Sản xuất vaccin ăn viêm gan b trên cây cà chua nhờ agrobacterium tumefaciens

Sản xuất vaccin ăn viêm gan b trên cây cà chua nhờ agrobacterium tumefaciens Sản xuất vaccin ăn viêm gan b trên cây cà chua nhờ agrobacterium tumefaciens Sản xuất vaccin ăn viêm gan b trên cây cà chua nhờ agrobacterium tumefaciens Sản xuất vaccin ăn viêm gan b trên cây cà chua nhờ agrobacterium tumefaciens

ĐỀ TÀI: Sản xuất vaccin ăn viêm gan B cà chua nhờ Agrobacterium tumefaciens GVHD NHĨM Ngơ Thái Bích Vân Định nghĩa Vaccine ăn từ thực vật vaccine tiểu phần protein làm kháng ngun mong muốn tác động vào thể dịch, kích thích hệ thống miễn dịch thể dịch miễn dịch tế bào Vaccine ăn có hoạt tính tương tự vaccine thơng thường, khác vacine thực vật sản xuất phần ăn lá, củ, quả, hạt Ưu điểm vaccin ăn -Dể dàng tăng qui mơ sản xuất dể thu sinh khối -Tính ổn định cao,dễ bảo quản sử dụng -Tính ăn - Tính an tồn - Vaccine ăn kích thích sản xuất kháng thể hệ thống miễn dịch hiệu vaccine tiêm NGUN LÝ SẢN XUẤT VACCINE ĂN ĐƯỢC -Lựa chọn gen cần biểu (gen quan tâm) đưa vào vector thích hợp -Lựa chọn đối tượng thực vật thích hợp để chuyển gen -Chuyển vector tái tổ hợp mang gen quan tâm vào thực vật lựa chọn phương pháp chuyển gen khác -Kiểm tra biểu gen quan tâm phận ăn thực vật -Thử nghiệm khả đáp ứng miễn dịch vaccine sản xuất từ thực vật -Sử dụng vaccine thử nghiệm thành cơng cách ăn tươi dạng thức ăn chế biến Gen lấy từ nguồn bệnh người chuyển vào vi khuẩn gây nhiễm thực vật Vi khuẩn nhiễm vào mẫu Mầm tạo đựoc từ mẫu mang gen bệnh người Khi ăn gây phản ứng miễn dịch mầm bệnh Viêm gan B: virus viêm gan B     - Viêm gan B (viêm gan virus B) bệnh phổ biến lây lan mạnh người Theo WHO (tổ chức y tế giới) cho biết hàng năm có tỷ người nhiễm virus viêm gan B, khoảng 300 triệu người mang virus mãn tính hậu triệu người chết/ năm - Ở Việt Nam, 100 người có 15 26 người nhiễm virut viêm gan B có tới q nửa trẻ em 15 tuổi Nước ta vùng lưu hành cao bệnh viêm gan siêu vi B (HBV) Tỷ lệ người mang mầm bệnh vào khoảng 10-15 % dân số (trên 10 triệu người)  Tình trạng nhiễm gây nhiều hậu nghiêm trọng Bệnh lây lan theo hướng đa dạng phức tạp, trường hợp bệnh mạn tính dẫn đến x gan ung thư gan, thời gian chữa trị kéo dài chi phí điều trị cao so với thu nhập  Cách tốt phòng ngừa biện pháp phòng ngừa quan trọng chủng ngừa Tuy nhiên, chi phí cho chủng ngừa bệnh cao tn thủ phác đồ điều trị tiêu chuẩn (tiêm nhiều mũi cách qng thời gian) Cấu trúc virus HBV Kích thước, đặc tính  HBV lồi virus nhỏ, đường kính 42-45 nm  HBV bền vững với nhiệt độ: nhiệt độ 100oC virus HBV sống 30 phút, -20oC sống tới 20 năm  HBV kháng ete (eter), bất hoạt formalin (fócmon) Cấu trúc virus gồm: - Lõi acid nucleic: ADN ARN - Vỏ protein - Vỏ capsit: chuỗi đơn kép phân tử protein cấu trúc, phân tử tạo nên capxome Mỗi loại virus có loại capxome khác Cơ chế chuyển T-DNA agrobacterium vào tế  Agrobacterium mang plasmid gây khối u thực bào vật chứa gen vir vùng gen cần vật,thực plasmid chuyển (T-DNA)  Gen quan tâm chèn vào vùng T-DNA  Các tế bào tổn thương thực vật tiết hợp chất (phenol) bảo vệ, hợp chất kích thích biểu gen vir Agrobacterium Vir protein tạo Tstrand từ vùng T-DNA Ti-plasmid - vi khuẩn gắn vào tế bào thực