Nghiên cứu thành phần hóa học và các sắc ký dấu vân tay của thân rễ hai loài : củ gấu ( Cyperus rotundus L.) và củ gấu biển ( Cyperus stoloniferus Retz.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI NGUYỄN MINH CHÂU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ SẮC KÝ DẤU VÂN TAY CỦA THÂN RỄ HAI LOÀI: CỦ GẤU CYPERUS ROTUNDUS L.. Nhiệm vụ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

NGUYỄN MINH CHÂU

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ

SẮC KÝ DẤU VÂN TAY CỦA THÂN RỄ HAI LOÀI:

CỦ GẤU (CYPERUS ROTUNDUS L.) VÀ

CỦ GẤU BIỂN (CYPERUS STOLONIFERUS RETZ.)

Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ

Mã số: 62440114

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hà Nội - 2016

Công trình được hoàn thành tại:

Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

Người hướng dẫn khoa học:

1 TS Trần Thượng Quảng

2 TS Nguyễn Tiến Đạt

Phản biện 1: GS TS Phạm Quốc Long

Phản biện 2: GS.TS Nguyễn Hải Nam

Phản biện 3: GS.TSKH Phan Tống Sơn

Luận án được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Trường họp tại Trường Đại học Bách khoa Hà Nội

Vào hồi …… giờ, ngày … tháng … năm ………

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:

1 Thư viện Tạ Quang Bửu - Trường ĐHBK Hà Nội

2 Thư viện Quốc gia Việt Nam

I GIỚI THIỆU LUẬN ÁN

1 Mở đầu

Việt Nam là một trong những quốc gia có nền y học cổ truyền lâu đời với việc sử dụng các loại thảo dược trong phòng chữa bệnh, tăng cường sức khoẻ Một trong những dược liệu được sử dụng rộng rãi là vị thuốc Hương phụ Dược liệu Hương phụ được chế biến từ thân rễ của loài củ

gấu (Cyperus rotundus L.) Nhưng hiện nay, để phục vụ cho nhu cầu

sử dụng trong nước và xuất khẩu, vị thuốc có tên là “hương phụ” ở

Việt Nam, chủ yếu được khai thác từ loài củ gấu biển (Cyperus stoloniferus Retz.)

Tổ chức Y tế Thế giới và Bộ Y tế nước ta đã có các quy định về việc nhận dạng dược liệu cổ truyền từ nguyên liệu là thực vật với việc xây dựng các tiêu chuẩn từ nhận dạng cây, các bộ phận sử dụng đến việc đảm bảo chất lượng trong quá trình chuẩn bị nguyên liệu hay sản phẩm cuối cùng Nếu không xác định được hoạt chất thì cần phải có dấu vân tay sắc ký để xác định chất hoặc hỗn hợp các chất Chính vì vậy tác giả lựa chọn 2 loài thực vật trên làm đối tượng

nghiên cứu của luận án:

2 Nhiệm vụ của luận án

- Nghiên cứu thành phần hóa học: phân lập các hợp chất sạch từ hai loài củ gấu và củ gấu biển bằng các phương pháp sắc ký, xác định cấu trúc hóa học các chất tách được bằng các phương pháp phổ kết hợp

- Nghiên cứu sắc ký dấu vân tay: xây dựng dữ liệu vân tay sắc ký của củ gấu, củ gấu biển trên cơ sở các chỉ thị hóa học, xác định hàm lượng một số hoạt chất chính trong các mẫu củ gấu, củ gấu biển và dược liệu Hương phụ thu thập ở những địa điểm khác nhau

3 Ý nghĩa khoa học và những đóng góp của luận án

3.1 Ý nghĩa khoa học

Luận án đã đóng góp những hiểu biết mới về thành phần hóa học và sắc ký dấu vân tay của 2 loài thực vật: củ gấu, củ gấu biển ở Việt Nam

Ứng dụng những phương pháp vật lý hiện đại trong nghiên cứu cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ

