Phương pháp kiểm tra độ bền nhiệt của enzyme

2. 1.Phương pháp lên men sản xuất phytase trong nồi lên men

2.2.2.4. Phương pháp kiểm tra độ bền nhiệt của enzyme

Mẫu thí nghiệm: Ủ 100µl hỗn hơp enzyme và chất bổ sung (50µl dịch

enzyme: 50 µl chất bổ sung) trong bể ổn nhiệt 90 0C trong 15 phút, sau đó để nguội ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Sử dụng phương pháp xác định hoạt tính được mô tả bên trên.

Mẫu đối chứng: Dịch enzyme + H2Osiêu sạch được đặt ở 4 0C trong 15 phút, sau đó để nguội ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, mẫu đối chứng được xác định hoạt tính bằng phương pháp tương tự với mẫu xử lí nhiệt.

PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu sản xuất phytase tái tổ hợp trong nồi lên men

Nhằm thu được enzyme để phục vụ cho nghiên cứu này chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu sản xuất phytase tái tổ hợp sử dụng nồi lên men 10L đồng thời nghiên cứu tái sử dụng tế bào vi sinh vật trong sản xuất enzyme. Trong nghiên cứu này, chủng nấm men được nuôi cấy trên môi trường YPD trong 24 h (pha sản xuất sinh khối), sau đó sinh khối sẽ được thu lại nhờ hệ thống máy lọc luân hồi. Toàn bộ sinh khối thu được sẽ được hòa trong 3 L môi trường 1 và nuôi cấy tiếp trong 24 h (pha sản xuất enzyme –pha I). Sau 24 h nuôi cấy sản xuất, sinh khối được thu hồi và nuôi cấy phục hồi trong môi

trường YPD trong 6 h. Sau đó sinh khối được lọc và chuyển lại vào môi trường 1 để nuôi cấy sản xuất tiếp tục trong 24 h – pha II. Kết quả của quy trình nuôi cấy sản xuất trong 2 pha được trình bày ở Hình 3.1:

Hình 3.1. Hai pha nuôi cấy sản xuất phytase trong nồi lên men

Trong cả hai pha sản xuất, hoạt tính phytase tăng dần từ thời điểm 0 h đến thời điểm 18 h, sau đó giảm ở thời điểm 21 h rồi lại tăng lại ở thời điểm 24 h. Trong pha I hoạt tính enzyme đạt giá trị cực đại (828 IU/ml) sau 18 h nuôi cấy, trong khi đó ở pha II hoạt tính enzyme đạt cực đại (670 IU/ml) sau 24 h nuôi cấy. Hoạt tính của enzyme trong pha II nhỏ hơn pha I là do mật độ tế bào nấm men trong pha II thấp hơn trong pha I. Tuy hoạt tính phytase trong pha II nhỏ hơn trong pha I nhưng nếu xét về hiệu suất giữa các pha thì pha II (22,3 IU/ml/h) lại lớn hơn pha I (14,5 IU/ml/h). Kết quả thu được trong thí nghiệm này khẳng định việc tái sử dụng tế bào nấm men tái tổ hợp P nấm men

P. pastoris X33.2000.2 trong quy trình sản xuất phytase là hoàn toàn khả thi.

Dịch enzyme thô thu để dùng cho nghiên cứu ảnh hưởng của các loại đường và polyol đến độ bền nhiệt của phytase.

3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất bổ sung đến độ bền nhiệt củaphytase thô đã loại đường khi xử lí nhiệt ở 90 0C phytase thô đã loại đường khi xử lí nhiệt ở 90 0C

3.2.1. Loại đường trong dịch phytase theo phương pháp kết tủa bằng(NH4)2SO4 và thẩm tách (NH4)2SO4 và thẩm tách

Để nghiên cứu ảnh hưởng của đường và polyol đến độ bền nhiệt của phytase cho kết quả chính xác cao, chúng tôi đã cô đặc và loại đường trong dịch enzyme thô.