vật, T-strand  Sau số protein vir chuyển vào tế bào thực vật qua kênh vận chuyển Trong tế bào thực vật, protein vir tương tác với T-strand tạo phức hệ (Tcomplex)  Phức hệ vào nhân tế bào thực vật, T-DNA chèn vào gen thực vật biểu gen quan tâm Một hệ thống chuyển gen Agrobacterium thường bao gồm: 1.Một chủng Agrobacterium mang vùng vir T-DNA có chứa gen muốn chuyển 2.Vùng vir T-DNA nằm vector vector riêng biệt 3.T-DNA chuyển vào tế bào mơ thực vật sau gắn vào genome thực vật 4.Gene chuyển biểu tế bào thực vật 5.Các tế bào mơ chuyển gene tái sinh thành hồn chỉnh Q trình tạo vaccine viêm gan B: Thu nhận Gene HBsAg chèn vào vector chuyển gen Tiến hành q trình chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens Dùng kĩ thât PCR để xác nhâ n â sát nhââp gene Ni cấy mơ sẹo để tạo trồng hồn chỉnh Phân tích Protein: dùng phương pháp Elisa kiểm tra nồng độ protein HBsAg biểu hiê ân Xử lý với Pepsin: để xác định khả vượt qua men tiêu hố dày vaccine Phân lập gen mã hóa protein HBsAg Mẫu Xử lý Khuyếch đại Điện di Kết Đưa plasmid vào lại tế bào vi khuẩn Vk Agrobacterium Gen HGsAg plasmid Vk Agrobacterium Vector tái tổ hợp Ủ Nhân dòng Chuyển gen nhờ Agrobacterium Chuyển gen vào cà chua  Giống cà chua: cà chua dài  Chọn mầm mầm 7-10 ngày tuổi sử dụng làm ngun liệu chuyển gen  Mơi trường ni cấy mơ điều kiện ni cấy: Sử dụng mơi trường MS (Murashige Skoog, 1962)  Tái sinh chồi, từ mảnh lá: MS + 0,5mg/l NAA + 2mg/l BA  Điều kiện ni: Nhiệt độ 26-28°C, cường độ ánh sáng khoảng 3000 lux  Dòng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens  Vi khuẩn ni mơi trường LB có 50mg/l kanamycin trước gây nhiễm mơ  Cấy mầm mơi trường MS + 0,5mg/l NAA + 2mg/l BA ni ngày ngồi sáng  Gây nhiễm mơ với vi khuẩn 10 phút ni chung mơ vi khuẩn ngày mơi trư ờng MS + 0,5mg/l NAA + 2mg/l BA bổ sung acetosyringone 100 mM) ; để ngồi sáng  Rửa vi khuẩn bám vào mơ nước cất + 500mg/l cefotaxime để giết Agrobacterium , thấm khơ nhẹ mơ  Tái sinh mầm : Cấy mơ mầm mơi trường MS + 0,5mg/l NAA + 2mg/l BA có 20mg/l cefotaxime tác nhân chọn lọc kanamycin 50 mg/l để ngồi sáng  Tái sinh rễ : Cấy truyền mơ hình thành mơi trường có kanamycin sang mơi trường chọn lọc (thực 3-4 chu kỳ, 15 ngày / chu kỳ) đến hình thành  Trồng ngồi đất  Dùng kĩ th êt PCR để xác nhâ ên sát nhâ êp gene Kết Quả:  Cây cà chua có đáp ứng khơng cao chuyển nạp gen khả tái sinh in vitro cao (số liệu chưa cơng bố)  Tại thời gian đầu nghiên cứu, sau ni chung, mơ cấy chọn lọc mơi trường (MS + 1mg/l NAA + mg/l BA) có nồng độ kanamycin cao - 50 mg/l Kết cho thấy, tất mầm chết Sau đó,áp dụng chế độ chọn lọc với nồng độ kanamycin tăng dần từ thấp đến cao từ 20mg/l đến 50 mg/l qua chu kỳ chọn lọc bước đầu nhận dòng tái sinh  Mảnh hai dòng này, có kích thước khoảng 0,6 x 0,6 cm, cấy mơi trường chứa chất điều hồ sinh trưởng NAA BA có 50mg/l kanamycin để theo dõi khả hình thành mơ sẹo tái sinh Kết cho thấy, khoảng - 10 ngày sau ni cấy có hình thành mơ sẹo có tái sinh chồi sau khoảng 20 -30 ngày ni cấy;  Phân tích PCR gen để khẳng định chúng chuyển gen  việc tạo số “vắc -xin ăn được” nhằm phòng bệnh viêm gan B đ ã thực số đối tượng trồng có sản phẩm ăn trực tiếp cà chua đối tượng trồng quan tâm ăn trực tiếp nghiên