2. 1.Phương pháp lên men sản xuất phytase trong nồi lên men
2.2.2.1. Phương pháp xác định hoạt tính phytase
Hoạt tính phytase được xác định theo phương pháp của Shimizu và CS đề xuất năm 1992 [40]. Lượng Pvc giải phóng dưới tác động của phytase được xác định bằng dung dịch thử màu.
a. Pha dung dich thuốc thử màu
Dung dịch thuốc thử màu là dung dich chứa 4 lần thể tích dung dịch A (1,5 % amoniummolypdate ((NH4)6Mo7O24) trong 5,5 % H2SO4) và 1 lần thể tích dung dịch B (2,7 % FeSO4.7H2O). Dung dịch B được pha và sử dụng trong ngày.
b. Pha dung dịch cơ chất
Cân 0,2777 g muối phytate- Na pha trong 10ml nước cất thu được dung dịch gốc 30 mM phytate- Na.
Từ dung dich mẹ ta pha loãng 10 lần với đệm 0,1M acetate (pH= 5) thu được cơ chất phản ứng 3 mM phytate- Na.
Dung dich KH2PO4 được sử dụng để xây dưng đồ thị chuẩn P. Cân chính xác 0,136 g KH2PO4 hòa tạn vào 10ml nước siêu sạch thu được dung dịch 0,1M KH2PO4. Từ dung dịch gốc ta pha loãng thành các nồng độ 0; 0,25; 0,5; 1; 1,5 mM. Mỗi nồng độ pha loãng này lấy ra 0,3ml để thử phản ứng màu bằng cách bổ sung 0,3 ml TCA, ủ 20 phút ở 50 0C rồi bổ sung 0,6ml dung dịch thử màu. Mỗi phản ứng đựoc lặp lại 3 lần. Để ở nhiệt độ phòng sau 8 phút và
xác định OD700 nm.Từ hàm lượng P và giá trị OD700 nm tương ứng đo đựơc chúng ta xây dựng đựoc phương trình đồ thị tương quan giữa Pvc và OD700 nm ở hình 2.1:
Hình 2. 1. Đồ thị chuẩn thể hiện mối tương quan giữa hàm lượng Pvc và OD700 nm
Với hệ số tương quan R2= 0,9904 thì cho thấy x và y có mối quan hệ rất chặt chẽ, kết quả đo được là đáng tin cậy.
Quy ước: Một đơn vị hoạt tính (IU) được quy định là lượng enzyme để giải phóng 1µmol Pvc trong 1 phút ở điều kiện thí nghiệm.
d. Xác định hoạt tính phytase.
Mẫu thí nghiệm: 0,15ml dịch enzyme + 0,15ml dung dịch cơ chất (3mM phytate- Na trong đệm 0,1M acetate, pH=5) ủ ở 50 0C trong 20 phút, sau đó bổ sung 0,3ml dung dịch TCA 15 % để dừng phản ứng, tiếp theo bổ sung 0,6ml dung dịch thử màu, lắc đều hỗn hợp trong 90s, để phản ứng bền màu sau 8 phút rồi xác định OD700.
Mẫu đối chứng: tiến hành tương tự nhưng bổ sung dung dịch TCA trước khi cho cơ chất vào phản ứng.