ĐỊNH LƯỢNG ĐổNG THỜI INOSIN, NICOTINAMID và ACID SUCCINIC TRONG THUỐC TIÊM CYTOFLAVlN

B Y T TRNG I HC Dc H NI TRN TH THANH THY NH LNG NG THI INOSIN, NICOTINAMID V ACID SUCCINIC TRONG THUC TIấM CYTOFLAVlNđ BNG PHNG PHP SC Kí LNG HIU NNG CAQ HPLC PGS.TS Thỏi Duy Thỡn DS V Th Nguyt Minh Phũng Vt lý o lng Vin kim nghim thuc TW B mụn Húa Dc - Trng H Dc HN Thỏng 12/2007 - 05/2008 Ngi hng dn; Ni thc hin: H NI, 2008 Thi gian thc hin: Mó&MVl q> hon thnh c khoỏ lun tt nghip ny, trc ht em xin by t lũng bit ri sõu sc ti PGS.TS Thỏi Duy Thỡn, TS Trn Vit Hựng, DS V Th Nguyt Minh nhng ngi ó trc tip hng dn, ch bo cho em sut thi gian qua ớEm xin gi li cm n chõn thnh ti Ban giỏm c Viờn Kim Nghim Thuc Trung ng v ton th cỏn b Khoa Vt lý lng-Vin Kim Nghim Thuc Trung ng ó luụn giỳp v to iu kin cho em quỏ trỡnh thc hin lun cng xin chõn thnh gi li cm n Ban gim hiu, cc thy cụ trng i hc Dc H Ni, cc thy cụ v cỏn b B mụn Húa Dc, Bụ mụn húa phõn tớch ó dy d, dỡu dt, giỳp em rt nhiu quỏ trỡnh hc v nghiờn cu cui cựng em vụ cựng bit n gia ỡnh, bn bố ó luụn hờn ng viờn v giỳp em thi gian hc ti trcmg v hon thnh tt nht khoỏ un ny H Nụ, ngy thỏng 05 nm 2008 Trn Th Thanh Thỳy MC LC LềI CM - N MC LC DANH MC CH VIT TT TI LIU THAM KHO PH LC DANH MC CH VIT TT ATP ; Aờnụsin li phusphól BP 2005 : British Pharmacopoeia 2005 (Dc in Anh) CTPT : Cụng thc phõn t DVN m : Dc in Vit Nam xut bn ln th GABA : Gama amino butyric acid HDL : High density lipoprotein (Lipoprotein t trng cao) HPLC :High performance liquid chromatography ( Sc ký lũng hiu nng cao) LDL : Low density lipoprotein (Lipoprotein t trng thp) ODS : Octa decyl Silica gel PA : Purity Analysis (Tinh khit phõn tớch) PTL : Phõn t lng TEA : Triethylam V n - TT : Thuc th USP 30 The United State Pharmacopoeia 30 ( Dc in M 30 ) T VN Cựng vi s phỏt trin ca xó hi, mụ hỡnh bnh tt cỏc nc cng phỏt trin theo hng cỏc bnh lý v ung th, tim mch, t qu Xut phỏt t mụ hỡnh bnh tt ú, cỏc nh khoa hc Nga ó nghiờn cu v cho i loi thuc mi cú s phỏt minh; EP 18574ể324] CYTOFLAVTNđ l ch phm thuc tiờm vi s kt hp ca hot cht l Nicotinamid, Inosin, Acid succinic v Riboflavin vi cỏc tỏc dng chớnh: - Kớch thớch s hụ hp ca t bo v sn xut nõng lng; tng s dng oxy mụ v phc hi hot ng ca cỏc Enzym chng oxy húa - Hot húa s tnđ hp Protein ni bo, tng cng s dng glucose v cỏc acid bộof tỏi tng hp GABA noron thn kinh - Ci thin lu lng mỏu nóo v mch vnh, y mnh phc hi ý thc Vi cỏc tỏc dng nh trờn, CYTOFLAVINđ cú vai trũ quan trng di vi cc bnh v mch mỏu nóo nh tai bin mch mỏu nóo, hu qu ca t qu, nhim c v gim oxy nóo cp tớnh, nhim c mn tớnh L mt thuc phỏt mnhằ mun lu hnh ti th trng Vit Nam, CYTOFLAVINđ cn c thm nh c cp s ng ký Tuy nhiờn, DVN IU, SP 30, BP 2005 v dc in ca mt s nc khỏc ch c chuyờn lun nh ng cho mt thnh phn (Nicoựnamid v Add succinic), thm ehớ cha eú ehuyờA lun nh lng Inosin Theo tiờu ehun ca nh sn xut, Acid succinic, Inosin v Nicotinamid c nh lng bng