cứu tạo đáp ứng miễn dịch cho người  Nghiên cứu chuyển gen vào cà chua nhằm tiếp cận xu hướng Thành tựu giới sản xuất vacin ăn khoai tây Yasmin Thanavala Charles J Arntzen thuộc Viện Nghiên cứu Cây trồng Boyce Thompson đồng nghiệp báo cáo "Gây miễn dịch thể người vacxin ăn để điều trị bệnh viêm gan B" Loại trồng khoai tây, phát đăng kỷ yếu Học viện Khoa học Quốc gia ngày 22 tháng năm 2005 - 42 nhân viên chăm sóc sức khỏe độ tuổi 25-58 tham gia vào nghiên cứu này, Trong 33 người định ăn khoai tây chuyển gen mà khơng có tá dược, chất làm tăng khả phản ứng miễn dịch -Chuẩn độ kháng ngun kháng virut viêm gan B huyết đo số lần định ngày -Kết cho thấy người ăn khoai tây khơng chuyển gen chuẩn độ khơng tăng, 19 số 33 người ăn khoai tây chuyển gen chuẩn độ tăng 57,6%, vacxin có thị trường có tác dụng tới 90% đối tượng, kể có chứa chất tá dược - Khoai tây chuyển gen có chứa loại gen lấy từ virus viêm gan B Nhờ loại khoai tây có khả kháng virus viêm gan B cách tạo kháng ngun virus -Các nhà nghiên cứu hy vọng ăn loại khoai tây này, chất kháng ngun gây phản ứng miễn dịch nhẹ thể người -Từ đó, thể người tạo chất miễn dịch cá thể bệnh lây nhiễm viêm gan B Một số nhược điểm vaccin ăn Một ngun nhân ảnh hưởng đến việc thử nghiệm quy mơ lớn người ngại vaccine ăn bị phân huỷ dịch tiêu hố đường ruột Do đó, khó thu kết xác khơng có phản ứng sinh kháng thể kháng thể ít, khơng đủ gây đáp ứng miễn dịch Đồng thời vaccine ăn khơng biểu đồng mơ thực vật gây khó khăn việc xác định liều lượng để thử nghiệm [...]... chúng là cây chuyển gen  việc tạo một số “vắc -xin ăn < /b> được” nhằm phòng b nh viêm < /b> gan < /b> B đ ã được thực hiện trên một số đối tượng cây trồng có sản < /b> phẩm ăn < /b> được trực tiếp thì cây cà chua là đối tượng cây trồng được quan tâm vì có thể ăn < /b> trực tiếp quả đối với nghiên cứu tạo đáp ứng miễn dịch cho người  Nghiên cứu chuyển gen vào cây cà chua nhằm tiếp cận xu hướng này Thành tựu trên thế giới về sản < /b> xuất < /b> vacin... ngun duy nhất được sử dụng để sản < /b> xuất < /b> vaccin < /b> kháng HBV  2 HBeAg(Hepatitis B evolope Antigen-KN vỏ nhân của VRVGB):  Là kháng ngun xuất < /b> hiện sớm thứ 2 sau HBsAg  Máu có HBeAg khơng được dùng làm vacxin  3 HBcAg (Hepatitis B core Antigen-KN lõi):  Là kháng ngun lõi của HBV nằm riêng biệt trên b mặt nucleocapsid Đặc điểm của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens - A tumefaciens là một lồi trực khuẩn... với Pepsin: để xác định khả năng vượt qua men tiêu hố của dạ dày của vaccine này Phân lập gen mã hóa protein HBsAg Mẫu Xử lý Khuyếch đại Điện di Kết quả Đưa plasmid vào lại tế b o vi khuẩn Vk Agrobacterium Gen HGsAg plasmid Vk Agrobacterium Vector tái tổ hợp Ủ Nhân dòng Chuyển gen nhờ Agrobacterium Chuyển gen vào cây cà chua  Giống cà chua: cà chua quả dài  Chọn lá mầm của cây mầm 7-10 ngày tuổi được... phân b o nhanh chóng ở các tế b o chuyển gene, đây chính là lý do tế b o phát triển thành khối u - Cây b nhiễm Agrobacterium tumefaciens qua các vết thương, khi đó các khối u đươc hình thành ngay chổ lây nhiễm và sự phát triển của khối u này sau đó khơng phụ thuộc vào sự có mặt của Agrobacterium nữa Cấu tạo plasmid Ti-plasmid của Agrobacterium tumefaciens Cấu