Thực hành công nghệ protein - enzyme

Thực hành công nghệ protein - enzyme

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

TH CÔNG NGHỆ PROTEIN-ENZYME

CHUYÊN NGÀNH: Công Nghệ Sinh Học Ứng Dụng

NIÊN KHÓA: 2012 – 2015

SVTH: Nhóm 3 (C8UD1)

MỤC LỤC

M C L C HÌNH Ụ Ụ

M C L C B NG Ụ Ụ Ả

BÀI 1: ĐỊNH LƯỢNG NITƠ ACID AMIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHUẨN ĐỘ FORMOL (PHƯƠNG PHÁP SORENSEN)

1/ Nguyên tắc

Các aldehyde dễ kết hợp với nhóm amin Khi cho formaldehyde tác dụng với acidamin, nhóm amin bị methylen hóa tạo thành dẫn xuất methylen amino acid Hợpchất tạo thành có tính acid mạnh hơn acid amin tự do, các nhóm carboxyl củachúng dễ dàng định phân bằng kiềm, qua đó gián tiếp tính được lượng nitơ amincủa các acid amin có trong dung dịch

• Dung dich A: 27,8 g Na2HPO4 hoà tan trong 1000ml

• Dung dịch B: 53.05g Na2HPO4 7H2O hoặc 71.1g Na2HPO4.12H2O pha trong1000ml

• Để pha dung dịch đệm phosphate pH =7 hút dung dịch A và dung dịch B theo tỷ lệsau: Dung dich A: 39 ml + dung dich B: 61ml thêm nước vừa đủ 200ml

Dung dịch đệm phosphate pH = 9,2 : 50ml

- Cho vào bình thứ hai: 20ml dung dịch có pH 9,2; 5 giọt bromthymol blue 0,04%

và 3 giọt phenolphtalein 0,5% có màu tím xanh (màu xanh ánh tím)

Màu của các dung dịch trên giữ trong bình kín có thể bền trong nửa tháng

Hình 1.1 Dung dịch Ph 9,2 (bên trái), pH 7,0 (phải)

Xác định hàm lượng nitơ amin trong nước mắm :

Nước mắm là một dung dịch thủy phân protein có thể định lượng nitơ bằng phươngpháp chuẩn độ formol Do nước mắm có màu tối cần phải pha thật loãng mới có thể somàu của chất chỉ thị

Lấy 1ml nước mắm cho vào bình định mức 100ml, dùng nước cất định mức thành100ml, lắc đều

Lấy vào bình erlen có cùng dung tích với 2 bình màu chuẩn 20ml dịch mẫu pha loãng

từ bình định mức, thêm 5 giọt bromthymol blue Nếu dung dịch có màu xanh dương thìthêm từng giọt HCl hay H2SO4 0,05N; nếu dung dịch có màu vàng thì thêm từng giọtNaOH 0,05N cho đến khi dung dịch có màu ứng với màu của bình 1 có pH 7,0

Thêm 3 giọt phenolphtalein 0,5%; 4ml formol trung tính rồi chuẩn độ bằng NaOH0,05N cho đến khi hỗn hợp có màu ứng với màu của dung dịch trong bình 2 có pH 9,2 Song song tiến hành làm thí nghiệm kiểm chứng, thay dung dịch nghiên cứu bằng nướccất

2.4 Kết quả

Số gram nitơ acid amin có trong 1 lít nước mắm:

7,231(g)Trong đó:

x: lượng gram nitơ acid amin có trong 1 lít nước mắm

a: số ml dung dịch NaOH 0,05N dùng để chuẩn dung dịch thí nghiệm

b: số ml dung dịch NaOH 0,05N dùng để chuẩn dung dịch kiểm chứng

T: hệ số hiệu chỉnh nồng độ của dung dịch NaOH đem dùng so với nồng độ chuẩn V: số ml nước mắm cho vào bình định mức

0,0007: số gram nitơ với 1ml NaOH 0,05N

BÀI 2: PHẢN ỨNG BIURE

1/ Nguyên tắc

Đây là phản ứng thường dùng để phát hiện liên kết peptide (-CO-NH-) Phản ứngxảy ra đối với các chất chứa từ hai liên kết peptide trở lên Phản ứng này dùng đểđịnh lượng protein bằng cách lập đồ thị chuẩn với các dung dịch protein chuẩn cónồng độ xác định nhờ kỹ thuật so màu Nồng độ protein tối thiểu để định lượngchính xác là 10mg/ml

