CHƯƠNG 7 SINH TRƯỞNG CỦA VSV

MẪU LÝ THUYẾT VỀ SỰ SINH TRƯỞNG CỦA VSV• Trong một bình kín chứa một lượng lớn môi trường dinh dưỡng, ta cấy vào đó 1 tế bào vi khuẩn.. nếu thành phần môi trường hòan tòan phù hợp với n

CHƯƠNG 7

SINH TRƯỞNG CỦA VSV

I MẪU LÝ THUYẾT VỀ SỰ SINH TRƯỞNG CỦA VSV

• Trong một bình kín chứa một lượng lớn môi trường dinh dưỡng, ta

cấy vào đó 1 tế bào vi khuẩn nếu thành phần môi trường hòan tòan phù hợp với nhu cầu của tế bào, vi khuẩn sẽ sinh trưởng, tăng khối lượng, và thể tích , tổng hợp các thành phần của tế bào, cho đến khi kích thước lớn gấp đôi Rồi vi khuẩn phân đôi thành 2 tế bào Hai tế bào tiếp tục sinh trưởng và phân chia để thành 4, 8, 16, 32,64 tế bào.

• Giá trị n ( số lần phân chia hay số thế hệ)có thể nhờ logarith thập phân:

• logN = logN 0 + n log2 Từ đó :

• n =(logN - logNo)/log2

• Giả dụ, vi khuẩn phân chia n lần sau thời gian t, khoảng thời gian giữa 2

lần phân chia liên tiếp (hoặc thời gian cần cho việc tăng đôi số tế bào)

gọi là thời gian thế hệ và biểu thị bằng g : T/N

• g = t/n= log2(t 2 -t 1 )/logN-logN 0

Thế hệ Số tế bào Số tế bào dạng lũy thừa

Thế hệ Số tế bào Số tế bào theo số mũ

• I ĐƯỜNG CONG SINH TRƯỞNG

Người ta nghiên cứu sự sinh trưởng của VSV

bằng cách phân tích đường cong sinh trưởng từ một

canh cấy vi khuẩn

Khi VSV được nuôi cấy trong môi trường lỏng, được phát triển trong một hệ thống kín (culture en

“batch” hay culture discontinue) Khi không được cung cấp môi trường chất dinh dưỡng mới trong quá trình ủ, thì số lượng chất dinh dưởng sẽ giảm và chất thải sẽ tăng Sự tăng trưởng của VSV trong hình thức sinh sản trực phân sẽ thể hiện ở biểu đồ diễn tả bằng logarithme của số lượng tế bào theo thời gian nuôi cấy Kết quả là đường cong tăng trưởng được chia thành 4 giai đoạn

phân biệt :

1 Phase tiềm phục (Phase latence

• Khi VSV được đưa vào một môi trường nuôi cấy mới, sẽ không có sự gia tăng lập tức số lương hay sinh khối tế bào - Thời kỳ này được gọi là phase tiềm phục Mặc dù không có sự phân chia tế bào, cũng như sự gia tăng sinh khối, nhưng những thành mới của tế bào bắt đầu được tổng hợp Một phase tiềm phục trước khi tế bào bắt đầu phân chia thì cần thiết bởi nhiều lý do khác nhau :

• - Tế bào già và thiếu ATP, thiếu các coenzyme cần thiết và thiếu

ribosome Các thành phần này cần phải được tổng hợp trước khi tế bào bắt đầu tăng trưởng

• - Môi trường nuôi cấy có thể khác với môi trường mà trước đây VSV

đã phát triển trong đó Trong trường hợp này tế bào có thể cần

những enzyme mới để sử dụng được những chất dinh dưỡng mới

• - VSV có thể bị tổn thương và đòi hỏi một khoảng thời gian để hồi

phục.Trong mọi trường hợp vừa nêu, tế bào đều phải được tái tổ chức, sao chép ADN, bắt đầu tăng sinh khối và cuối cùng là phân chia

• Thời gian tiềm phục dài hay ngắn là tùy từng loại VSV và bản chất môi

trường Phase này có thể rất dài nếu canh cấy đến từ một gốc vi trùng gìa hay một gốc vi trùng đã được làm lạnh Canh cấy được cấy vào một môi

trường có thành phần khác với môi trường củ thì phase tiềm phục cũng kéo dài Khi một canh trùng trẻ đang trong giai đoạn tăng trưởng cấp số mà

được chuyển sang một môi trường mới có cùng thành phần, thì phase tiềm phục sẽ ngắn, thâm chí không có.