phng phỏp HPLC nhng khụng ng thi, Hn na, quỏ trỡnh kim nghim, cỏc pic khụng n nh, hỡnh dng pic khụng p, thi gian lu di Do vy, chung tụi tin hnh nghiờn cu phng phỏp nh lng ng thi thnh phn: Inosin, Nicotinamid v Acid succinic cựng dng bo ch .Ngy nay, khoa hc k thut phỏt trin vt bc vi nhiu thnh tu c da vo ng dng v mang li nhng phng phỏp kim nghiờm nhanh, t cHớnh xỏc cao sc ký lng hiu nng cao (HPLC) l mt nhng phng php nh vy, c ng dng nh tớnh v nh lng rt nhiu loi thuc a thnh phn Vỡ vy chỳng tụi t nghiờn cu nh lng ng thi Inosin, Nicotinamid v Acid succinic thuc tiờm CYTOFLAVINđ bng phng phỏp HPLC vi mc tiờu c th: - Xõy dng v thm nh phng phỏp nh lng ng thi Inosin Nicoiinam, Acớd succnc thuc tm CYTếFLVTNr bng phng phỏp sc ký lng hiu nng cao, gúp J>hn_tờu chun húa cho sn phm CYTOFLAVTNđ^ ng dng phng phỏp nh tớnh, nh ng Nicotinamid, Inosin, Acid succinic ch phm CYTOPLAVTNđ nhm kim nghim cht lng thuc trc a th trng.PHN 1: TNG QUAN 1:1: NICOTINMID 1.1.1 i cng [2], [21] * Cụng thc: CTPT: C6H6N20 PTL: 122,1 * Tờn khoa hc: pyridin - - carboxamid * Tờn khỏc: Vitamin B3; vitamin pp, Niacinamid * Tớnh cht: Bt M tinh trng hoe tnh th khụng mu, d tan nc v ethanol, lg nicotinamid tan khong lml nc, l,5ml alcol, lOmớ glycerol Nhit núng chy: 128C-r 131c pKa (20C): 3,3 1.1.2 Túm tt mt s phớig phỏp nh lng [2], [5], [10], [21] 8 * Phiộng php chun óci - hós trừng mi trng kỡón [5], [10]: Ho tan 0,250g ch phm 20ml acid acetic khan (TT)t un núng nh nu cn thit, thờm 5ml anhyrid acetic (TT) v chun ụ bng dung dch acid percloric 0,1N vi ch th tớm tinh th n mu xanh lam lc lrnl dung dch acid percloric 0,1N tng ng vi 12,21mg C6H6N20 Phng php ny ch s dng nh lng nguyờn liu Nicotinamid * Phng phỏp chun ụ oxy húa kh (o od) [ ] : Nỡconaind tc dng vi mt lng d chớnh xỏc (CH3COO)2CLL lo mui phc xanh -12+ Cu2 * 9 Lng Cu2+ d cho phn ng hon ton vi KI d gii phúng Iod: CuJ' 4KI V-U212 **- Lng Iod gii phúng c nh lng bng natri thiosulớat vi ch th h tinh bt ti mt mu I2 + 2Na2S203 2NaI + Na2s406 * Phng phỏp o quang ph t ngoi (UV) nh lng Nicotinamid viờn nộn [5], [10]: Cõn 20 viờn, tớnh lng trung bỡnh viờn, nghin thnh bt mn Cõn lng bt viờn tng ng vi 50,0mg Nicotirmmi, chuyn vo tỡnh inh mc 100,0ml Thờm 50ml ethanol 96% lc 15 phỳt v thờm ethanol 96% ti vch, trn u, lc, b 15ml dch lc du Pha loóng 5,0ml dch lc thnh 100,0ml vi ethanol 96% v o hp th ca dung dch bc súng cc i 262nm Tớnh hm lng QH*N20 theo A'\m, ly A1%lcm = 241 Phng phỏp ny ch s dung nh lng Nicotinamid thuc n thnh phn * Phng phỏp HPLC [21J Pha ng: Dung dch Natn l-heptansulfonat 0,005M v Methanol (70:30) Ct packingLl (C18) Detector V t bc súng 254nm Tc ng: 2ml/phỳớ Th tớch tiờm: 20 1.1.3 Tỏc dng dc lý [1], [6] Sample Name ; C Data File C:\HPCHEM\l\DATA\MINH\DETAIG01.D TEST DO LAP LAI CUA HE THONG Ref-350,100 Results obtained with enhanced integrator! RetTime k' Area Select [mill] [mAU*s] ivity Height Symm [mAU] Width PlatesResol [min] ution 6.4S9 5.082146.03711 39.040770.94 0.3300 2148 7,32 764.06373 27.39305 0.74 0.4100 2503 3.79 1.4 Instrument 63/5/2S fi:3:3S PM MlNH Page of 423/11/2007 10:06:08 AM Injection Date sample Name Acq Operator Acq Method Last changed Analys is Met hod Last changed vial THU MINH c:\HPCHEM\l\METHODS\MEPRO, M 23/11/2007 09:30:52 AM by MINH {modified after loading) c:\HPCHEM\l\METHODS\DEF_LC M 13/05/2008 08:13:42 PM by MINI (modified after loading) tSignal 1.0000 1.0000 Sorted By Dilution Mult iplier signal 1: DAD1 A, sig=204,8 Ref=off Peak Eet Area [mAU*s] Tim e Typ e Wid th # [mi ni [mi n] 2.607 BP 0.1258 175.0794421.89201 S.258 SB 0.329S 4155.1S2ấ0 0,186 BB 0.4195 1520,08399 5851.33102 271,84056 Height [m&u] Area % 3.0092 71.0123 25.9785 Totals : Data File c:\HPCHEM\l\DftTA\MINH\DETAI3 03.D KIEM TRA DO I^iP LAI CUA PHUONG PHAP Sample Name: THU Data File c:\HPCHEM\l\DftTA\MINH\DETAI3 03.D KIEM TRA DO I^iP LAI CUA PHUONG PHAP Sample Name: THU 23/11/2007 10:06:08 AM Injection Date Sample Name Acq Operator Acq Method Last changed Vial i THU MINH Ê:\BPGKM\\MTH90 Đ\MEPRQ = M Analysis Method Last changed 23/11/2007 09 :33:52 AM by MItIH (modified after loading) C:\PCHEM\1\METHDS\DEF_LC M 13/05/2003 08:17:17 PM by MINH (modified after loading) Area Percent ReportSignal 0000 1.0000 Sorted By Multiplier Dilution Signal 1: DAD1 B, Siy=254r8 ReC=off Instrument 13/05/2008 08:66:26 PM MINH Instrument 13/05/2008 08:66:26 PM MINH Page of Page of Data File c:\HPCHEM\l\DftTA\MINH\DETAI3 03.D KIEM TRA DO I^iP LAI CUA PHUONG PHAP Sample Name: THU Data File c:\HPCHEM\l\DftTA\MINH\DETAI3 03.D KIEM TRA DO I^iP LAI CUA PHUONG PHAP Sample Name: THU Peak RetTime Type Width Area Height Area # [min] [min] [mAU*s] EmAU] % -I |-I -I-I -I TsÊõls 6.258 EB 8.1B6 BB 0.3292 2221,70630104.8398474.5611 0.4100758.00470 27.31376 25.4389 297õ.7110ớl :32.ĐĐ3 Results obtained with enhanced integrator Instrument 13/05/2008 08:67:26 PM MINH Instrument 13/05/2008 08:67:26 PM MINH Page of Page of Sample Name: THU !Data File c:\HPCHEM\1\DATA\MIWH\DETAI404.D KIEM TRA DO DUNG CUA FHUONG PHAP Injection 23/11/2007 01:15:21 PM Date : Sample THU Vial : Name Acq : MINH Operator Acq ; Ci\HPCHEM^l\METHQDS\ME M Method ; PRO Last changed23/11/2007 01:23:01 PM MINH : by (modified after Analysis c:\HPCHEM\1\METHODS\DEF_L Method : C.M Last changed 13/05/2008 08:22:34 PM MINH : by (modified after loading) Area Percent ReportSorted 3y Multiplier lution Signal 1.0000 1.0000 Signal 1: DAD1 A, Sig=2G4J8 Peak RetTime Type Width Area # [mini [mini [mAU*s] ReÊ=oII Height [mAU] Area % I23.31879 215.15034 7.846BE 0.1224 184-59097 SO.11575 0.3055 4232.95166 3.0958 70.9923 25.9118 0.3878 S32 BP 1545.0068 5.84SBB Totals Instrument 13/05/2003 08:23:12 PM MIWH Page of Sample Name: THU 5962.54947 298.5843 Instrument 13/05/2003 08:23:12 PM MIWH Page of 323/11/2007 01:15:21 PM Injection Date Sample Maine