Tùy thuộc vào gốc R mà màu phản ứng có thể là màu xanh tím, tím hoặc hồng

giọt dung dịch CuSO4 1% Lấy ống nghiệm thứ hai cho 1ml dung dịch lòng trắngtrứng, 1ml dung dịch NaOH 10%, thêm 2 – 3 giọt CuSO4 1%, lắc đều cómàu tím

2.4 Kết quả

Chụp hình, ghi màu và viết phương trình phản ứng của 2 phản ứng trên

Hình 2.1: Ống 1 (phải, Biure), Ống 2 (trái, albumin)

Ở ống 1 (BIURE): Khi đun ure trên ngọn lửa đèn cồn thì ta thấy tinh thể ure tan,bay hơi một ít rồi kết tinh lại (khí NH3 bay hơi) Nhưng sau đó khi cho 1-2ml dungdịch NaOH 10% vào thì ta thấy tinh thể ure tan ra tạo thành dung dịch lỏng khôngmàu Khi lắc rồi cho thêm dung dich CuSO4 1% vào thì dung dịch hóa màu hồngnhạt

Acide cianuric nhỏ NaOH 10% Urea đun NH3 (bay hơi) cianuric được trung hòa) Biure (2 phân tử Ure kết hợp tạo thành) làm xuất hiện liên kết peptide (-CO-NH-) Trong môi trường kiềm Biure +CuSO4 cho phức muối Cu có màu tím hồng

Ống 2: Trong dung dich lòng trắng trứng (Albumin) cũng có liên lết peptide nên

cũng có phản ứng Biure tạo phức hợp muối Cu với polypeptide có màu tím xanh.Trong môi trường kiềm mạnh, liên kết peptide trong phân tử protein phản ứng vớiCuSO4 tạo thành phức chất màu tím hoặc mà tím đỏ Tùy theo độ dài của mạchpeptide mà màu của phức sẽ biến thiên từ xanh tím đến tím đỏ

BÀI 3: XÁC ĐỊNH ĐIỂM ĐẲNG ĐIỆN CỦA PROTEIN CASEIN

1/ Nguyên tắc

Các phân tử protein là các polymer có tính điện ly lưỡng cực Trong dung dịch, khi

pH thay đổi nó phân ly tạo thành các nhóm tích điện dương và các nhóm tích điện

âm khác nhau Đối với mỗi protein sẽ có một giá trị pH xác định mà tại đó tổng sốđiện tích âm bằng tổng số điện tích dương, khi đó phân tử protein trung hòa vềđiện, pH đó gọi là điểm đẳng điện của protein Tại điểm đẳng điện, dung dịchprotein không bền, dễ bị kết tủa

2/ Thực hành

1.1 Nguyên liệu và hóa chất

- Dung dịch acid acetic (CH3COONa) 0,1N : 200ml

- Dung dịch natri acetate (CH3COONa) 0,1N : 50ml

- Dung dịch casein 0,4%: Cân 0,4g casein cho vào becher 100ml và thêm 20mldung dịch CH3COONa 0,1N Đặt lên nồi cách thủy đun nóng để hòa tan hoàn toàn.Chuyển sang bình định mức 100ml và định mức tới 100ml bằng dung dịch

Ở ống nghiệm có nhiều kết tủa nhất là điểm đẳng điện của Casein

Chụp hình và ghi lại kết quả xác định pH đẳng điện của Casein

Hình 3.1 Thí nghiệm điểm đẳng điện của casein từ trái sang phải (1,2,3,4, và 5).

BÀI 4: SO SÁNH TÁC DỤNG XÚC TÁC CỦA ENZYME VỚI XÚC TÁC VÔ CƠ

1/ Nguyên tắc

Chất xúc tác là chất làm cho phản ứng xảy ra nhanh hơn nhưng không bị tiêu haotrong quá trình phản ứng Enzyme là các chất xúc tác của các hệ thống sinh học.Chúng có khả năng xúc tác đặc biệt, thường mạnh hơn nhiều so với các chất xúc táctổng hợp Tác dụng xúc tác của chúng mang tính đặc hiệu cao đối với cơ chất, làmtăng đáng kể tốc độ các phản ứng hóa học xảy ra trong môi trường nước ở điều kiệnnhiệt độ và pH ôn hòa

2.3 Tiến hành

Lấy 4 ống nghiệm đã ghi số, mỗi ống 2ml dung dịch tinh bột 10% Sau đó thêmvào:

- Ống thứ nhất : 10ml nước cất

- Ống thứ hai : 10ml dung dịch enzyme amylase

- Ống thứ ba : 10ml dung dịch enzyme amylase

- Ống thứ tư : 10ml dung dịch HCl 1%

Sau đó đặt các ống nghiệp thứ nhất và thứ hai ở nhiệt độ phòng, ống thứ ba vào tủ