3.2 Những đóng góp mới của luận án

Hai loài củ gấu và củ gấu biển ở Việt Nam lần đầu được nghiên cứu một cách có hệ thống về thành phần hóa học và dấu vân tay sắc ký

● Từ củ gấu (Cyperus rotundus L.) đã phân lập và xác định được

cấu trúc hóa học của 15 hợp chất là hexahydroxyflavane (CR1), (+)-Catechin (CR2), Eriodictyol (CR3), Luteolin (CR4), 7,4-dihydroxy-5,3-dimethoxyflavone (CR5), Hovetrichoside C (CR6), Piceatannol (CR7), Resveratrol

● Từ củ gấu biển (Cyperus stoloniferus Retz.) đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học của 12 hợp chất, đó là (S)-5,5,7-

trihydroxy-2,4-dimethoxy-6-methylflavanone (CS1), Rengasin

(CS2), -Mangostin (CS3), ()-3,5,6,7,8,4-hexahydroxyflavane (CS4), (+)-Catechin (CS5), Eriodictyol (CS6), Luteolin (CS7),

Piceatannol (CS8), Resveratrol (CS9), trans-Scirpusin A (CS10), trans-Scirpusin B (CS10), Cyperusol C (1,4-dihydroxyeudesman- 11-ene) (CS12) Trong số 12 hợp chất trên thì hợp chất CS1 ((S)-

5,5,7-trihydroxy-2,4-dimethoxy-6-methylflavanone) là hợp chất mới

 Trong số 12 chất phân lập từ củ gấu biển này có 9 hợp chất trùng với các chất phân lập được từ củ gấu

3.2.2 Về sắc ký dấu vân tay:

- So sánh thành phần hoá học của 2 loài C rotundus và C stoloniferus dựa theo kết quả phân lập và xác định cấu trúc các hợp

chất sạch kết hợp với phân tích trên hệ thống sắc ký HPTLC và HPLC

- Thiết lập được các điều kiện phân tích dấu vân tay sắc ký bằng HPLC Đánh giá độ tương đồng giữa các mẫu nghiên cứu trên kỹ thuật HPLC Kết quả cho thấy có độ tương đồng cao của các mẫu thân rễ củ gấu biển lấy từ các địa phương khác nhau (từ 0,9424 đến 0,9903) Xác định vùng trên sắc ký đồ (từ phút thứ 8 đến phút thứ 20) cho việc nhận dạng dấu vân tay sắc ký để có thể phân biệt hai loài

- Xây dựng được điều kiện định lượng 7 thành phần hoạt chất trong đối tượng nghiên cứu trên hệ thống HPLC bằng việc sử dụng các chất sạch

đã phân lập được làm chất đối chứng

II NỘI DUNG LUẬN ÁN

MỞ ĐẦU

Phần mở đầu đề cập đến ý nghĩa khoa học, tính thực tiễn, đối tượng và nhiệm vụ nghiên cứu của luận án

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

Giới thiệu sơ lược về thực vật họ Cói (Cyperaceae) Giới thiệu về chi

Cyperus L., các nghiên cứu về công dụng, hoạt tính sinh học, thành phần hóa học và sắc ký dấu vân tay của chi Cyperus L

Giới thiệu sơ lược về củ gấu và củ gấu biển Các nghiên cứu về công dụng, hoạt tính sinh học, thành phần hóa học và sắc ký dấu vân tay tại Việt Nam và trên thế giới của củ gấu và củ gấu biển

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Mẫu thực vật

Củ gấu (Cyperus rotundus L.) được thu hái tại Đông Anh, Hà Nội và

củ gấu biển (Cyperus stoloniferus Retz.) được thu hái tại Tiền Hải,

Thái Bình Các mẫu được giám định bởi PGS.TS.Trần Huy Thái Mẫu nghiên cứu dấu vân tay sắc ký bao gồm 06 mẫu củ gấu, 06 mẫu

củ gấu biển và 04 mẫu dược liệu Hương phụ được thu thập vào tháng 3 năm 2015 từ các địa điểm khác nhau

