Sử dụng enzyme alpha amylase và gama amylase đương hoa mít

TÓM LƯỢC Với mục đích cải thiện chất lượng rượu mít, đa dạng sản phẩm tạo ra loại rượu trái cây có qua quá trình chưng cất đáp ứng nhu cầu thị trường, để tăng hiệu suất trích ly rượu, nâ

Cần Thơ 12- 2010

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BÙI THỊ KIM TUYỀN

MSSV: 2071788

SỬ DỤNG ENZYME ALPHA AMYLASE VÀ GAMA

AMYLASE ĐƯƠNG HOA MÍT

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Mã ngành: 08

LỜI CẢM ƠN

Cũng đã đến lúc giấc mơ ấp ủ bấy lâu sắp trở thành hiện thực

Trong suốt quá trình học tập bên cạnh niềm vui cũng có rất nhiều khó khăn vất vả, thành công và thất bại Nhưng nay em đã vượt qua được tất cả và sắp đạt được bằng kỹ

sư, một điều mà tất cả các sinh viên đều mong muốn đạt được Để có được ngày hôm nay ngoài sự nỗ lực của bản thân, em đã được sự động viên giúp đỡ về mặt tinh thần cũng như vật chất của Gia Đình và Thầy Cô rất nhiều Em không biết nói gì để diễn tả hết niềm biết ơn của mình Em sẽ cố gắng học tập nhiều hơn nữa và sống thật tốt không phụ lòng người thân và Thầy Cô

Xin chân thành gửi lời cảm ơn đến Cha Mẹ và các anh chị em trong gia đình đã hy sinh vất vả và lao động khổ cực để em có thể hoàn thành tốt chương trình học tập này

Xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Bộ môn Công nghệ Thực phẩm - Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng - Trường Đại học Cần Thơ đã tận tình truyền dạy kiến thức

và những kinh nghiệm quý báu giúp em có hành trang vững chắc tiến bước vào đời

Và em xin chân thành cảm ơn Cô Bùi Thị Quỳnh Hoa- bộ môn Công nghệ Thực phẩm- Trường Đại học Cần Thơ đã ân cần hướng dẫn và truyền đạt kinh nghiệm quý báu giúp em hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này

Cuối cùng Xin cảm ơn các bạn lớp Công nghệ Thực phẩm khoá 33 đã cùng em chia sẻ những bài học quý báu và cùng em vượt qua chặng đường ba năm rưỡi gian khó này

Cần Thơ, ngày 01 tháng 12 năm 2010 Sinh viên thực hiện Bùi Thị Kim Tuyền

TÓM LƯỢC

Với mục đích cải thiện chất lượng rượu mít, đa dạng sản phẩm tạo ra loại rượu trái cây

có qua quá trình chưng cất đáp ứng nhu cầu thị trường, để tăng hiệu suất trích ly rượu, nâng độ rượu, cải thiện hương vị thơm ngon của rượu vang mít, đề tài tiến hành trên cơ

sở sử dụng kết hợp chế phẩm enzyme α-amylase và glucoamylase trong đường hóa nguyên liệu, thủy phân tinh bột của dịch quả trước giai đoạn lên men Nội dung nghiên cứu của đề tài bao gồm:

- Phân tích thành phần nguyên liệu mít nghệ;

- Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme α-amylase trong quá trình thủy phân tinh bột;

- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme α-amylase và thời gian đến khả năng thủy phân tinh bột trong nguyên liệu mít nghệ;

- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ mít đến vận tốc phản ứng của enzyme α-amylase, xác định phương trình Michaelis Menten

Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme glucoamylase amylase trong quá trình thủy phân tinh bột;

Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian đến khả năng thủy phân tinh bột trong nguyên liệu mít nghệ;

- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ mít đến động học phản ứng của enzyme glucoamylase, xác định phương trình Michaelis Menten trên cơ chất mít

Qua quá trình nghiên cứu và thực hiện các thí nghiệm, thu được các kết quả như sau:

- Nguyên liệu mít nghệ có độ ẩm 69,25%; hàm lượng đường tổng số 22,35%; hàm lượng chất khô hoà tan 28%; pH của dịch mít 4,88 - 5,33;

- Điều kiện thích hợp cho chế phẩm enzyme α-amylase hoạt động trong giai đoạn thuỷ phân tinh bột trong nguyên liệu mít: nhiệt độ 82oC và pH 6,4; nồng độ enzyme α-amylase sử dụng là 0,38% và thời gian thuỷ phân 70 phút, pha loãng mít ở tỉ lệ 30% mít : 70% nước thì hiệu quả thuỷ phân tinh bột trong nguyên liệu mít đạt được kết quả tốt nhất

- Đối với chế phẩm glucoamylase thì nhiệt độ 54,50C, pH 3,6; nồng độ enzyme glucoamylase sử dụng 0,36%, thời gian thủy phân 62 phút, pha loãng mít ở tỉ lệ 30% mít : 70% nước thì hiệu quả đường hóa nguyên liệu mít đạt hiệu quả và tính kinh tế tốt