ấm 600C Đặt ống thứ tư vào nồi cách thủy đang sôi Sau 10 phút lấy các ốngnghiệm ra, cho vào mỗi ống 5ml thuốc thử Lugol Đặt cả 4 ống vào nồi cách thủytrong 2 phút Lấy ra làm nguội vàquan sát hiện tượng trong các ống nghiệm

Hình 4.1: Ống 1,2,3,4 (từ trái sang phải) sau quá trình làm nguội 30 phút

Nhận xét phản ứng Lugol:

Ống 1: Cho ra phức xanh có màu đậm nhất

Ống 2: Cho ra phức có màu xám nhạt có sự phân cách rõ ràng (lớp dưới màu trắng đục)

Ống 3: Cho ra phức có màu xám

Ống 4: Cho ra phức xám trong có sự phân cách (lớp dưới màu trắng trong)

Giải thích

Ở ống 1: Màu xanh lam xuất hiện khi thuốc thử lugol tiếp xúc tinh bột, bởi vì thành

phần chính của thuốc thử lugol là iôt và kali-iôt (KI) Do cấu tạo dạng mạch xoắn

có lỗ rỗng tinh bột hấp thu iod cho màu xanh đặc trưng ở điều kiện thường, khi cótác dụng nhiệt độ thì mất màu do iod tách ra khỏi tinh bột ở trạng thái tự do dẫn đến

I2 thăng hoa làm mất màu xanh, làm lạnh có màu xanh trở lại là do còn một số iodbàm trên thành ống nghiệm hấp thu trên phân tử tinh bột làm màu xanh xuất hiệntrở lại

Ở ống 2,3:

Thủy phân Tinh bột + Lugol (iod, KI) cho màu xanh

Tinh bột (Glucose, Maltose, Maltodextrin, Acrodextrin) + Lugol Amylase Amylodextrin + Lugol cho màu tím

Erythrodextrin + Lugol cho màu tím đỏ

Ở ống 4: Ở 100oC Tinh bột sẽ bị thủy phân bởi HCl Sau đó lượng tinh bột còn dư tiếp tục phản ứng với Lugol cho ra phức có màu xanh

 Tất cả các phản ứng sinh hóa trong tế bào sinh vật đều được thực hiện trong điềukiện ôn hòa, không đòi hỏi nhiệt độ cao (Enzyme xúc tác vô cơ Amylase) nhưngtốc độ phản ứng vẫn mạnh hơn so với Enzyme xúc tác hữu cơ (HCl) phải cần ởnhiệt độ thích hợp thì phản ứng mới xảy ra

BÀI 5: TÍNH ĐẶC HIỆU CỦA ENZYME

1/ Nguyên tắc

Tính chất đặc hiệu là biểu hiện khả năng xúc tác của enzyme đối với cơ chất nhấtđịnh Enzyme có tính đặc hiệu rất cao Tính chất đặc hiệu của enzyme cho thấy sựkhác biệt rất lớn giữa enzyme với các chất xúc tác khác Mỗi loại enzyme chỉ cókhả năng xúc tác cho sự chuyển hóa một hay nhiều chất nhất định theo một kiểuphản ứng nhất định Tính chất đặc hiệu của enzyme biểu hiện ở một số kiểu đặchiệu sau:

Đặc hiệu kiểu phản ứng: mỗi enzyme chỉ xúc tác cho một kiểu phản ứng chuyển

hóa nhất định trong các kiểu phản ứng như phản ứng oxy hóa khử, phản ứng

chuyển bị, phản ứng thủy phân…

Đặc hiệu kiểu cơ chất: có 3 kiểu đặc hiệu cơ chất

- Đặc hiệu tuyệt đối: mỗi enzyme chỉ xúc tác đối với một cơ chất nhất định

- Đặc hiệu tương đối: mỗi enzyme chỉ xúc tác đối với một kiểu liên kết hóa học nhất định

- Đặc hiệu quang học (đặc hiệu lập thể): mỗi enzyme chỉ xúc tác đối với một dạng đồng phân quang học của cơ chất (cis hoặc trans)

Lấy 4 ống nghiệm đã ghi số, sau đó thêm vào:

- Ống thứ nhất: 2ml dung dịch hồ tinh bột 5% + 1ml dung dịch enzyme amylase

- Ống thứ hai: 2ml dung dịch hồ tinh bột 5% + 1ml dung dịch enzyme bromelin

- Ống thứ ba: 2ml dung dịch casein 2% + 1ml dung dịch enzyme amylase

- Ống thứ tư: 2ml dung dịch casein 2% + 1ml dung dịch enzyme bromelin

Lắc đều và để vào tủ ấm ở 600C trong 15 phút Lấy ra, cho vào ống nghiệm thứ nhất

và thứ hai mỗi ống 02 giọt thuốc thử Lugol.Cho ống thứ ba và thứ tư mỗi ống 02 giọt thuốc thử Folin