• 2 Phase cấp số (Phase exponentielle

hay Phase logarithme)

• Trong phase này, VSV sẽ phát triển và phân chia

ở tốc độ cực đại, điều này là do khả năng di

truyền của chúng, bản chất môi trường và điều kiện nuôi cấy Vận tốc tăng trưởng không đổi

trong phase cấp số, VSV phân chia và nhân đôi trong một khoảng thời gian đều đặn Bởi vì mỗi tế bào phân chia ở thời điểm tương đối khác

nhau, nên đường cong tăng trưởng tăng từ từ

thay vì tăng đột ngột Trong phase này, dân số tế

bào đồng nhất về những tính chất hóa học, sinh lý, nên những canh cấy trong giai đoạn này

thường được dùng để nghiên cứu về đặc tính sinh hóa và sinh lý của VSV.

• 3 Phase ổn định

• Sự tăng trưởng về dân số của VSV dừng lại và đường cong tăng trưởng có dạng

nằm ngang Ở phase ổn định, mỗi loại VSV sẽ có mật độ dân số tối đa khác nhau : ở

vi khuẩn là 109 tế bào/ml, ở tảo và protozoa chỉ đạt 106 tế bào/ml Kích thước

quần thể phụ thuộc vào chất dinh dưỡng có sẵn và nhữngnhân tố khác, cũng như loại VSV được nuôi cấy Trong phase ổn định, tổng số VSV sống là một hằng số, là

do sự cân bằng về số lượng tế bào sinh ra và tế bào chết đi, hoặc đơn giản hơn là do quần thể ngừng phân chia và chỉ còn những hoạt động biến dưỡng

• Có nhiều lý do khiến dân số VSV đi vào phase ổn định Một trong những điều dễ

thấy nhất là sự giới hạn về chất dinh dưỡng Nếu một cơ chất cần thiết bị giảm

nghiêm trọng thì tăng trưởng của dân số sẽ giảm Sinh vật hiếu khí thường bị giới hạn bởi nồng độ O2 ; bởi vì O2 không dễ hòa tan và được tiêu thụ nhanh chóng nên chỉ có ở bề mặt canh trùng là có nồng độ O2 đủ cho sự tăng trưởng Những tế bào ở cách xa bề mặt sẽ không thể phát triển được, trừ phi canh cấy được khuấy trộn hay sục khí Sự tích tụ những chất thải độc hại cũng làm dừng sự tăng trưởng

Nhân tố này cũng làm giới hạn sự phát triển của VSV kỵ khí Ví dụ như

Streptococcus có khả năng tạo ra các acide amine và những acide hữu cơ khác do sự lên men đường Sự tích tụ các sản phẩm này làm môi trường trở nên acide và sự tăng trưởng sẽ bị ức chế Nhưng canh cấy của Streptococcus cũng có thể đi vào

phase ổn định là do lượng đường bị sử dụng cạn kiệt Ngoài ra còn có nhiều tác nhân tác động đồng thời cũng khiến cho dân số VSV phải đi vào phase ổn định

• 4 Phase tử vong (Phase mortalité)

• Một biến đồi có hại của môi trường- thiếu chất dinh

dưỡng, tích tụ các chất thải độc hại-sẽ làm giảm số lượng tế bào sống

• Đây là nét đặc trưng của phase tử vong Sự chết

cũngnhư sự gia tăng dân số VSV trong phase cấp số thường là theo logarithme (tỷ lệ không đổi của tế bào bị chết ở mỗi giờ) Số lượng tế bào trong phase này không thay đổi, vì tế bào không tự ly giải sau khi chết