2.2 Phương pháp phân lập các hợp chất

Mẫu thân rễ củ gấu và củ gấu biển được sơ chế, phơi khô trong bóng râm, xay nhỏ, chiết siêu âm với methanol Dịch chiết cô cạn dưới áp suất giảm thu được cặn chiết methanol Hòa cặn chiết với nước,

chiết phân bố cặn chiết thân rễ củ gấu bằng n-hexane, cặn chiết thân

cặn chiết n-hexane, chloroform tương ứng, cặn chiết ethyl acetate và

cặn nước

Sắc ký cột được tiến hành với pha tĩnh là Silica gel 60 hoặc pha đảo RP-18, nhựa trao đổi ion Diaion HP-20, Sephadex LH-20

2.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất

Sử dụng các phương pháp phổ như: phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối phun mù điện tử (ESI-MS), phổ khối phân giải cao (HR-ESI- MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT), và hai chiều (HSQC, HMBC, NOESY)

2.4 Phương pháp xây dựng dấu vân tay sắc ký

Sử dụng các phương pháp sắc ký lớp mỏng và phân tích trên sắc ký lỏng hiệu năng cao

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1 Chiết và phân lập chất từ thân rễ củ gấu

Hình 3.1 Sơ đồ chiết phân bố mẫu thân rễ củ gấu

Hình 3.2 Sơ đồ phân lập cặn chiết n-hexane của thân rễ củ gấu

Hình 3.3 Sơ đồ phân lập cặn chiết ethyl acetate của thân rễ củ gấu

Hình 3.4 Sơ đồ phân lập cặn nước của thân rễ củ gấu

Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất được phân lập từ

củ gấu

Hợp chất CR1: ()-3,5,6,7,8,4-hexahydroxyflavane (Hợp chất mới)

Chất bột màu trắng SKLM pha thường: Rf = 0,45 (chloroform:methanol 5:1 v/v), hiện vết bằng thuốc thử H2SO4 10% []25D = 0,0 (c 0,1, MeOH)

IR max(KBr): 3400, 1620, 1530, 1470, 1150 cm-1

1

H-NMR (500 MHz, CD3OD):  7,23 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-2',6'), 6,80 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-3',5'), 4,60 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-2), 3,99 (1H, m, H-3), 2,89 (1H, dd, J = 5,5, 16,5 Hz, Hb-4), 2,52 (1H, dd, J

= 8,0, 16,5 Hz, Ha-4)

13

C-NMR (125 MHz, CD3OD):  82,8 (C-2), 68,8 (C-3), 28,8 (C-4), 158,3 (C-5), 157,7 (C-6), 158,3 (C-7), 157,4 (C-8), 156,9 (C-9), 100,9 (C-10), 131,5 (C-1'), 129,6 (C-2'), 116,0 (C-3'), 156,9 (C-4'), 116,0 (C-5'), 129,6 (C-6')

HR-ESI-MS m/z: 307,0810 [M + H]+ (calcd 307,0818 cho

C15H15O7)

H-16,0 Hz, Hb-4)

13

C-NMR (125 MHz, DMSO-d6):  81,1 2), 66,5 3), 27,9 4), 156,3 (C-5), 95,3 (C-6), 156,6 (C-7), 94,1 (C-8), 155,5 (C-9), 99,3 (C-10), 130,8 (C-1'), 114,6 (C-2'), 145,0 (C-3'), 145,0 (C-4'), 115,3 (C-5'), 118,6 (C-6')

H-Hz, Hb-3), 2,69 (1H, dd, J = 3,0, 17,0 Hz, Ha-3)