2.4 Kết quả

Chụp hình và ghi kết quả vào bảng sau:

B ng 5.1 ả B ng k t qu thí nghi m xác đ nh tính đ c hi u c a enzymeả ế ả ệ ị ặ ệ ủ

Nhận xét về tính đặc hiệu của Enzyme

Hình 5.1: Ống 1,2,3 và 4 từ trái sang phải sau quá trình thí nghiệm

 Giải thích:

Ống 1: : Màu xanh lam xuất hiện khi thuốc thử lugol tiếp xúc tinh bột, bởi vì thành

phần chính của thuốc thử lugol là iôt và kali-iôt (KI) Do cấu tạo dạng mạch xoắn

có lỗ rỗng tinh bột hấp thu iod cho màu xanh đặc trưng ở điều kiện thường

Enzyme amylase Glucose

Tinh bột Maltose

Thủy phân Maltotetrose

• Ống 3: Enzyme amylase không thủy phân Casein

• Ống 4: Enzyme bromelin thủy phân cơ chất casein Quá trình thủy phân sơ bộ sẽ cho ra Polypeptide và acid amin

Các chất kìm hãm hoạt động của enzyme thường là các chất có mặt trong phản ứngenzyme, làm giảm hoạt tính enzyme những không bị enzyme làm thay đổi tính chấthóa học, cấu tạo hóa học và tính chất vật lý của chúng Các chất gây kìm hãm hoạtđộng của enzyme bao gồm các ion, các phân tử vô cơ, các chất hữu cơ và cảprotein

- Chất kìm hãm cạnh tranh: là những chất có cấu trúc tương tự như cấu trúc của cơchất Chúng thường là chất kiềm hãm thuận nghịch Chúng có khả năng kết hợp vớitrung tâm hoạt động của enzyme và chiếm lấy vị trí của cơ chất trong trung tâmhoạt động

- Chất kìm hãm không cạnh tranh: những chất này không chiếm trung tâm hoạtđộng của enzyme mà liên kết với vị trí ngoài trung tâm hoạt động làm thay đổi cấutrúc không gian của phân tử enzyme theo chiều hướng bất lợi cho hoạt động xúctác

2/ Thực hành

2.1 Nguyên liệu và hóa chất

- Enzyme amylase : 50ml

- Ống thứ hai: 10ml dung dịch NaBr 0,5%

- Ống thứ ba: 10ml dung dịch CuSO4 0,5%

Sau đó cho vào cả ba ống mỗi ống 10ml dung dịch enzyme amylase Lắc đều và để

Tiếp tục cho vào mỗi ống 2ml dung dịch Fehling và đặt vào bể điều nhiệt đang sôitrong 2 phút, làm nguội tới nhiệt độ phòng.

Hình 6.1: Ống 1,2 và 3 từ trái sang phải sau quá trình thí nghiệm.

 Nhận xét:

• Ống 1: Xuất hiện màu xanh nhạt nhất => tốc độ hoạt hóa của chất hoạt hóa yếu vìnước cất không phải là chất kìm hãm hay kích thích cho quá trình thủy phân tinhbột

• Ống 2: Xuất hiện màu xanh trung bình =>dung dịch NaBr có tác dụng kích thíchcho phản ứng thủy phân ở mức độ trung bình

• Ống 3: Xuất hiện màu xanh đậm nhất =>dung dịch CuSO4 có tác dụng kìm hãmlàm phản ứng thủy phân chậm lại

BÀI 7: XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CỦA ENZYME LIPASE

- Bể điều nhiệt : 1

- Buret 25ml : 1

- Bercher 100ml : 4

- Pipet 5ml : 2

- Pipet 10ml : 2

- Cối sứ : 1

- Bếp điện : 1

2.3 Tiến hành

Chuẩn bị chế phẩm lipase từ tuỵ tạng động vật: Cân 1g tụy tạng động vật, cho vào cối nghiền 5ml hỗn hợp nước – glycerin (tỷ lệ 3:1), nghiền kỹ từ 3 – 5 phút Sau đó, lại cho thêm 5ml hỗn hợp nước – glycerin và nghiền tiếp 1 h2 phút Lọc vắt hỗn hợp qua vải màn, sau đó lọc lại qua giấy lọc, thu dịch lipase để làm thí nghiệm