Phytase sau khi được cô đặc bằng (NH4)2SO4 đồng thời loại đường trong dịch enzyme, dịch enzyme sau khi cô đặc sẽ được loại muối bằng thẩm tách. Hàm lượng protein tổng số là 1,57 mg/ml, hoạt độ riêng là 2000,8 IU/mg; hiệu suất thu hồi hoạt tính là 20%.

3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất bổ sung đến độ bền nhiệt củaphytase phytase

Chất tương thích (đường, polyol, ectoin…) là chất có khả năng bảo vệ enzyme, hạn chế sự biến tính của chúng dưới tác động của nhiệt độ cao. Tuy

nhiên, hiệu quả bảo vệ của chúng còn phụ thuộc vào bản chất của enzyme, pH, nhiệt độ và nồng độ của chúng trong dung dịch.

Hình 3.2. Ảnh hưởng của các chất tương thích đến độ bền nhiệt của phytase ở nồng độ 150mM.

Với mục đích tìm ra các chất tăng độ bền nhiệt của phytase tái tổ hợp, chúng tôi bổ sung các chất tương thích vào dịch enzyme tạo ra hỗn hợp có nồng độ chất tan là 150 mM, ủ ở nhiệt độ ở 90 0C trong 15 phút. Sau đó chúng tôi xác định hiệu quả bền nhiệt của các chất tương thích đối với enzyme phytase bằng cách xác định hoạt tính còn lại của emzyme.

Kết quả ở hình 3.2 cho thấy các hợp chất như saccharose; ectoin; trehalose; và glucose là các chất tăng độ bền nhiệt của phytase khi xử lý nhiệt ở 90 0C trong 15 phút. Glycerol không có tác dụng bảo vệ enzyme ở nhiệt độ cao. Nguyên nhân là do glycerol khi hòa tan vào trong nước thì làm giảm sức căng của nước dẫn đến giảm độ bền nhiệt của phytase trong dịch lỏng ở nhiệt độ cao [38]. Maltose và sorbitol (lần lượt) là đồng phân của saccharose và glucose nhưng không thể hiện tác dụng bảo vệ phytase ở nồng độ 150mM.

Hiệu quả bền nhiệt của ectoine tương đương với saccharose và trehalose nhưng giá thành cao hơn rất nhiều nên chúng tôi quyết định sẽ nghiên cứu kĩ hơn ảnh hưởng của các loại đường trehalose, saccharose, glucose, sorbitol và maltose đến độ bền nhiệt của enzyme.

3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ các chất bổ sung đến độ bền nhiệt của phytase

Để tìm ra chất có tác dụng tăng độ bền nhiệt của phytase tái tổ hợp khi xử lí nhiệt ở 90 0C và xác định đuợc nồng độ bền nhiệt tốt nhất. Chúng tôi tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của các nồng độ sorbitol, maltose, trehalose, saccharose, glucose đến độ bền nhiệt của phytase ở 90 0C.

Sorbitol và maltose đều là các phân tử có nhiều nhóm –OH. Tương tự như saccharose, glucose và các polyol khác; chúng có khả năng ổn định protein trong dung dich lỏng. Tuy nhiên, tác dụng bảo vệ protein còn phụ thuộc vào nhiệt độ xử lý enzyme. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của maltose và sorbitol đựoc thể hiện trong Hình 3.3 và Hình 3.4. Khi không bổ sung maltose và sorbitol hoạt tính còn lại của phytase cao hơn khi bổ sung thêm maltose và sorbitol. Vì thế, chúng tôi kết luận rằng maltose và sorbitol giảm khả năng chịu nhiệt của phytase.

Hình 3.3. Ảnh hưởng của maltose đến độ bền nhiệt của phytase khi xử lí ở 900C trong 15 phút

Hình 3.4. Ảnh hưởng của sorbitol đến độ bền nhiệt của phytase khi xử lí ở 900C trong 15 phút

Khi khảo sát ảnh hưởng của saccharose đến độ bền nhiệt của phytase chúng tôi nhận thấy, độ bền nhiệt của phytase tăng khi nồng độ saccharose bổ

Hình 3.5. Ảnh hưởng của saccharose đến độ bền nhiệt của phytase khi xử lí ở 90 0C trong 15 phút

sung vào dịch enzyme tăng (Hình 3.5). Nồng độ saccharose có tác dụng bảo vệ enzyme tốt nhấtlà 1000mM, hoạt tính còn lại là 39,82 % cao hơn nhiều so với đối chứng (21,41 %).