• Có một cách duy nhất để xác định tế bào còn sống hay

đã chết, đó là cấy chúng vào một môi trường mới : nếu

chúng không phát triển và không tự phân chia, thì được xem là đã chết Mặc dù sự tử vong củaVSV cũng diễn ra theo

cấp số, nhưng sau một đợt giảm mạnh về dân số thì tử suất sẽ chậm lại Điều này

• II ĐO SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA VSV

Nhiều phương thức đo mức tăng trưởng của VSV để xác định thời gian thế hệ và vận tốc tăng trưởng

Khi theo dõi mức tăng trưởng của VSV, người ta khảo sát hai yếu tố : số lượng và sinh khối Những kỹ thuật phổ biến nhất sẽ được trình bày tóm tắt dưới đây, cùng với những thuận lợi và bất lợi của chúng

• 1 Đo số lượng tế bào

• Cách phổ biến nhất là phương pháp đếm trực tiếp số lượng tế bào

VSV bằng một buồng đếm Phương pháp này đơn giản, rẻ tiền và tương đối nhanh chóng Nó cung cấp đồng thời những thông tin về kích thước và hình thái VSV Buồng đếm Petroff-Hausser cho phép đếm số lượng vi khuẩn ; buồng đếm hồng cầu được sử dụng để đếm VSV thuộc nhóm eucaryote có kích thước lớn Buồng đềm có cấu tạo đặc biệt, gồm những phòng có chiều sâu xác định, phần đáy có kẻ ô Số lượng VSV được tính dựa trên thể tích và độ pha loãng của mẫu Kỹ thuật này có một số bất lợi :

• - Mật độ VSV cần đạt đủ độ đậm đặc, bởi vì mẫu được lấy ở một thể

tích rất nhỏ.

• - Khó phân biệt được tế bào sống và tế bào chết

• Những VSV có kích thước lớn hơn, như tảo, protozoa, nấm men

không có dạng sợi, được đếm trực tiếp bằng máy đếm điện tử, như máy đếm Coulter Cho dịch huyền phù vi khuẩn đi qua một khe nhỏ có dòng điện đi qua Mỗi lần một tế bào VSV đi qua hệ thống này thì điện trở sẽ gia tăng (hay sự dẫn điện giảm) và tế bào đó sẽ được

đếm Máy đếm Coulter cho kết quả chính xác đối với những tế bào lớn và được sử dụng rộng rãi trong các bệnh viện để đếm hồng cầu, bạch cầu Nhưng không được dùng để đếm vi khuẩn do sự lầm lẫn trong trường hợp vi khuẩn sinh ra những thành phần có thể hạt hay sự thành lập thể sợi,

• Buồng đếm và máy đếm cả những tế bào sống và chết Cũng có một số kỹ

thuật để đếm số tế bào sống, tức là những tế bào có khả năng phát triển

Đa số các kỵõ thuật, một mẫu vi khuẩn hay các loại VSV khác được pha

loãng sẽ được trải trên môi trường rắn, mỗi tế bào sẽ phát triển thành

một khuẩn lạc phân biệt Số lượng tế bào sống có trong mẫu ban đầu có thể được tính toán dự trên số khuẩn lạc tạo thành và độ pha loãng của

mẫu Ví dụ : nếu 1 ml mẫu được pha loãng ở nồng độ 106, tạo thành 150 khuẩn lạc trên dĩa thạch Như vậy mẫu ban đầu sẽ chứa khoảng 1.5 x 108 tế bào/ml Kết quả sẽ chính xác hơn nếu sử dụng một máy đếm khuẩn lạc Kỹ thuật phân lập bằng cách cấy trải trên bề mặt hay bề sâu cho phép xác định số lượng VSV trong mẫu Kỹ thuật này đơn giản, nhạy và được sử

dụng rộng rãi để đếm vi khuẩn, cũng như các loại VSV khác có trong thức ăn, nước và đất Tuy nhiên cũng có thể không chính xác trong trường hợp tế bào VSV kết thành đám, không phân tán đều trong quá trình trải Khi đó kết quả sẽ thấp hơn giá trị thật của nó Vì người ta không hoàn toàn chắc rằng mỗi khuẩn lạc được tạo thành từ một tế bào riêng rẽ, nên kết quả thường được diễn tả bằng từ “đơn vị tạo thành khuẩn lạc” (unité