Acq Operator Acq Method Last changed Analysis Method Last changed Vial THU MINH G;\HPCHEH\l\METHODS\MEPR O.M 23/11/2007 01:23:01 PM by MINH (modified after loading) C:\H? CHEM\1\METH0DS\DEF_LC.M 13/05/2008 08:17:17 PM by MINH (modified after loading) ĩAĩ1 B, Sig-2S4,8 Ref=Off (MINH\DETAI404 D) mAU 100 60 60 40 Area Percent Report Sorted By Multiplier Dilution Signal o oac Signal l! DAD1 a, Peak RetTime Type o o o c # ini [m Đ I [mAU*s = -] 5.84 Height BB Area 7.84 0.3051 BB 2264,7 [mAU] % 4658 Totals : 0.3808 115.31834 74.5323 Sig-254 771.32 30,752 , B Ref==of 806 27 f 25.417 Width Area {min] 14Đ:raĐ Results obtained with enhanced integrator! Instrument 13/05/20GB 08^20:50 PM MIUH mAJ 16 14 12 ID e DAQ1.2.B63 Ă16 mAL'.Apx) of DETAI0Q1.D e ZOO 225 _250_ _275 3QQ 325 _350 _J75 _nm Print ỷf window 42: original spectruma) Original spectrum(a) p age o f Print ỷf window 42: original spectruma) natrument 11/Q5/20Q8 07 Ă55;15 PM PCH IADI, 8_S7B (ẽS&mAU - ) of DETAB01.D \ 200 225 nrn 250 27S 30C Page of 11/05/2008 07:56:43 PM PCHI 325 ' 350 11 375 [...]... được định lượng như sau: * Tiến hành định lượng Nicotinamid bằng phương phấp HPLC theo USP 30 (chuyên luận thuốc tiêm Nicotinamid) * Tiến hành định lượng đồng thời Inosin và Acid succinic bằng phương pháp HPLC với chương trinh sắc ký như sau: Cột phenyỉ-hexyl (250 X 4,6mra, 5fim) Pha động: dung dịch KH2P04 0,02M trong nước Tốc độ dòng: 0,7ml/phút Detec-tor ƯV đặt ờ 2 bước sóng: 204nin đối với Acid succinic. .. Lựa chọn bước sóng phát hiện Dựa vào phổ hấp thụ tử ngoại của InosinT Nicotinamid và Acid succinic trong môi trường pha dộng, dựa vào các tài liệu tham khảo chúng tôi chọn 204 nm là bước sóng khảo sát đối với Acid succinic, 254 nm là bước sóng khảo sát đối vói Inosin và Nicotinamid Trong chế phẩm, sư chênh lêch hàm lượng Inosin và Nicotinamid khôag lớn (Inosin: 200mgJ Nicotinamid: lOOmg) nên việc lựa... như không tan trong benzen, carbondisulfid, CC14 Nhiệt độ nóng chảy: 185°c -ỉ- 187°c Nhiệt độ sôi: 235°c pKa— 4,19 * Nguổn gốc: Acid succinic được tìm thấy trong sản phảm chưng cất của hổ phách Ngoài ra còn tìm thấy trong các hóa thạch, nấm, địa y 1.3.2 Tóm tát một số phương pháp định lượng [18], [21] * Phương pháp chuẩn độ thể tích [21]: Cân chính xác khoảng 250mg acid succinic hòa tan trong 25mỉ nước... pic trên sắc đồ VJỈ = tnxF Trong đó: F 23 23 là lưu lượng của pha động * Hệ sò dung lượng k (Capacity factor) Hệ số dung lượng cho biết khả năng phân bố của chất đó trong 2 pha I Ổ? CỊK „V.Ị k'=-^- = „ tR~t0 tg , * f =K— hoãc *'= ——— = —-1 ocVV t ị-MrM rM t t0 *0 Trong đó: Qs, QM là luợng chất tan trong pha tinh và pha động vs, VM lã thể tích của chất tan trong pha tĩnh và pha động Nếu k’ quá nhỏ thì... với Acid succinic 225nm dối với Fenoldopam Thể tích tiêm; 20)41 1.3.3 Tác đụng dược lý [16], [ 2 2 ] , [25], [26], [27] Acid succinic là thành phần chủ yếu cùa chu trình Krebs, CG vai trò cung cấp electron để tạo ra sản phẩm ỉà acid fumaric và FADH2.