Hiệu quả bảo vệ của trehalose thể hiện tốt ở những nồng độ thấp từ 100mM- 400mM, nhưng từ 450mM đến 750mM thì làm giảm hoạt tính còn lại

của phytase so với đối chứng (Hình 3.6). Nồng độ trehalose có tác dụng bảo vệ phytase tốt nhất là 300mM, hoạt tính còn lại là 34,08% trong khi đó của chứng là 21,41 %.

Hình 3.6. Ảnh hưởng của trehalose đến độ bền nhiệt của phytase khi xử lí ở 90 0C trong 15 phút

Tuơng tự kết quả khảo sát của saccharose, ở nồng độ thấp tác dụng bảo vệ của glucose là không cao. Nồng độ glucose có tác dụng bảo vệ tốt nhất là 800 mM, hoạt tính còn lại là 47,35 %, cao nhất trong số các chất được sử dụng trong nghiên cứu này (Hình 3.7).

Khả năng ổn định nhiệt của phytase khi bổ sung thêm các chất như glucose, trehalose, saccharose đựoc giải thích như sau. Khi nồng độ các phân tử đường trong dịch enzyme cao, các chất tan và nước cùng tương tác với bề mặt của protein. Nhưng do sự khác nhau về kích thước phân tử nên các phân tử chất tan bị loại trừ khỏi bề mặt của phân tử protein và chỉ có các phân tử nước bao quanh bề mặt của protein (hiện tượng ưu đãi hyđrat của phân tử

Hình 3.7. Ảnh hưởng của glucose đến độ bền nhiệt của phytase khi xử lí ở 90 0C trong 15 phút

protein) làm tăng sức căng bề mặt của nước tạo áp lực làm cho cấu trúc phân tử protein vững chắc hơn, dẫn đến làm tăng năng lượng để mở xoắn phân tử protein và hạn chế sự biến tính của enzyme dưới tác dụng của nhiệt độ [30, 38].

So sánh hiệu quả bền nhiệt phytase tái tổ hợp của các chất có cùng công thức cấu tạo: glucose và sorbitol; saccharose, trehalose và maltose cho ta thấy những chất có công thức cấu tạo giống nhau nhưng cho hiệu quả bền nhiệt không như nhau. Nguyên nhân là do tính chất vật lí và hóa học của chúng khác nhau. Chúng tôi đã đưa ra giả thuyết rằng hiệu quả khác nhau của đường đựơc bổ sung vào dịch enzyme có liên quan đến nhiệt độ nóng chảy của chúng .Trong các chất được nghiên cứu ảnh hưởng đến độ bền nhiệt của phytase thì nhóm các chất sorbitol, glycerol, maltose đều có nhiệt độ nóng chảy thấp hơn nhiều so với nhóm có tăng khả năng bền nhiệt của phytase tái tổ hợp. Vì nhiệt độ nóng chảy thấp nên ở 90 0C entropy của các phân tử này tăng mạnh hơn các phân tử có nhiệt độ nóng chảy cao. Entropy của phân tử protein trong hỗn hợp có bổ sung các chất này tăng cao hơn so với nhóm còn lại. Chính vì thế sorbitol, maltose và glycerol dễ gây biến tính protein ở nhiệt độ hơn.

So sánh kết quả khảo sát của trehalose; saccharose và glucose, chúng ta nhận thấy hiệu quả bền nhiệt của các chất tại nồng độ cho hiệu quả bền nhiệt cao nhất xếp theo thứ tự tăng dần trehaolse, saccharose và cao nhất là glucose. Nhưng nếu xét hiệu quả bền nhiệt ở nồng độ thấp thì trehalose thể hiện tốt hơn hai chất còn lại.