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ii

TÓM LƯỢC iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH HÌNH vii

DANH SÁCH BẢNG viii

Chương 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.1 GIỚI THIỆU 1

Chương 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 CÂY MÍT 2

2.1.1 Mít nghệ 4

2.1.2 Thu hoạch và bảo quản mít sau thu hoạch 5

2.2 ENZYME 5

2.2.1 Bản chất protein của enzyme 5

2.2.2 Trung tâm hoạt động của enzyme 5

2.2.3 Tính chất của enzyme 6

2.2.4 Cơ chế tác dụng của enzyme 6

2.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng: 7

2.2.6 Phản ứng thủy phân bởi enzyme 13

2.2.6.1 Ý nghĩa của phản ứng thủy phân 13

2.2.6.2 Đặc điểm của các cơ chất bị enzyme thủy phân 14

2.2.6.3 Cơ chế tác dụng của enzyme hydrolase 15

2.2.7 Một số đặc điểm của phản ứng thủy phân 15

2.2.7.1 Thứ bậc của phản ứng 15

2.2.7.2 Yếu tố điều chỉnh 16

2.2.8 Hệ enzyme sử dụng và đặc tính kỹ thuật 17

2.2.8.1 Enzyme amylase (EC 3.2.1.1) 17

2.2.8.2 Enzyme Pectinase 21

2.2.9 Động thuyết của quá trình thủy phân tinh bột 23

2.2.10 Quá trình đường hóa, các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình đường hóa và sự biến đổi các chất khác trong quá trình đường hóa 25

2.2.11 Các phương pháp xác định hoạt độ Enzyme 28

2.2.11.1 Nguyên tắc chung của các phương pháp xác định hoạt độ enzyme 28

2.2.11.2 Các đơn vị đo hoạt động xúc tác của enzyme 29

2.2.11.3 Hoạt độ riêng (specific activity) 29

2.2.12 Điều kiện phản ứng khi tiến hành xác định hoạt độ enzyme 29

2.2.13 Các phương pháp xác định hoạt độ enzyme 30

2.2.13.1 Phân tích liên tục 30

2.2.13.2 Phân tích gián đoạn 30

2.2.14 Dựa theo nguyên tắc xác định hoạt độ trên, có thể xác định theo một hoặc một số phương pháp chính sau đây 30

2.2.14.1 Phương pháp đo độ nhớt: .30

2.2.14.2 Phương pháp phân cực kế: .30

2.2.14.3 Phương pháp đo áp suất hay áp kế: .30

2.2.14.4 Phương pháp quang phổ kế: 30

2.2.14.5 Phương pháp chuẩn độ: 31

2.2.14.6 Phương pháp sắc ký: 31

2.2.14.7 Phương pháp hóa học: .31

2.2.15 Một số lưu ý khi xác định hoạt độ hay thực hiện phản ứng enzyme 32

2.2.16 Tính chất ưu việt của enzyme so với các chất xúc tác khác 32

Chương III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

3.1 PHƯƠNG TIỆN 33

3.1.1 Thời gian – địa điểm 33

3.1.2 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm và nguyên liệu 33

3.1.3 Hóa chất 33

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

3.2.3 Thí nghiệm 1a: Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme α - amylase trong quá trình thủy phân tinh bột 36

3.2.4 Thí nghiệm 1b: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme α- amylase và thời gian thủy phân 38

gian thuỷ phân đến khả năng thủy phân nguyên liệu mít nghệ 38

3.2.5 Thí nghiệm 1c: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ mít đến vận tốc phản ứng, xác định phương trình Michaelis Menten trên cơ chất mít .39

3.2.6 Thí nghiệm 2a: Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme glucoamylase trong quá trình thủy phân tinh bột 40

3.2.7 Thí nghiệm 2b: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian thủy phân đến khả năng thủy phân nguyên liệu mít nghệ 42

3.2.8 Thí nghiệm 2c : Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến vận tốc phản ứng, xác định phương trình Michaelis Menten trên cơ chất mít .43

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45

4.1 PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN NGUYÊN LIỆU 45

4.2 THÍ NGHIỆM 1A: KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA pH VÀ NHIỆT ĐỘ ĐẾN HOẠT TÍNH ENZYME α-AMYLASE TRÊN CƠ CHẤT MÍT 45

4.4 THÍ NGHIỆM 1C: KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ CƠ CHẤT ĐẾN VẬN TỐC PHẢN ỨNG, XÁC ĐỊNH PHƯƠNG TRÌNH MICHELIS MENTEN TRÊN CƠ CHẤT MÍT 51

4.5 THÍ NGHIỆM 2A: KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA pH VÀ NHIỆT ĐỘ ĐẾN HOẠT TÍNH CỦA ENZYME GLUCOAMYLASE TRONG QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN MÍT NGHỆ 53

4.6 THÍ NGHIỆM 2B: KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ ENZYME GLUCOAMYLASE VÀ THỜI GIAN THỦY PHÂN ĐẾN KHẢ NĂNG THỦY PHÂN NGUYÊN LIỆU MÍT NGHỆ 55

4.7 THÍ NGHIỆM 2C: KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ MÍT ĐẾN HOẠT TÍNH ENZYME GLUCOAMYLASE, XÁC ĐỊNH ĐỘNG HỌC PHẢN ỨNG ENZYME GLUCOAMYLASE TRÊN CƠ CHẤT MÍT 58

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 60

5.1 KẾT LUẬN 60

5.2 ĐỀ NGHỊ 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO xi

PHỤ LỤC 1 ix

PHỤ LỤC 2……….……… … xiv

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1 Cơ chế tác dụng của enzyme 6

Hình 2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt động enzyme 9

Hình 3 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến vận tốc phản ứng 9

Hình 4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng 10

Hình 5 Ảnh hưởng của pH tới hoạt độ enzyme 11

Hình 6 Ảnh hưởng của chất hoạt hoá đến hoạt động enzyme 13

Hình 7 Cơ chế phân cắt của hệ enzyme amylase 21

Hình 8 Sự phụ thuộc của hoạt tính enzyme vào pH 27

Hình 9 Nguyên liệu trái mít và múi mít sau xử lý 45

Hình 10 Đồ thị ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến khả năng thủy phân enzyme 47