13

C-NMR (125MHz, CD3OD):  80,4 (C-2), 44,0 (C-3), 197,6 (C-4), 165,3 (C-5), 97,0 (C-6), 168,6 (C-7), 96,2 (C-8), 164,7 (C-9), 103,2 (C-10), 131,7 (C-1'), 114,7 (C-2'), 146,4 (C-3'), 146,8 (C-4'), 116,2 (C-5'), 119,2 (C-6')

H-6), 6,19 (1H, br s, H-8), 5,93 (1H, s, H-3)

13

C-NMR (125 MHz, DMSO-d6):  166,4 (C-2), 102,1 (C-3), 181,2 (C-4), 161,3 (C-5), 99,3 (C-6), 163,7 (C-7), 94,1 (C-8), 157,4 (C-9),

102,7 (C-10), 120,4 (C-1'), 112,8 (C-2'), 146,2 (C-3'), 151,2 (C-4'), 116,0 (C-5'), 118,8 (C-6')

H-s, H-7), 4,95 (1H, d, J = 7,0 Hz, H-1''), 3,48-3,62 (2H, m, H-6''),

3,25 (1H, m, H-2''), 3,25 (1H, m, H-3''), 3,25 (1H, m, H-5''), 3,19 (1H, m, H-4''), 2,90 (2H, m, H-b)

13

C-NMR (125 MHz, DMSO-d6):  105,5 (C-2), 192,3 (C-3), 101,3 (C-3a), 156,7 (C-4), 95,1 (C-5), 169,0 (C-6), 91,5 (C-7), 171,8 (C- 7a), 40,4 (C-b), 124,1 (C-1'), 131,2 (C-2', C-6'), 114,6 (C-3', C-5'), 155,8 (C-4'), 99,5 (C-1), 72,8 (C-2), 76,7 (C-3), 69,2 (C-4), 77,1 (C-5), 60,3 (C-6)

ESI-MS (positive) m/z 451 [M+H]+

Hợp chất CR7: piceatannol

Chất bột màu trắng SKLM pha thường: Rf = 0,3 (chloroform:methanol 4:1 v/v), hiện vết bằng UV 254, 366 nm và thuốc thử H2SO4 10%

1

H-NMR (500 MHz, CD3OD):  6,99 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2), 6,92 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-), 6,85 (1H, dd, J = 2,0, 8,0 Hz, H-6), 6,77 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-), 6,76 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5), 6,45 (2H,

d, J = 2,5 Hz, H-2, H-6), 6,17 (1H, t, J = 2,5 Hz, H-4)

C-NMR (125 MHz, CD3OD):  141,2 (C-1), 105,7 (C-2), 159,6 (C-3), 102,6 (C-4), 159,6 (C-5), 105,7 (C-6), 129,7 (C-), 127,0 (C-

d, J = 16,5 Hz, H-8), 6,28 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-12), 6,21 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-4), 6,19 (2H, d, J = 2,0 Hz, H-2, H-6), 5,32 (1H, d, J = 6,0 Hz, H-8'), 4,36 (1H, d, J = 6,5 Hz, H-7')

13

C-NMR (125 MHz, CD3OD):  130,3 (C-1), 128,7 (C-2), 116,3 (C-3), 158,3 (C-4), 116,3 (C-5), 128,7 (C-6), 130,4 (C-7), 123,7 (C- 8), 136,9 (C-9), 120,0 (C-10), 162,7 (C-11), 96,8 (C-12), 159,6 (C- 13), 104,4 (C-14), 147,4 (C-1'), 107,4 (C-2'), 159,9 (C-3'), 102,2 (C- 4'), 159,9 (C-5'), 107,4 (C-6'), 58,2 (C-7'), 94,8 (C-8'), 134,7 (C-9'), 113,7 (C-10'), 146,3 (C-11'), 146,4 (C-12'), 116,3 (C-13), 118,5 (C- 14),