Từ kết quả khảo sát ảnh hưởng của các loại đường đến độ bền nhiệt của phytase, chúng tôi quyết định lựa chọn glucose và sacchrarose (hai hợp chất có hiệu quả cao và giá thành rẻ) để khảo sát ảnh hưởng của chúng đến độ bền nhiệt của dịch phytase thô.

3.3. Ảnh hưởng của nồng độ glucose và saccharose đến độ bền nhiệt củaphytase thô chưa loại đường ở 90 0C. phytase thô chưa loại đường ở 90 0C.

Sau khi lựa chọn đựoc hai chất có hiệu quả bền nhiệt phytase cao. Chúng tôi tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của chúng đến độ bền nhiệt của dịch phytase thô nhằm lựa chọn ra chất và nồng độ chất bổ sung cho hiệu quả bền nhiệt tốt nhất.

Hình 3.8 cho thấy glucose và saccharose đều làm tăng độ bền nhiệt của phytase thô. Kết quả cho thấy ở một nồng độ protein nhất định thì hoạt tính

còn lại tăng khi nồng độ chất tan trong dich tăng, tuy nhiên khi nồng độ chất tan quá cao thì hoạt tính của enzyme giảm. Nồng độ glucose cho hoạt tính còn lại cao nhất là 600 mM (45,63 %); saccharose cho hoạt tính tốt nhất là 800 mM (44,27 %); trong khi đó đối chứng chỉ giữ lại được khoảng 21 % hoạt tính ban đầu.

PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

Hình 3.8. Ảnh hưởng của saccharose và glucose đến độ bền nhiệt của phytase thô không loại đường.

4.1. Kết luận.

- Có thể tái sử dụng hiệu quả tế bào nấm men trong quy trình sản xuất phytase tái tổ hợp.

- Khi xử lí phytase đã loại đường ở 90 0C, maltose, sorbitol, glycerol không có tác dụng làm tăng độ bền nhiệt của phytase ở tất cả các nồng độ khảo sát. Glucose, trehalose, saccharose là các chất có khả năng tăng độ bền nhiệt của phytase.Glucose có hoạt tính còn lại cao nhất là 47,35 % ở nồng độ 800mM, trehalose có hoạt tính còn lại cao nhất là 34,08 % ở 300mM, saccharose có hoạt tính còn lại cao nhất là 39,82 %, mẫu đấo chứng có hoạt tính còn lại là 21,41 %. Như vậy glucose có hiệu quả bền nhiệt tốt nhất.

- Glucose có tăng độ bền nhiệt của phytase thô tốt hơn saccharose .Nồng độ glucose có hiệu quả bền nhiệt tốt nhất là 600mM và hoạt tính còn lại là 45,63 %.

4.2. Đề nghị

- Nghiên cứu tạo chế phẩm enzyme có bổ sung glucose để tăng độ bền nhiệt.

- Nghiên cứu sử dụng đường để tăng cường hoạt tính của các enzyme khác.

Tài liệu tham khảo tiếng Việt

1. Nguyễn Thùy Châu (2009). Hoàn thiện công nghệ sản xuất enzym phytaza để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi và phục vụ một số ngành công nghiệp. Báo cáo dự án khoa học kỹ thuật- Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch.

2. Lê Thị Hồng (2012). Nghiên cứu ảnh hưởng kháng dinh dưỡng của phytatevà bước đầu sử dụng enzyme phytase để nâng cao giá trị dinh duỡng trong sữa đậu nành. Khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại học sư phạm Hà Nội, tr. 23-24.

3. Đỗ Thị Ngọc Huyền (2007). Nghiên cứu tính chất phytase tự nhiên và tái tổ hợp của vi khuẩn Bacillus subtilis. Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

4. Hồ Trung Thông, Đặng Văn Hồng (2009). Ảnh hưởng của việc bổ sung enzyme chứa protease, amylase và phytase vào khẩu phần đến sinh trưởng và tiêu tốn thức ăn của lợn F1 (Landrance x Yorkshire)”. Tạp chí khoa học Đại học Huế, số 55, tr. 95 - 104.