Hình 11 pH và nhiệt độ tối ưu của enzyme α-amylase trên cơ chất mít 48

Hình 12 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của nồng độ enzyme alpha amylase và thời gian thủy phân đến khả năng thủy phân mít 50

Hình 13 Nồng độ enzyme alpha-amylase và thời gian thủy phân tối ưu 50

Hình 14 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến vận tốc phản ứng 52

Hình 15 Đồ thị ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt tính enzyme glucoamylase 54

Hình 16 Nhiệt độ và pH tối ưu của enzyme glucoamylase 55

Hình 17 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme glucoamylase sử dụng và thời gian thủy phân đến khả năng thủy phân mít 57

Hình 18 Nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian thủy phân tối ưu 57

Hình 19 Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của nồng độ mít hoạt tính 59

enzyme glucoamylase 59

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1 Thành phần hóa học của múi mít 3

Bảng 2 Thành phần hoá học của hạt mít tính cho 100g 4

Bảng 3 Thể hiện thành phần các acid amine không thay thế trong hạt mít 4

Bảng 4 Đặc điểm của α-amylase từ các nguồn khác nhau 18

Bảng 5 Độ bền nhiệt của α-amylase từ các nguồn khác nhau 19

Bảng 6 Đặc tính của glucoamylase 20

Bảng 7 pH tối thích của các enzyme có nguồn gốc khác nhau 22

Bảng 8 Sự phụ thuộc pH tối ưu vào nhiệt độ 27

Bảng 9 Thành phần của nguyên liệu 45

Bảng 10 Hàm lượng đường khử thu được sau quá trình đường hóa ở các điều kiện pH và nhiệt độ bố trí trong thí nghiệm 46

Bảng 11 Hàm lượng đường khử thu được sau quá trình dịch hóa bằng enzyme α- amylase ở các điều kiện nồng độ enzyme và thời gian thủy phân khác nhau 49

Bảng 12 Hàm lượng đường khử thu được sau quá trình thủy phân bằng enzyme α- amylase ở các nồng độ mít khác nhau 51

Bảng 13 Hàm lượng đường khử thu được sau quá trình đường hóa ở các điều kiện pH và nhiệt độ bố trí trong thí nghiệm 53

Bảng 14 Hàm lượng đường khử thu được sau quá trình đường hóa bằng enzyme glucoamylase ở các điều kiện nồng độ và thời gian thủy phân khác nhau 56

Bảng 15 Hàm lượng đường khử thu được sau quá trình thủy phân bằng enzyme glucoamylase ở các nồng độ mít khác nhau 58

Chương 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 GIỚI THIỆU

Nước ta có khí hậu nhiệt đới nên nguồn trái cây phong phú quanh năm với nhiều loại trái cây đặc sản như: cam, bưới, chuối, xoài…Đó là điều kiện thuận lợi để sản xuất nhiều loại sản phẩm như: mứt đông, nước ép, sữa, bánh kẹo, các sản phẩm sấy khô…và với mục tiêu đa dạng sản phẩm rượu trái cây đã ra đời với nhiều chủng loại khác nhau: rượu vang, rượu cao độ, rượu hương brandy Nhưng do sản phẩm này rất đa dạng nên để cạnh tranh được thị trường thế giới cần phải lựa chọn nguyên liệu mới cho sản phẩm Và giải pháp đưa ra là nghiên cứu về nguyên liệu rượu mít

Mít có nguồn gốc từ Ấn Độ, được trồng rộng rãi ở Malaysia, Indonexia, Philipin là loại cây dễ trồng, không kén đất, thời gian cho trái dài, có thể hàng trăm tuổi Và Việt Nam cũng được xem là xứ sở của cây mít, vì thế việc sản xuất sản phẩm rượu mít là triển vọng

để nghiên cứu

Nhưng nguyên liệu có vách tế bào dày, hàm lượng protopectin và tinh bột còn cao nên gây khó khăn cho việc trích ly dịch quả cũng như việc làm trong dịch quả Do vậy, việc sử dụng các chế phẩm sinh học để nâng cao chất lượng rượu vang và rượu cao độ từ nguồn nguyên liệu mít là rất có ý nghĩa Áp dụng phương pháp này nhằm tạo ra một sản phẩm rượu mít hứa hẹn nhiều triển vọng với hương vị thơm ngon đặc trưng của trái mít

Ngày nay, các sản phẩm rượu vang từ trái mít cũng ngày càng phong phú về số lượng lẫn chất lượng Nhưng sản phẩm rượu cao độ có nguồn gốc từ trái cây lại chưa được quan tâm nhiều Với mục tiêu phát triển sản phẩm mới, tạo ra chủng loại rượu cao độ chất lượng cao Chúng tôi nghiên cứu sản xuất sản phẩm rượu cao độ trên nguyên liệu mít Và đường hóa là giai đoạn quan trọng trong công nghệ lên men rượu cao độ, quyết định chất lượng sản phẩm tạo thành và hiệu quả kinh tế đạt được Với mong muốn đạt được hiệu quả cao trong giai đoạn đường hóa, đề tài này tập trung khảo sát những yếu tố ảnh hưởng đến khả năng thủy phân tinh bột của enzyme α- amylase và glucoamylase