formatrice de colonies-UFC) hơn là “số lượng VSV” Để có kết quả chính xác nhất, mỗi mẫu phải chứa từ 25-250 khuẩn lạc Nếu sử dụng môi trường nuôi cấy không thích hợp cho mọi VSV có trong mẫu, thì kết quả đếm sẽ thấp Cùng một mẫu nhưng nếu dùng kỹ thuật phân lập bề sâu thì đôi khi cũng cho kết quả đếm thấp hơn so với kỹ thuật phân lập trên bề mặt, là do môi trường thạch quá nóng có thể làm tổn thương hay giết chết tế bào

nhạy cảm

• Số lượng VSV thường được xác định từ những khuẩn lạc

phát triển trên một màng lọc đặc biệt, có những lỗ nhỏ đủ để giữ lại các tế bào VSV Trong kỹ thuật này, một mẫu được lọc qua màng, sau đó lấy màng ra, đặt trên

một môi trường thạch hoặc trên một miếng giấy thấm được nhúng ngập trong môi trường lỏng và ủ cho đến khi mỗi tế bào tạo thành một khuẩn lạc tách biệt

• Màng lọc đôi khi được sử dụng để đếm trực tiếp vi

khuẩn Mẫu vi khuẩn được nhuộm với phẩm fluorescent,

ví dụ như orangé d’acridine, và được lọc qua màng

polycarbonate Nucléopore Màng lọc được nhuộm đen để tạo nền Các vsv được nhuộm với orangé d’acridine sẽ có màu cam hay màu vert brillant và được đếm dễ dàng

dưới kính hiển vi huỳnh quang

• 2 Đo khối lượng tế bào

• Sự tăng trưởng của một dân số VSV bao gồm sự tăng về số lượng

cũng như về khối lượng Vì vậy, những kỹ thuật đo sự thay đổi về khối lượng tế vào cho phép theo dõi quá trình tăng trưởng

• Cách tính trực tiếp nhất là xác định trọng lượng khô của

VSV Những tế bào được nuôi cấy trong môi trường lỏng sẽ được

ly tâm, rửa, sấy và cân Kỹ thuật này được sử dụng chủ yếu để đo khối lượng của nấm Do vi khuẩn có trọng lượng rất nhỏ, nên khi sử dụng kỹ thuật này, cần phải ly tâm hàng trăm ml môi trường mới thu được đủ một lượng mẫu để tiến hành đo trong lượng

• Những kỹ thuật nhạy hơn, nhanh hơn được dựa trên cơ sở

“những tế bào vi khuẩn làm khếch tán tia sángù tơi” Trong một dân số vi khuẩn, các tế bào có kích thước tương đối đồng đều,

lượng tia sáng bị khuyếch tán sẽ tỷ lệ thuận với mật độ tế bào Khi mật độ này đạt đến 107 tế bào/ ml, môi trường trở nên hơi

đục Nếu mật độ tăng lên, môi trường sẽ đục hơn và càng có ít

ánh sáng được truyền qua hơn Lượng ánh sáng bị khuyếch tán sẽ

đo được bằng quang phổ kế Như vậy sự tăng trưởng của một dân số VSV được đo dễ dàng, với điều kiện mật độ của chúng phải

cao, đủ cho quang phổ kế có thể phát hiện được

• Nếu lượng cơ chất trong mỗi tế bào là hằng số,

thì tổng lượng các thành phần tế bào sẽ liên

quan trực tiếp tới tổng khối lượng tế bào vi

khuẩn Ví dụ như một mẫu được thu từ một thể tích đã biết của môi trường, có thể được phân tích hàm lượng protéine tổng hay N tổng Sự gia tăng dân số của VSV thể hiện ở sự gia tăng

protéine tổng Cũng vậy, việc xác định hàm

lượng diệp lục tố cho phép đo được dân số của tảo và lượng ATP được xem là chỉ số của khối lượng VSV sống