5. Trần Quốc Việt, Ninh Thị Len (2005). Ảnh hưởng của việc bổ sung enzyme thương mại vào khẩu phần đến năng suất sinh trưởng và hiệu quả sử dụng thức ăn của lợn con cai sữa và lợn nuôi thịt. Hội thảo khoa học lần thứ nhất, Chương trình hợp tác Việt Nam Thụy Điển, Hà Nội, tr. 78-86. 6. Ngô Thanh Xuân (2011). Nghiên cứu tạo phytase tái tổ hợp từ Aspergillus

niger XP trong Pichia pastoris và bước đầu ứng dụng trong chăn nuôi.

Luận án Tiến sỹ Sinh học,Trường đại học Sư phạm Hà Nội, trang 95- 100.

7. Alia H H, Sakamoto A, Murata N, (1998). Enhancement of the tolerance of Arabidopsis to high temperatures by genetic engineering of the synthesis of glycinebetaine. Plant J , 16, pp. 155-161.

8. Bois G, Bertrand A, Piché Y, Fung M, Khasa D P, (2005). Growth, compatible solute and salt accumulationof five mycorrhizal fungal species grownover a range of NaCl concentrations.Mycorrhiza, 16, pp. 99–109. 9. Cleland D, Krader P, McCree C, Tang J, Emerson, (2004). Glycinebetaine

as a cryoprotectant for prokaryotes. J MicrobiolMethods , 58, pp. 31-38. 10.Chi H, Tiller G E, Dasouki M J, Romano P R, Wang J, O'keefe R J, Puzas

J E, Rosier R N, Reynolds P R , (1999). Multiple inositol polyphosphate phosphatase: evolution as a distinct group within the histidine phosphatase family and chromosomal localization of the human and mouse genes to chromosomes 10q23 and 19. Genomics, 56, pp. 324-336.

11.Copper J R, Gowing H S , (1983). Mammalian small intestine phytase. Br J Nutr, 50, pp. 673-678.

12. Ellestad L E, Angel R, Soares Jr J H, (2002). Intestinal phytase II: A comparison of activity and in vivo phytate hydrolysis in three teleost species with differing digestive strategies. Fish Physiol Biochem, 26, pp. 259–273.

13.Fernandez J M, Hoeffler J P, (1999). Gene expression system. Acedamic press, pp. 158-191.

14.Greiner R, Konietzny U, (1996). Construction of bioreactor to produce special breakdown products of phytate. J Biotechnol, 48, pp. 153-159. 15.Gutierrez G, Abee T, Booth I R, (1995). Physiology of the osmotic stress

response in microorganisms. International Journal of Food Microbiology, 28, pp 233-244.

16. Holmstrom K O, Somersalo S, Mandal A, Palva T E, Welin B, (2000). Improved tolerance to salinity and low temperature in transgenic tobacco producing glycine betaine.J Exp Bot, 51. pp. 177-185.

17.Invitrogen, (2005). A manual of methods for expression of recombinant proteins in P.pastoris, Pichia Expression Kit. Catalog N0 K1740-s01, pp. 1- 56.

18.Jog S P, Garchow B G, Mehta B D, Murthy P P N, (2005). Alkaline phytase from lily pollen: Investigation of biochemical properties. Arch Biochem Biophys, 440, pp. 133–140.

19.Jongbloed A W, Mroz Z, Kemme P A, (1992). The effect of supplementary

Aspergillus niger phytase in diets for pigs on concentration and

apparentdigestibility of dry matter, total phosphorus, and phytic acid P.

passtoris, Pichia Expression Kit, Catalog N0 K1740-s01, pp. 1-56.

20.Kim Y O, Lee J K, Kim H K, Yu J H, Oh T K, (1998). Cloning of the thermostable phytase gene (phy) from Bacillus sp. DS11 and its overexpression in Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett, 162, pp. 185- 191.

21.Lamosa P, Turner D L, Ventura R, Maycock C and Santos H, (2003).