Chương 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 CÂY MÍT

Theo bách khoa toàn thư Wikipedia, cây mít có danh pháp khoa học là Artocarpus heterophyllus thuộc giới Plantae, ngành Magnoliophyta, lớp Magnoliopsida, bộ Rosales, họ Moraceae, loài Heterophyllus Cây mít còn có tên khoa học khác là Artocapus integrifolius

Mít được xếp vào loại cây lâu năm, từ khi trồng đến khi cho trái có thể từ 5 đến 7 năm tuổi, thời gian cho quả tương đối dài, khoảng 50 năm Quả mít thuộc loại quả phức, có hình bầu dục kích thước (30-60) cm x (20-30) cm Mít ra quả vào khoảng giữa mùa xuân và chín vào giữa và cuối mùa hè (tháng 5-10) Ở miền Nam nước ta, mít ra hoa gần như quanh năm nhưng cũng tập trung vào đầu mùa mưa

Cây mít được cho là có nguồn gốc ở phía tây dãy núi Ghát của Ấn Độ và Bangladesh Hiện nay, cây mít được trồng nhiều ở Ấn Độ, Malaysia, Thái Lan, Philippin, Braxin, các nước Đông Dương và vùng nhiệt đới Ở Việt Nam cây mít được trồng phổ biến ở vùng nông thôn Mít có nhiều loại như: mít mật, mít dai, mít tố nữ (đặc sản của miền Nam)….Ngoài giá trị dinh dưỡng trong ẩm thực , nhiều bộ phận của cây mít cũng được sử dụng trong các vị thuốc

Ở Ấn Độ, mít hộp (múi mít đóng hộp với nước đường) là một mặt hàng xuất khẩu quan trọng Trong mấy năm qua, Viện công nghiệp thực phẩm cũng đã nghiên cứu sản phẩm này và bước đầu đã thu được kết quả Ngoài việc đóng hộp múi mít với nước đường, người ta còn chế biến mặt hàng nước mít đóng hộp

Ở nước ta, nhân dân còn sử dụng quả mít non, mít già để chế biến các món ăn hoặc phơi khô như một loại lương thực phụ Nhiều món ăn chế biến từ mít chứa nhiều giá trị về dinh dưỡng và cảm quan như: mắm mít (Nghệ An), nộm mít, bánh mít, mít farci, là những món ăn quen thuộc của nhân dân miền trung

Quả mít có giá trị lương thực, thực phẩm cao Quả mít được chia làm 3 phần: vỏ quả

và xơ chiếm khoảng 50 %; thịt quả (múi mít không hạt) chiếm 29 % và hạt chiếm khoảng 12 % Trong đó, múi mít rất giàu về dinh dưỡng Thành phần hóa học của múi mít được thể hiện ở bảng 1

Bảng 1 Thành phần hóa học của múi mít

( Theo tài liệu của www.nal.usda.gov/fnic/foodcomp.)

Múi mít được xếp vào loại thịt quả có giá trị dinh dưỡng cao thì hạt mít cũng được xem

là loại hạt có giá trị về mặt lương thực Hạt mít tươi (mới lấy ở quả ra) có 52-57% nước, 7% protein và 38% chất bột đường Thành phần hóa học của hạt mít được thể hiện ở bảng

72,0 -77,2 1,3-1,9 0,1-0,3 18,9-25,4 6,4-8,0 1,0-1,1 0,8-1,0 0,022 0,038 0,005 0,002 0,407

540 I.U

0,00003 0,004 0,008 – 0,010

Bảng 2 Thành phần hoá học của hạt mít tính cho 100g

1

2

3

4

5

6

Nước Protein Chất béo Chất bột đường

Cellulose Chất khoáng

Calci Phospho Sắt Natri Kali

51,6-57,8 6,6 0,4 38,4 1,5 1,3-1,5 0,00005-0,00055 0,00013-0,00023 0,0005 0,000002-0,0012

0,4

( Theo tài liệu của www.nal.usda.gov/fnic/foodcomp.)

Khi xét về giá trị dinh dưỡng của hạt mít người ta chú ý đến các thành phần acid amin, đặc biệt là acid amin không thay thế có trong protein của hạt mít Thành phần các acid amine không thay thế trong hạt mít được thể hiện ở bảng 3

Bảng 3 Thể hiện thành phần các acid amine không thay thế trong hạt mít

Các acid amin mg/100g nitơ Các acid amin mg/100g nitơ

Tryptophan 69

Treonine 269

Phenylalanine 256

Cysteine 63

Methyonine 50

Lycine 365

Leucine 31

Isoleucine 300

(Trần Đức Ba,2000)

2.1.1 Mít nghệ

Giống mít nghệ cao sản có tên là Artocarplus hectorophyllus, là giống mít chịu khô hạn

tốt, chống được giông bão Trái to, múi thơm, giòn, ngọt, thích hợp ăn tươi hoặc chế biến

xuất khẩu rất tốt, ngoài ra có thể sử dụng làm thức ăn chăn nuôi và lấy gỗ Mít nghệ dễ trồng, ít công chăm sóc, ít sử dụng thuốc bảo vệ thực vật, cho năng suất cao Mít nghệ và mít tố nữ được xem là hai giống mít được trồng phổ biến ở Việt Nam

2.1.2 Thu hoạch và bảo quản mít sau thu hoạch

Mít là loại trái cây lớn nhất trong các loại trái cây phát triển từ hoa Có thể nặng đến 36,32kg dài khoảng 90cm đường kính khoảng 50cm

