- Nguyên tắc: Nhằm giảm sai số và đạt được độ lặp lại cao, người ta dùng 1 chất chuẩn thứ 2 thêm vào chất chuẩn ngoại và mẫu thử. Chất thêm vào này gọi là chất chuẩn nội.
c.Phương pháp thêm chuẩn:
- Phương pháp này được sử dụng khi định lượng bằng HPLC cĩ ảnh hưởng của cắc chấẼ phụ (Ví dụ: ỉá dược) hoặc chất chuẩn cố nổng độ quắ nhổ.
- Dung dịch thử được thêm 1 lượng chính xác chất chuẩn rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện dung dịch thử và đung dịch thử thèm chuẩn.
PHẦN H: THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM
Ống thuốc tiêm CYTOFLAVIN® đo SCIENTIFIC TECHNOLOGICAL PHARMACEUTICAL FIRM POLYSAN, Ltd. (Nga) sản xuất, cĩ số đãng ký tại Việt Nam VN - 5091 - 07.
Cơng thức:
Acid succinic h
Nicotinamid lOOmg
Inosin 200mg
Riboflavin Natri phosphat 20mg Nước cất pha tiêm, tá dược vừa đủ 10ml.
2.1.2. Hố chất, thiết bị
a. H ố a chất
-Natri dihydro phosphat (NaH2P04.2H20) -Natri hexanesulfonat
-Triethylamin (TEA) - PA
-Acid phosphoric
-Máy sắc ký ỉỏng hiệu năng cao HP1100 với detector uv, cột Lichrosorb RP18 (250mm X 4mm)
■- Máy lắc siêu âm
mMẩy chính pH
-Các dụng cụ thủy tinh khác như pipet chính xác, bình định mức, phẽu, ống đong...
2.1.3. PhiíổBg pháp nghiên cứu
-Bàng thực nghiệm, tìm ra điều kiện sắc ký cho phép tách 3 chất tốt nhất trong thờd gian ngắn nhất. Tiến hành thu thập số liệu và xử lý thống kê để đánh giá kết quả.
-Phương pháp nghiên cứu cụ thể: HPLC
2.1.4. Các đặc trưng thống kê để xử lý kết quả
Tiến hàtìh thí Aghiệm R lầflt thu đượe ếe kết quả Xị là x2, x3...xn.
Khi đĩ: -Trung bình các kết quả: -Độ Iêch chuẩn: - Độ lệch chuẩn tương đối: ieSL>(%) = ỉ-xlOO X -Sai số chuẩn:
^(*) “ r V«
-Sai sổ Lương đối:
tas(x, s% = ^-^x!00
-Phương trình hổi qui tuyến tính bậc nhất thể hiện quan hệ giưa diện tích pic sắc ký và nồng độ chất phân tích:
Y = ax + b
Trong dĩ:
+ Hệ số gĩc a được tính dựa vào hàm Slope trong Microsoft Excel. + Hệ số b được tính dựa vào hàm Intercept trong Microsoft Excel. -Hệ số tương quan r được tính dựa vào hàm Correl trong Microsoft Excel.
(Vào phẩn mềm này bằng cách chọn biểu tượng của nĩ trên Desktop, chọn
Insert/Function).
2.2. THỰC NGHIỆM
2.2.1. Xây dưng điều kiện sắc ký
*Lưa chọn phương pháp sắc kỷ:
Do cả 3 chất: Inosin, Nicotinamid, Acid succinic đều là những chất tan trong nước nên nếu chọn pha động phân cực thì các chất sẽ khơng bị lưu giữ. Mặt khác, Inosin và Nicotinamid cĩ tính base yếu, cĩ khả năng tạo cặp ion với một anion để tăng khả năng lưu giữ của cột nên chúng tơi chọn phương pháp HPLC tạo cặp ion sử dụng pha đảo. Khi đĩ, Acid succinic khơng tạo cặp ion nên sẽ ra trước,
Với phương pháp HPLC tạo cặp ion sử dụng pha đảo với cột RP 18 như trẽn, 3 chất được tách ra hồn tồn, các pic cân đối, thời gian phân tích phù hợp (9 phút).
*Lựa chọn pha đơng:
Pha động là một trong những yếu tố quyết định hiệu suất tách sắc Jíý, nĩ quyết định thời gian lưu giữ của các chất phân tích và hiệu quả của sự tách sắc ký.
Qua việc tham khảo tài liệu và tiến hành thực nghiệm trên 1 số hệ dung mỏi phân cực khác nhau, chúng tơi đã thấy rằng với pha động được pha như sau: hồ tan 7,8g NaH2P04.2H20 và lt5g natri heptansulfonat, thêm 0,3ml TEA trong 11 nưỚG Yầ điểu ehỉnh pH về Z