Xác định hoạt tính của enzyme lipase:

Lấy 02 erlen 100ml, cho vào mỗi bình 10ml sữa tươi

- Erlen 1 (erlen thí nghiệm): cho vào 2 ml lipase, lắc đều, đặt vào bể điều nhiệt ở

370C – 400C trong 1 giờ

- Erlen 2 (erlen đối chứng): đun sôi sữa trong bình, sau đó cho ngay 2ml lipase vào

và đun sôi tiếp 5 phút Để nguội đến nhiệt độ phòng Sau đó đặt vào bể điều nhiệt ở

370C – 400C trong 1 giờ Sau 1 giờ lấy erlen ra, thêm vào mỗi bình 8ml cồn 96%, vài giọt phenolphtalein, chuẩn độ cả hai erlen bằng KOH 0,1N

CKOHt : Nồng độ dung dịch KOH thực tế

VKOHt : Thể tích dung dịch KOH thực tế

CKOHp : Nồng độ dung dịch KOH pha

VKOHp : Thể tích dung dịch KOH pha

Hoạt độ lipase: được biểu thị bằng số ml KOH đã dùng để chuẩn độ acid béo tạo

thành từ sự thủy phân lipid có trong 1 lít sữa và được tính theo công thức sau:

X= (V 1 - V 2 ) x k x 100/3

X= (3,3- 2,6) x 1 x 100/3 = 23,3333 UI

Trong đó:

X : Hoạt độ của enzyme lipase (UI)

V1 : Số ml KOH 0,1N đã dùng để chuẩn độ erlen thí nghiệm (erlen 1) V2 : Số ml KOH 0,1N đã dùng để chuẩn độ erlen đối chứng (erlen 2)

k : Hệ số hiệu chỉnh của dung dịch KOH (k = 1)

Hình7.1: Kết quả sau chuẩn độ của đối chứng và mẫu

PHẦN TỰ THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM XÁC ĐỊNH NHIỆT ĐỘ TỐI THÍCH CỦA ENZYME ASCOBATOXIDASE

- Cách pha dung dịch đệm phosphate pH 7:

o Dung dich A: 289 g NaH2PO4 hoà tan trong 80ml

o Dung dịch B: 8,53g Na2HPO4.12H2O pha trong 120 ml

o Để pha dung dịch đệm phosphate pH =7 hút dung dịch A và dung dịch B theo tỷ

lệ sau: Dung dich A: 80ml + dung dich B: 120ml

2.2 Dụng cụ

- Cối sứ : 1

- Becher 50ml : 2

- Becher 100ml : 2

- Erlen 100ml : 3

- Bình định mức 50ml : 2

- Erlen 250ml : 4

- Buret 25 ml : 1

- Pipet 5ml : 2

- Pipet 10ml : 2

- Giấy lọc : 4

-Phễu lọc : 2

2.3 Tiến hành

 Chiết t á ch enzym ascobatoxidase: Cân 30g dưa chuột (bỏ hạt) cho vào cối sứ,

nghiền với 10 – 15ml dung dịch đệm phosphat 0,15M pH 7 Dịch chiết được cho vào bình định mức 50ml và thêm dung dịch đệm đến vạch định mức Lắc đều nhiều lần và để yên trong 1 giờ Lọc thu dịch lọc Dịch lọc là chế phẩm enzym ascobatoxidase

 Khảo s á t nhiệt độ tối thích enzym ascobatoxidase:

B ng 7.1: Cách ti n hành thí nghi mả ế ệ

Mẫu

(Bình

erlen)

Đối chứn g (Đun sôi)

Nhiệt độ ( 0 C)

Acid ascorbic (ml)

KI 10%

(ml)

HCl 5%

(ml)

Hồ tinh bột (giọt)

KIO 3

0,01N (ml)

Lắc đều, để yên 5 phút rồi chuẩn độ bằng dung dịch Na2S2O3 0,01N đến khi mấtmàu xanh

Xác định hệ số hiệu chỉnh của Na 2 S 2 O 3 0,01N bằng dung dịch KIO3 0,01N chuẩn (tương tự như cách xác định hệ số hiệu chỉnh của dung dịch KOH 0,1N)

k : Hệ số hiệu chỉnh của dung dịch Na2S2O30,01N

0,088 : Số mg acid ascorbic tương ứng với 1 ml dung dịch Na2S2O30,01N

m : Khối lượng nguyên liệu để chiết enzym (g)

t : Thời gian phản ứng (phút) 0C

B ng 8.1: Nhi t đ và ho t đ c a Acid Ascobatoxidase sau quá trình thí nghi m.ả ệ ộ ạ ộ ủ ệ