Mít có độ chín thuần thục sau 3 đến 8 tháng ra hoa Thời gian này dài ngắn tuỳ thuộc từng giống mít Khi chín có sự thay đổi màu sắc của trái mít từ màu xanh nhạt sang màu vàng đậm Khi mít chín quá chúng sẽ hoá nâu và hư hỏng nhanh Một số thí nghiệm chỉ ra rằng: có thể kéo dài quá trình của trái mít từ 3 đến 6 tuần trong kho mát ở nhiệt độ 52-55oF (11,11oC-12,78oC) và độ ẩm tương đối của không khí 85 đến 95% Ở Jamaica, người ta có thể làm tăng nhanh quá trình chín và cải thiện mùi của trái mít bằng cách cắt phần đầu có cuống của trái mít

2.2 ENZYME

2.2.1 Bản chất protein của enzyme

Enzyme là những chất hữu cơ có phân tử lượng lớn từ 20000 đến 1000000 dalton (có kích thước nhỏ nhất là ribonucleaza 12700 dalton) Do có kích thước lớn nên cũng như protein, enzyme không đi qua các màng bán thấm

Giống như protein, enzyme không bền với tác dụng của nhiệt độ Dưới tác dụng của nhiệt

độ cao, enzyme bị biến tính và mất khả năng xúc tác, mức độ giảm hoạt tính của enzyme tương ứng với mức độ biến tính của protein enzyme Enzyme cũng bị mất khả năng hoạt động dưới tác dụng của các tác nhân gây biến tính protein khác như axit hay kiềm mạnh hoặc muối kim loại nặng

Enzyme cũng có tính lưỡng tính, nghĩa là trong điều kiện điện ly của môi trường có thể tồn tại ở dạng cation, anion hoặc dạng trung hòa điện Chính dựa trên tính chất này, cho phép có thể tiến hành phân tách cũng như xác định độ thuần khiết của enzyme bằng phương pháp điện di

2.2.2 Trung tâm hoạt động của enzyme

Trong quá trình xác tác, chỉ một phần rất nhỏ của phân tử enzyme tham gia kết hợp đặc hiệu với cơ chất, phần đó được gọi là trung tâm hoạt động của enzyme

Theo Emil – Fischer (1890) thì trung tâm hoạt động của enzyme vốn có cấu trúc không gian tương ứng giữa ổ khóa và chìa khóa Cấu trúc không gian của enzyme cũng như của protein không cứng mà mềm dẻo, linh động Theo quan niệm hiện nay, khi enzyme tương tác với cơ chất các nhóm chức ở phần trung tâm hoạt động của phân tử enzyme thay đổi vị trí không gian tạo thành hình thể khớp với hình thể của cơ chất, vì vậy gọi là sự “ khớp cảm ứng”

Giữa cơ chất và trung tâm hoạt động tạo thành nhiều tương tác yếu, do đó có thể dễ dàng bị

cắt đứt trong quá trình phản ứng để giải phóng enzyme và các sản phẩm phản ứng

Hình 1 Cơ chế tác dụng của enzyme 2.2.3 Tính chất của enzyme

a Cường lực xúc tác

Enzyme là chất xúc tác sinh học, nó có đầy đủ các tính chất của một chất xúc tác Tuy

nhiên enzyme có cường lực xúc tác mạnh hơn nhiều so với chất xúc tác thông thường Ví dụ:

- 1 phân tử  - amylase sau 1 giây, có thể phân giải 4000 liên kết glucozit trong phân tử tinh bột

- 1 mol Fe3+ xúc tác phân ly được 10-6 mol H2O2/phút Một phân tử catalaza có một nguyên

tử Fe xúc tác phân ly 5.106 mol H2O2/phút

b Tính đặc hiệu của enzyme

Tính đặc hiệu cao của enzyme là một trong những khác biệt chủ yếu giữa enzyme với các chất xúc tác khác Mỗi enzyme chỉ có khả năng xúc tác cho sự chuyển hoá một hay một số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định Sự tác dụng có tính chọn lựa cao này gọi

là tính đặc hiệu hoặc tính chuyên môn hoá của enzyme Do enzyme có tính đặc hiệu cao nên không tạo thành sản phẩm phụ do đó dịch thuỷ phân thu được có độ thuần khiết cao

2.2.4 Cơ chế tác dụng của enzyme

Theo quan điểm hiện nay trong phản ứng có xúc tác enzyme, nhờ sự tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất mà cơ chất được hoạt hoá, bởi lẽ khi cơ chất kết hợp vào enzyme do kết quả của sự cực hoá, sự chuyển dịch của các electron và sự biến dạng của các liên kết tham gia trực tiếp vào phản ứng dẫn tới sự thay đổi động năng cũng như thế năng, kết quả làm cho phân tử cơ chất trở nên hoạt động hơn, nhờ đó tham gia phản ứng dễ dàng

Năng lượng hoạt hoá khi có xúc tác enzyme không những nhỏ hơn rất nhiều so với trường hợp không có xúc tác mà cũng nhỏ hơn so với cả trường hợp có chất xúc tác thông thường Qua nhiều dẫn liệu thực nghiệm cho thấy quá trình tạo thành phức enzyme – cơ chất (ES)

và biến đổi phức này thành sản phẩm, giải phóng enzyme tự do thường trải qua 3 giai đoạn

như sau:

E + S  ES  P + E

- Giai đoạn thứ nhất: enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức enzyme – cơ chất (ES) không bền, phản ứng này xảy ra rất nhanh và đòi hỏi năng lượng hoạt hoá thấp

- Giai đoạn thứ hai: xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn tới sự kéo căng và phá vỡ các liên kết đồng hoá trị tham gia phản ứng

