang lại khả năng chịu áp lực thẩm thấu lớn của

tế bào trên tế bào nuôi cấy thuốc lá [28]