trúc tế b o vi khuẩn Agrobacterium bao... loại gen lấy từ virus viêm < /b> gan < /b> B Nhờ đó loại khoai tây này có khả năng kháng virus viêm < /b> gan < /b> B bằng cách tạo ra kháng ngun virus -Các nhà nghiên cứu hy vọng rằng khi ăn < /b> loại khoai tây này, chất kháng ngun sẽ gây ra một phản ứng miễn dịch nhẹ trong cơ thể người -Từ đó, cơ thể người sẽ tạo ra chất miễn dịch cá thể đối với căn b nh lây nhiễm viêm < /b> gan < /b> B Một số nhược điểm của vaccin < /b> ăn < /b> Một trong những ngun... tế b o thực vật 5.Các tế b o hoặc mơ chuyển gene tái sinh thành cây hồn chỉnh Q trình tạo vaccine viêm < /b> gan < /b> B: 1 Thu nhận Gene HBsAg chèn vào vector chuyển gen 2 Tiến hành q trình chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens 3 Dùng kĩ thât PCR để xác nhâ n â sự sát nhââp gene 4 Ni cấy mơ sẹo để tạo cây trồng hồn chỉnh 5 Phân tích Protein: dùng phương pháp Elisa kiểm tra nồng độ protein HBsAg được biểu... Hình ảnh vi khuẩn Agrobacterium Sự gây ra các khối u do Agrobacterium  Agrobacterium tumefaciens gây ra b nh khối u hình chóp (crown gall) và b nh lơng rễ (hairy root) ở các vị trí tổn thương của thực vật hai lá mầm  Cơ chế gây b ênh : - - Sau khi xâm nhiễm vào tế b o, chúng gắn đoạn TDNA vào b ê máy di truyền của tế b o thực vâ êt - - Một số gene nằm trên vùng T-DNA có khả năng điều khiển sự tổng... do có sự tiết kiệm trong cấu trúc b gen nhờ cách sắp xếp những miền giao của các gen S, C, P và X nên có khả năng tổng hợp được nhiều protein của virus Cấu tạo b gen HBV Kháng ngun của Virus  1 HBsAg(Hepatitis B surface Antige- KN b mặt):  Là kháng ngun b mặt của HBV và cũng là kháng ngun bao ngồi  Kháng thể đối với HBsAg được kí hiệu là Anti-HBs - Hepatitis B surface Antigen  Đây là loại kháng... xu hướng này Thành tựu trên thế giới về sản < /b> xuất < /b> vacin ăn < /b> trên cây khoai tây Yasmin Thanavala và Charles J Arntzen thuộc Viện Nghiên cứu Cây trồng Boyce Thompson cùng các đồng nghiệp trong b o cáo "Gây miễn dịch trong cơ thể người b ng vacxin có thể ăn < /b> được để điều trị b nh viêm < /b> gan < /b> B" Loại cây trồng là khoai tây, và những phát hiện này được đăng trong kỷ yếu của Học viện Khoa học Quốc gia ra ngày... nhân tế b o thực vật, T-DNA chèn vào b gen thực vật và biểu hiện gen quan tâm Một hệ thống chuyển gen b ng Agrobacterium thường bao gồm: 1.Một chủng Agrobacterium mang vùng vir và một T-DNA có chứa gen muốn chuyển 2.Vùng vir và T-DNA có thể nằm trên cùng 1 vector hoặc trên các vector riêng biệt 3.T-DNA được chuyển vào tế b o hoặc mơ thực vật và sau đó được gắn vào genome thực vật 4.Gene chuyển biểu ... mang gen b nh người Khi ăn gây phản ứng miễn dịch mầm b nh Viêm gan B: virus viêm gan B     - Viêm gan B (viêm gan virus B) b nh phổ biến lây lan mạnh người Theo WHO (tổ chức y tế giới) cho biết... vật sản xuất phần ăn lá, củ, quả, hạt Ưu điểm vaccin ăn -Dể dàng tăng qui mơ sản xuất dể thu sinh khối -Tính ổn định cao,dễ b o quản sử dụng -Tính ăn - Tính an tồn - Vaccine ăn kích thích sản xuất. .. dụng để sản xuất vaccin kháng HBV  HBeAg(Hepatitis B evolope Antigen-KN vỏ nhân VRVGB):  Là kháng ngun xuất sớm thứ sau HBsAg  Máu có HBeAg khơng dùng làm vacxin  HBcAg (Hepatitis B core Antigen-KN