- Giai đoạn thứ ba: tạo thành sản phẩm, còn enzyme được giải phóng ra dưới dạng tự do Các loại liên kết chủ yếu được tạo thành giữa E và S trong phức ES là : tương tác tĩnh điện, liên kết hydro, tương tác Van der Vaala Mỗi loại liên kết đòi hỏi những điều kiện khác nhau

và chịu ảnh hưởng khác nhau khi có nước

Có thể lấy phản ứng thuỷ phân cơ chất A-B, dưới tác dụng của enzyme là ví dụ:

AB + H2O  AOH + BH

Khi hợp chất AB kết hợp với enzyme thì liên kết A - B bị kéo căng, kèm theo sự chuyển dịch electron dẫn đến làm đứt liên kết A - B và gắn nhóm HO – của nước vào phần A còn

H+ của nước vào phần B của phân tử

Sau khi hoàn thành phản ứng, enzyme được giải phóng dưới dạng tự do (Lê Ngọc Tú, 2004)

2.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng:

Phản ứng do enzyme xúc tác phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, nhiệt độ, pH của môi trường, các ion kim loại, các chất vô cơ và hữu cơ khác…Điều đáng lưu ý là các yếu tố hoá lý không chỉ ảnh hưởng đến phản ứng enzyme theo kiểu giống như các phản ứng hoá học thông thường mà còn ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng thông qua tác dụng của chúng đối với cấu trúc phân tử enzyme Sau đây sẽ xét cụ thể hơn về một số

yếu tố:

a Nồng độ cơ chất, mô hình Michaelis – Menten

Năm 1913, Leonon Michelis và Maud Menten đã đưa ra mô hình để giải thích tính chất động học của phản ứng enzyme và đã lập được phương trình biểu diễn mối quan hệ giữa vận tốc phản ứng với nồng độ cơ chất của enzyme

Đặc điểm quan trọng nhất của mô hình này là : mở đầu phản ứng cần thiết phải tạo thành phức trung gian enzyme – cơ chất (ES) Sau đó phức (ES) chuyển tiếp tạo thành sản phẩm cuối cùng của phản ứng và enzyme tự do, enzyme lại kết hợp với phân tử cơ chất khác bắt đầu vòng xúc tác mới

Trường hợp đơn giản nhất, phản ứng chỉ có một cơ chất S, enzyme (E) xúc tác cho sự chuyển hoá của nó chỉ tạo thành một sản phẩm P, phản ứng xảy ra như sau:

- Nồng độ cơ chất [S] rất lớn so với nồng độ tổng của enzyme [E0]

- Lượng sản phẩm [P] tạo thành chưa đáng kể, nên k -2 = [E].[P] ~ 0

Trong những điều kiện ấy, phản ứng sẽ diễn ra:

E + S ES P + E (1.3)

Vì [S] rất lớn so với [E0], lượng S nằm ở trong phức có thể được xem là không đáng

kể, nên nồng độ cơ chất lúc đầu cũng được xem là nồng độ cơ chất lúc phản ứng đạt đến trạng thái dừng [ES] khi đó gần như không đổi và vận tốc ban đầu v = k2[ES] cũng gần như không đổi, từ đây ta có:

0 ] )[

( ] ][

[ ]

[

2 1

dt

ES d

(1.4)

m K k

k k ES

S E





  1

2 1

][

]][

[

(1.5)

Vì S chưa chuyển hóa thành P nên :

p K k

k ES

S E



  1

1

][

]][

[

(1.6)

Kp: hằng số phân ly của phức enzyme – cơ chất

Và k2 là không đáng kể so với k1 nên: Km~ Kp Người ta nói Km là hằng số phân ly biểu kiến của phức enzyme – cơ chất Km cho biết một cách gần đúng ái lực của enzyme đối với cơ chất: Km càng nhỏ thì ái lực của enzyme đối với cơ chất càng lớn và ngược lại

Khi ở trạng thái dừng, ta có:

[E0] = [E] + [ES] = [ES] [ ]

][S ES

1 ] [

] [

0 max 1

S

K E

ES v

].[

max

S K

S v v

Đây là phương trình Michaelis - Menten đã được Holden và Briggx hoàn thiện Km

được gọi là hằng số Michaelis – Menten

Hình 2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt động enzyme

Hình 3 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến vận tốc phản ứng

Khi nồng độ enzyme quá lớn vận tốc phản ứng tăng chậm

Hoạt độ enzyme

Nồng độ enzyme

c Nhiệt độ

Bản chất của enzyme là protein Do đó, nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến cấu trúc của chúng Phần lớn enzyme bị mất hoàn toàn hoạt động ở 70oC, gọi là nhiệt

độ tới hạn Tuy nhiên một số enzyme của các vi khuẩn ưa nhiệt vẫn hoạt động ở

90oC hoặc cao hơn Ở nhiệt độ tới hạn, enzyme bị biến tính ít khi được phục hồi trở lại

Tốc độ phản ứng của enzyme chỉ có thể tăng ở giới hạn nhiệt độ nào đó khi mà protein chưa bị phá vỡ cấu trúc Đại lượng biểu thị cho ảnh hưởng của nhiệt độ tới tốc độ phản ứng của phản ứng enzyme là hệ số Q10 Hệ số này càng lớn, phản ứng càng khó xảy ra ở nhiệt độ thường

