2. 1.Phương pháp lên men sản xuất phytase trong nồi lên men
2.2.2.3 .Phương pháp xác định protein tổng số trong dịch enzyme
a. Nguyên lý
Protein tổng số trong dịch enzyme được xác định theo phương pháp Bradford. Phương pháp dựa trên sự bắt màu của protein khi có mặt dung dịch nhuộm Bradford (thành phần chính là Coomassie Brilliant Blue G250) có tính bám đặc hiệu với các acid amin trên bề mặt của phân tử protein cần phân tích. Các phân tử thuốc thử có chứa 6 nhóm phenyl và 2 nhóm acid sulfunic. Do đó các tương tác chủ yếu xảy ra đối với các acid amin có đuôi kị nước (trytophan,
tyrosine, histidine, phenylalanine), acid amin tích điện âm (arginine, lysine) và là các liên kết yếu hoặc không đồng hóa trị.
b. Pha thuốc thử Bradford
Pha 100 mg Coomassie Brilliant Blue G 250 trong 50ml dung dịch 95% ethanol, bổ sung 100ml dung dịch 85% H3PO4. Giữ trong lọ thủy tinh bền nhiệt trong tủ 4 0C. Khi sử dụng thì pha loãng dung dịch theo tỷ lệ 1,5 Vdung dịch gốc: 8,5 VH2O.
c. Xác định đồ thị chuẩn cho BSA theo phương pháp Bradford.
Pha các dung dịch BSA có nồng độ chuẩn 0; 2,5; 5; 10; 15; 20; 25; 30 µg/ml từ dung dịch 1 mg/ml BSA. Bổ sung 0,8 ml dung dịch ở mỗi nồng độ trên vào 0,2 ml dung dịch Bradford (100 mg Coomasie Brilliant Blue G250 + 50 ml dung dịch 95 % ethanol + 100 ml dung dịch 85 % H3PO4). Giữ trong lọ màu trong tủ 4 0C. Khi sử dụng thì pha loãng dung dịch thuốc thử theo tỷ lệ 1,5 Vdung dịch mẹ: 8,5 VH2O.Ủ các hỗn hợp phản ứng mầu trên ở nhiệt độ phòng trong 5 phút sau đó đo độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595 nm trên máy đo quang phổ tử ngoại khả kiến.
Hình 2. 2. Đồ thị chuẩn thể hiện mối tương quan giữa hàm lượng BSA (µg/ml) với OD595
Từ đồ thị trên, ta có phương trình đường chuẩn y= 65,497x với y là hàm lượng BSA (µg/ml), x là giá trị OD595 tương ứng. Hệ số tương quan R2= 0,992 chứng tỏ mối liên hệ giữa y và x là chặt chẽ nên phương trình trên có thể được sử dụng để tính hàm lượng protein tổng số trong dịch enzyme.
d. Xác định hàm lượng protein có trong dịch enzyme
Pha loãng dung dịch enzyme đến các nồng độ thích hợp. Bổ sung vào 0,8ml dịch enzyme ở mỗi nồng độ trên vào 0,2ml dung dịch Bradford. Ủ các hỗn hợp phản ứng màu trên ở nhiệt độ phòng trong 5 phút sau đó đo độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 595nm. Tính toán luợng protein trong dung dịch theo phương trình đường chuẩn.