ESI-MS (positive) m/z 471 [M+H]+

C-NMR (125 MHz, CD3OD):  130,9 (C-1), 114,0 (C-2), 146,4 (C-3), 146,5 (C-4), 116,3 (C-5), 119,8 (C-6), 130,8 (C-7), 123,6 (C- 8), 136,9 (C-9), 120,0 (C-10), 162,7 (C-11), 96,8 (C-12), 159,6 (C- 13), 104,4 (C-14), 147,6 (C-1'), 107,3 (C-2'), 159,8 (C-3'), 102,2 (C-4'), 159,8 (C-5'), 107,3 (C-6'), 58,0 (C-7'), 94,8 (C-8'), 134,9 (C- 9'), 113,6 (C-10'), 146,2 (C-11'), 146,3 (C-12'), 116,2 (C-13), 118,4 (C-14)

ESI-MS (positive) m/z 487 [M+H]+

Hợp chất CR11: cassigarol E

Chất bột màu vàng SKLM pha thường: Rf = 0,35 (chloroform:methanol:nước 3,5:1:0,015 v/v), hiện vết bằng thuốc thử H2SO4 10%

[]25D = +14,0 (c 0,1, MeOH)

1

H-NMR (500 MHz, CD3OD):  7,15 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-10'), 7,08 (1H, dd, J = 2,0, 8,5 Hz, H-14’), 6,97 (1H, d, J = 16,5 Hz, H-7'), 6,95 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-13'), 6,86 (1H, d, J = 16,5 Hz, H-8'), 6,67 (1H,

d, J = 2,0 Hz, H-2), 6,66 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5), 6,48 (2H, d, J = 2,0

Hz, 2,6), 6,48 (2H, d, J = 2,0 Hz, 6), 6,19 (1H, t, J = 2,0 Hz, 4), 6,17 (1H, t, J = 2,0 Hz, H-12), 6,12 (2H, d, J = 2,0 Hz, H-10, H- 14), 4,74 (2H, d, J = 2,5 Hz, H-7, H-8)

H-13

C-NMR (125 MHz, CD3OD):  129,0 1), 115,6 2), 146,1 3), 146,6 (C-4), 115,8 (C-5), 120,7 (C-6), 81,8 (C-7), 82,2 (C-8), 140,1 (C-9), 107,4(C-10), 159,2 (C-11), 103,6 (C-12), 159,2 (C-13), 107,4 (C-14), 141,0 (C-1'), 105,9 (C-2'), 159,6 (C-3'), 102,9 (C-4'), 159,6 (C-

(C-5'), 105,9 (C-6'), 128,4 (C-7'), 129,4 (C-8'), 132,6 (C-9'), 115,9 (C-10'), 145,4 (C-11'), 145,0 (C-12'), 118,1 (C-13), 121,0 (C-14)

ESI-MS (positive) m/z 487 [M+H]+

Hợp chất CR12: cyperusol C (1,4-dihydroxyeudesm-11-ene)

Chất bột màu trắng SKLM pha thường: Rf = 0,3 (n-hexane:ethyl

acetate 5:1 v/v), hiện vết bằng thuốc thử H2SO4 10%

[]25D = -42,0 (c 0,1, MeOH)

1

H-NMR (500 MHz, CDCl3):  4,72 (2H, m, H-12), 3,32 (1H, dd, J

= 4,0, 11,0 Hz, H-1), 1,75 (3H, s, H-13), 1,13 (3H, s, H-15), 0,89 (3H, s, H-14)

13

C-NMR (125 MHz, CDCl3):  79,4 (C-1), 28,5 (C-2), 40,8 (C-3), 71,6 (C-4), 53,0 (C-5), 25,8 (C-6), 45,7 (C-7), 26,4 (C-8), 40,5 (C- 9), 39,0 (C-10), 150,3 (C-11), 108,3 (C-12), 21,0 (C-13), 13,0 (C- 14), 22,8 (C-15)