Hệ số Q10 của phản ứng enzyme là 1-2

Hệ số Q10 của phản ứng hóa học là 2-3

Từ hệ số Q10 có thể tính được năng lượng hoạt hóa của phản ứng enzyme

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến vận tốc phản ứng của enzyme cho thấy nhiệt độ hoạt động thích hợp của nhiều enzyme vào khoảng 40-50oC Ở nhiệt độ thấp dưới 0oC, hoạt độ enzyme bị giảm nhiều, nhưng lại có thể được phục hồi khi đưa về nhiệt độ bình thường

Nhiệt độ ứng với vận tốc enzyme cực đại gọi là nhiệt độ tối thích Mỗi enzyme

có nhiệt độ tối thích khác nhau tùy thuộc vào nguồn gốc của chúng Tuy nhiên ở một nhiệt độ giới hạn nào đó thì phản ứng sẽ chậm lại do sự biến tính dần protein của enzyme với nhiệt, nếu tiếp tục tăng nhiệt độ thì enzyme không hoạt động nữa

Hình 4 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng

d pH môi trường

Độ bền của phân tử enzyme cũng phụ thuộc vào trạng thái ion hóa của phân tử Việc xác định độ bền pH của enzyme có ý nghĩa quan trọng trong quá trình thu nhận chế phẩm enzyme, tinh sạch và nghiên cứu enzyme Để xác định độ bền pH

Tốc

độ phản ứng

Nhiệt độ (0C)

của enzyme cần giữ enzyme trong các dung dịch đệm có pH khác nhau trong thời gian xác định, sau đó chỉnh về cùng pH giống nhau (pH thích hợp để xác định hoạt độ của nó) trước khi tiến hành xác định hoạt độ

pH môi trường thường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và ảnh hưởng đến độ bền của protein enzyme

Do đó tốc độ của phản ứng enzyme sẽ tăng dần đến giá trị cực đại và sau đó sẽ giảm dần

Đa số enzyme bền ở pH từ 5 - 9 Độ bền sẽ tăng nếu có mặt của cơ chất và coenzyme hoặc Ca2+…

Enzyme rất nhạy cảm với sự thay đổi của pH môi trường, mỗi enzyme chỉ hoạt động mạnh nhất ở một vùng pH xác định gọi là pH tối thích

pH tối thích của đa số enzyme nằm trong vùng axid yếu, kiềm yếu hay trung tính; chỉ có một số ít có pH tối thích trong vùng axid hay kiềm mạnh

Hình 5 Ảnh hưởng của pH tới hoạt độ enzyme

e Các chất kìm hãm

Trong các chất kìm hãm enzyme, một số chất như những ion kim loại, các chất vô cơ, hữu cơ… có khả năng kìm hãm tốc độ phản ứng của enzyme Các chất này có thể kìm hãm thuận nghịch hay không thuận nghịch Phản ứng enzyme (E) và các chất kìm hãm (I) nhanh chóng đạt đến cân bằng:

k1

k -1

chúng có khả năng kết hợp với trung tâm hoạt động của enzyme Kết quả là một số chỗ kết hợp cần thiết ở enzyme bị chất kìm hãm chiếm mất Do đó cơ chất mất một phần khả năng tương tác, làm cho tốc độ phản ứng không tăng Phản ứng cạnh tranh có thể biểu thị như sau:

ES + S = ESS

Ứ c ch ế b ở i s ả n ph ẩ m

Trong một số trường hợp, khi phản ứng đạt tới một chiều sâu nào đấy, lượng sản phẩm tích lũy lại nhiều có thể sinh ra hiện tượng ức chế bởi sản phẩm Có thể giải thích hiện tượng ức chế bởi sản phẩm bởi một số cơ chất chế động học khác nhau:

Ức chế cạnh tranh: trong trường hợp này, cũng gần giống trường hợp ức chế cạnh tranh bởi chất ức chế, sản phẩm sinh ra trong quá trình phản ứng có thể kết hợp với enzyme tạo thành phức enzyme-sản phẩm không có hoạt tính

E + S ES E + P

Ức chế không cạnh tranh: trong trường hợp này, sản phẩm sinh ra trong quá trình phản ứng vừa có thể kết hợp với enzyme vừa có thể kết hợp với phức enzyme – cơ chất tạo thành phức không có hoạt tính (Trần Đình Toại – Nguyễn Thị Vân Hải, 2005)

f Các chất hoạt hóa

Các chất hoạt hóa enzyme có thể là các anion, các ion kim loại ở ô thứ 11 đến ô thứ 55 trong bảng tuần hoàn Mendeleev, các chất hữu cơ có cấu trúc phức tạp làm nhiệm vụ chuyển hóa hydro, các chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử tiền enzyme, các chất có khả năng phục hồi nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Hình 6 Ảnh hưởng của chất hoạt hoá đến hoạt động enzyme 2.2.6 Phản ứng thủy phân bởi enzyme

2.2.6.1 Ý nghĩa của phản ứng thủy phân

Phản ứng thủy phân là phản ứng rất phổ biến và rất quan trọng trong bảo quản và sản

Enzyme không hoạt động Chất cảm ứng

Cơ chẩt

Enzyme hoạt động

EP

Kp

xuất thực phẩm Do phản ứng thủy phân mà chất lượng sản phẩm bị giảm đi và cũng nhờ phản ứng thủy phân mà chất lượng sản phẩm tăng lên

Phản ứng thủy phân thường là mở dầu cho một loạt các phản ứng khác tiếp diễn Các phản ứng khác có thể xảy ra khi phản ứng thủy phân kết thúc Xét về mặt sinh học phản ứng thủy phân thường đặc trưng cho giai đoạn phân giải – giai đoạn kết cùng của một quá trình sinh học