[pyrwsie]"- ' ứ "ị* 3 Citric acid ' , u U,'W o lSOatf«rj Ị Suctinyl-CoA Ị ^ F jmafSte «« a *> tì Ỡ Ö ũ CH}" • ST’ ií » Hình 1.1: Chu trình Kreb sAcid succinic. .. tồi không sử dụng bước sóng này để xác định Inosin và Nicotinamid & Như vậy, chương trình sắc kỷ mà chúng tôi đa tựa chọn cố các thõng sô sau: - Cột: Cột pha đảo RP IS (250mm X 4mm; lŨỊim) = Dẽtector ưv đặt ở 2 bước sóng: 204nm đối với Acid succinic và 254nm đối với Inosin và Nicotinamid X 35 - Pha động: Hoà tan 7,8g NaH-P04.2H20 và 1,5g Natrỉ heptansulfonat vào 900ml nước cất, thêm 0,3ml TEA Điều... hiệu quả sử dụng acỉd béo và glucose của tế bào = Ngoài m cấc ẽẵter của acid sueeinìe còn tạo điều kiện thuận lợi eho sự kích thích quá trình sinh tổng hợp tiền Insulin và sự giải phóng Insulin , có hiệu lực như tế bào p, táng khả rtãng đáp ứng với tác dụng gỉảm Glucose huyết của các chất, bảo vệ tế bào p khỏi độc tính, 1.4 PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG HỗN HỢP ACID SUCCINIC, INoSIN VÀ NICOTINAMID [19] Theo tiêu... dung dịch thử và đung dịch thử thèm chuẩn PHẦN H: THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Ống thuốc tiêm CYTOFLAVIN® đo SCIENTIFIC TECHNOLOGICAL PHARMACEUTICAL FIRM POLYSAN, Ltd (Nga) sản xuất, có số đãng ký tại Việt Nam VN - 5091 - 07 Công thức: Acid succinic h Nicotinamid lOOmg Inosin 200mg Riboflavin Natri phosphat 20mg Nước cất pha tiêm, tá dược... trình hổi qui tuyến tính bậc nhất thể hiện quan hệ giưa diện tích pic sắc ký và nồng độ chất phân tích: Y = ax + b Trong dó: + Hệ số góc a được tính dựa vào hàm Slope trong Microsoft Excel + Hệ số b được tính dựa vào hàm Intercept trong Microsoft Excel - Hệ số tương quan r được tính dựa vào hàm Correl trong Microsoft Excel (Vào phẩn mềm này bằng cách chọn biểu tượng của nó trên Desktop, chọn Insert/Function)... chọn phương pháp sắc kỷ: Do cả 3 chất: Inosin, Nicotinamid, Acid succinic đều là những chất tan trong nước nên nếu chọn pha động phân cực thì các chất sẽ không bị lưu giữ Mặt khác, Inosin và Nicotinamid có tính base yếu, có khả năng tạo cặp ion với một anion để tăng khả năng lưu giữ của cột nên chúng tôi chọn phương pháp HPLC tạo cặp ion sử dụng pha đảo Khi đó, Acid succinic không tạo cặp ion nên sẽ ra ... InosinT Nicotinamid v Acid succinic mụi trng pha dng, da vo cỏc ti liu tham kho chỳng tụi chn 204 nm l bc súng kho sỏt i vi Acid succinic, 254 nm l bc súng kho sỏt i vúi Inosin v Nicotinamid Trong. .. HN HP ACID SUCCINIC, INoSIN V NICOTINAMID [19] Theo tiờu chun cựa nh sn xut, thnh phn trờn c nh lng nh sau: * Tin hnh nh lng Nicotinamid bng phng php HPLC theo USP 30 (chuyờn lun thuc tiờm Nicotinamid) ... to cp on: 4- To cp vi cỏc cation: s dng cỏc anion nh acid alkyl sulfonic; acid pentan sulfonic, acid hexan sulfonic, acid heptan sulfonic, acid octan sulfonic, 21 21 + To cp vi cỏc anion: s dng