ESI-MS (positive) m/z 239 [M + H]+

Hợp chất CR13: 1β,4β-dihydroxyeudesm-11-ene

Tinh thể hình kim màu trắng, mp 171-173oC SKLM pha thường: Rf

= 0,3 (chloroform:ethyl acetate:methanol 4:1:0,1 v/v), hiện vết bằng thuốc thử H2SO4 10%

13

C-NMR (125 MHz, DMSO-d6):  157,3 (C-2), 110,4 (C-3), 181,2 (C-4), 161,5 (C-5), 98,9 (C-6), 164,2 (C-7), 93,9 (C-8), 157,7 (C-9), 104,4 (C-10)

(1H, dd, J = 5,0, 15,0 Hz, Ha-1), 2,63 (1H, dd, J = 11,5, 15,0 Hz,

Hb-1), 2,10 (1H, m, H-3), 1,72 (1H, m, H-2)

13

C-NMR (125 MHz, CD3OD):  33,8 1), 40,6 2), 66,2 2a), 46,6 (C-3), 71,5 (C-3a), 42,7 (C-4), 148,6 (C-5), 138,9 (C-6), 147,5 (C-7), 107,8 (C-8), 130,2 (C-9), 126,4 (C-10), 139,3 (C-1'), 106,9 (C-2'), 148,9 (C-3'), 134,5 (C-4'), 148,9 (C-5'), 106,9 (C-6'), 104,8 (C-1''), 75,1 (C-2''), 78,2 (C-3''), 71,6 (C-4''), 77,9 (C-5''), 62,8 (C-6''), 60,2 (5-OCH3), 56,6 (7-OCH3), 56,8 (3',5'-OCH3)

(C-ESI-MS (positive) m/z 583 [M+H]+

3.2 Chiết và phân lập các hợp chất từ thân rễ củ gấu biển

Hình 3.5 Sơ đồ chiết phân bố mẫu thân rễ củ gấu biển

Hình 3.6 Sơ đồ phân lập cặn chiết chloroform của thân rễ củ gấu

biển

Hình 3.7 Sơ đồ phân lập cặn chiết ethyl acetate của thân rễ củ gấu

biển

Hình 3.8 Sơ đồ phân lập cặn nước của thân rễ củ gấu biển

Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập từ củ gấu biển

(C-141,4 (C-5'), 114,5 (C-6'), 6,9 (6-CH3), 56,9 (2'-OMe), 56,6 OMe)

(4'-HR-ESI-MS m/z: 347,1109 [M + H]+ (calcd 347,1130 cho

C18H19O7)

Hợp chất CS2: 3,4,6-trihydroxy-4-methoxyaurone

Chất bột màu vàng SKLM pha thường: Rf = 0,45 methanol-nước 10:1:0,01 v/v), hiện vết bằng UV 254, 366 nm và thuốc thử H2SO4 10%

(chloroform-1

H-NMR (500 MHz, acetone-d6): δ 7,52 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2’), 7,27 (1H, dd, J = 2,0, 8,5 Hz, H-6’), 6,90 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5’), 6,51 (1H, s, H-10), 6,40 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-7), 6,24 (1H, d, J =

2,0 Hz, H-5), 3,89 (3H, s, 4-OCH3)

13

C-NMR (125 MHz, acetone-d6): δ 147,3 (C-2), 179,8 (C-3), 160,7 (C-4), 95,2 (C-5), 168,1 (C-6), 92,2 (C-7), 169,3 (C-8), 104,9 (C-9), 110,7 (C-10), 125,6 (C-1'), 118,4 (C-2'), 146,1 (C-3'), 147,9 (C-4'), 116,4 (C-5'), 125,1 (C-6'), 56,3 (4-OCH3)

ESI-MS (positive) m/z 411 [M+H]+

Hợp chất CS4 (trùng với CR1): hexahydroxyflavane

()-3,5,6,7,8,4-Chất bột màu trắng SKLM pha thường: Rf = 0,45 (chloroform:methanol 5:1 v/v), hiện vết bằng thuốc thử H2SO4 10%

+