HIỆU SUẤT TĂNG TRƯỞNG VÀ NHỮNG ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT CHẤT DINH DƯỠNG GIỚI HẠN

• Khi sự tăng trưởng của VSV bị giới hạn bởi nồng độ thấp của chất dinh dưỡng cần thiết, thì sự tăng trưởng cuối cùng-hay sản lượng tế bào-sẽ tăng theo hàm lượng ban đầu của chất dinh dưỡng giới hạn Đây chính là cơ sở để đo nhu cầu về vitamine và các yếu tố dinh dưỡng khác của VSV Vận tốc tăng trưởng tăng theo nồng độ chất dinh dưỡng, nhưng sự tăng này là theo đường cong hyperbol Dạng đường cong này diễn tả vận tốc hấp thu chất dinh dưỡng bằng các protéine vận chuyển của VSV Ở một lượng chất dinh dưỡng đủ cao thì vận tốc tăng trưởng không tăng nhiều thêm nữa theo sự gia tăng nồng độ chất dinh dưỡng

• Hiệu suất tăng trưởng (Y) được diễn tả là : khối lượng vi khuẩn được sinh ra từ một

lượng chất dinh dưỡng

• Y = Khối lượng VSV tạo thành / Khối lượng cơ chất tiêu thụ

• Giá trị Y thường được tính bằng gram(gram tế bào/gram cơ chất) hay mol (gram tế

bào/ mol cơ chất) Đây là một chỉ số cho thấy tính hiệu quả trong việc chuyển hóa chất dinh dưỡng thành vật chât tế bào VSV hiếu khí trong môi trường giàu dinh

dưỡng có thể đồng hóa 20- 50% lượng đường hấp thu Trong môi trường nghèo chất dinh dưỡng, một số vi khuẩn có thể gia tăng đồng hóa đến 80% lượng đường hấp thu được

• Hiệu suất tăng trưởng của vi khuẩn lên men đã được nghiên cứu nhiều Khi vi khuẩn

phát triển trong một môi trường giàu chất dinh dưỡng, nó sẽ dùng hình thức lên men đường để tạo năng lượng, trong khi đó các cơ chất khác như acide amine được sử dụng làm nguyên liệu cho sinh tổng hợp Hiệu quả của việc sử dụng ATP trong quá trình lên men được diễn tả bằng giá trị YATP

• YATP = gram tế bào tạo thành / mol ATP sinh ra

•

• IV NUÔI CẤY LIÊN TỤC

• Đến nay chúng ta đã nghiên cứu những hệ thống

lên men được gọi là nuôi cấy kín, trong đó những yếu tố dinh dưỡng không được bổ sung và chất thải không được loại bỏ Phase cấp số chỉ diễn ra trong vài thế hệ và hệ thống nhanh chóng đạt

được phase ổn định Tuy nhiên cũng có thể nuôi cấy VSV trong hệ thống mở, trong đó điều kiện nuôi cấy được giữ không đổi bằng sự cung cấp

liên tục chất dinh dưỡng và sự loại bỏ chất thải Những điều kiện này được thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm trong hệ thống nuôi cấy liên tục Trong đó dân số VSV được giữ ở phase cấp số một thời gian dài với mật độ không đổi

• 1 Chémostat

• Hai kiểu chính trong hình thức nuôi cấy liên tục thường được

sử dụng là : Chemostat và Turbidostat

• Chédostat được cấu tạo theo cách thức là môi trường nuôi

cấy vô trùng được đưa vào bình nuôi cấy với cùng một vận tốc của dòng môi trường có chứa vi khuẩn được rút ra Môi trường nuôi cấy của Chédostat chứa một chất dinh dưỡng

cần thiết với lượng giới hạn (Ví dụ như acide amine) Do chất dinh dưỡng này bị giới hạn, nên vận tốc tăng trưởng được xác định bởi vận tốc của môi trường mới được thêm vào

trong bình nuôi cấy và mật độ tế bào sau cùng tùy thuộc vào nồng độ của chất dinh dưỡng hạn chế đó

• Vận tốc lượng dinh dưỡng được thêm vào được diễn tả dưới

dạng vận tốc pha loãng (D) Vận tốc pha loãng là vận tốc cuả dòng môi trường cho vào bình nuôi cấy, so với thể tích của bình

• D = f / V f : vận tốc của dòng môi trường

thêm vào

• V : thể tích bình nuôi cấy