Bên cạnh đó, trong kĩ thuật sản xuất các sản phẩm thực phẩm, phản ứng thủy phân có vai trò rất quan trọng Để giảm bớt tổn thất các chất thực phẩm, người ta phải tìm các biện pháp kĩ thuật tương ứng để ngăn ngừa và hạn chế các phản ứng thủy phân Trái lại, nếu qua phản ứng thủy phân mà chất lượng thành phẩm tăng lên thì người ta phải tạo điều kiện cho phản ứng ấy diễn ra tới cùng

Chẳng hạn từ tinh bột, muốn có được đường nha hay dường glucose người ta phải tạo điều kiện để phản ứng thủy phân tinh bột bằng enzyme đạt đến mức tối đa Quá trình sản xuất rượu, bia thực chất là quá trình oxy hóa sinh học, nhưng để có được quá trình thực chất này trước đó phải có phản ứng thủy phân Vì vậy trước khi lên men rượu người ta phải đường hóa tinh bột thành đường, nghĩa là phải thực hiện phản ứng thủy phân

2.2.6.2 Đặc điểm của các cơ chất bị enzyme thủy phân

Các cơ chất được enzyme thủy phân thường là gluxit, protein, lipit, este, liên kết trong anhidrit v.v…Theo Bernard Pullman và Alberte Pullman, đặc điểm chung của những

cơ chất này là có “liên kết bị thủy phân” do các nguyên tử tích điện dương tạo nên Người ta gọi liên kết này là “liên kết nhị dương” Liên kết này do các electron δ định vị của liên kết đơn và một hệ thống electron л linh động tạo nên Ở đây ta chỉ xét cơ chất

bị enzyme thủy phân là gluxit

Liên kết glucozit trong các polysaccharit, liên kết glucozit chỉ có các electron δ mà không có electron л tham gia Trong trường hợp riêng này, đóng vai trò phân cực là bộ electron δ Do hiệu ứng cảm ứng của nguyên tử oxy trung tâm, nên gây ra một sự tập trung điện tích nào đó trên nguyên tử oxy, do đó oxy tích điện âm Còn các nguyên tử cacbon kết hợp với nó bị khuyết electron nên tích điện dương

- Sự thủy phân bởi enzyme sẽ càng dễ dàng khi sự khuyết electron trong liên kết bị thuỷ phân càng lớn

Sự khuyết đó có thể được tăng lên khi tăng tổng điện tích dương của cả hai nguyên tử tạo thành liên kết hoặc khi chỉ tăng điện tích của một trong hai

Nếu trong phân tử cơ chất có nhiều liên kết giống nhau thì liên kết nào nhị dương hơn

cả sẽ bị phân ly thủy phân bởi enzyme ( với điều kiện không có án ngữ không gian và đặc hiệu lập thể của từng liên kết)

2.2.6.3 Cơ chế tác dụng của enzyme hydrolase

Sự khuyết electron trong liên kết bị thủy phân là yếu tố quan trọng quyết định khả năng

và sự dễ dàng của phản ứng thủy phân

Tác dụng xúc tác của enzyme sẽ phụ thuộc vào từng trường hợp và do sự phân bố electron đã tồn tại trước đó quyết định

Enzyme có thể tác dụng bằng các cách khác nhau Cơ chế đơn giản nhất cho phép liên

hệ “phần dương” của liên kết bị thủy phân dưới tác dụng của enzyme là: tâm ái nhân của enzyme sẽ tương tác trực tiếp với một trong hai nguyên tử tích điện dương của liên kết bị thủy phân Sự tạo thành phức hợp như thế với trung tâm phản ứng sẽ làm cho sự đứt các liên kết và sự thủy phân được dễ dàng thuận lợi

Một cơ chế khác liên hệ tính tác dụng của enzyme với sự khuyết electron của liên kết

bị thủy phân là: enzyme làm tăng sự khuyết electron vốn đã tồn tại trước đó, bằng cách tạo thành liên kết tương ứng với cơ chất ở những vị trí ít nhiều gần gũi với liên kết bị thủy phân Nhờ vậy mà làm cho sự phân bố electron trong phân tử cơ chất bị thay đổi theo một chiều hướng cần thiết, khiến cho việc đứt liên kết được dễ dàng hoặc khiến cho một trong hai nguyên tử của liên kết tương tác được với các tác nhân ái nhân (Lê Ngọc Tú, 2004).

2.2.7 Một số đặc điểm của phản ứng thủy phân

2.2.7.1 Thứ bậc của phản ứng

Sơ đồ chung của phản ứng thủy phân bởi enzyme có thể biểu diễn như sau:

A – B + H2O hydrolaza AH + BOH

Cơ chất + nước enzyme sản phẩm

Nhìn sơ đồ chúng ta thấy: phản ứng thủy phân bởi enzyme là phản ứng lưỡng phân Nhưng vì nồng độ của nước rất lớn coi như không thay đổi trong suốt thời gian phản ứng, do đó vận tốc của phản ứng chỉ phụ thuộc vào nồng độ cơ chất Như vậy phản ứng thủy phân bởi enzyme là phản ứng đơn phân, bậc nhất

Như chúng ta đều biết, trong các phản ứng đơn phân các phân tử khởi đầu sẽ phản ứng một các độc lập không phụ thuộc vào sự có mặt của những phân tử khác Nếu gọi a là

số phân tử gam ban đầu của cơ chất, gọi x là số phân tử gam của cơ chất bị thủy phân trong khoảng thời gian từ t tới t +dt, thì x sẽ tỉ lệ với khoảng thời gian dt và số phân tử gam còn lại (a – x) chưa bị thủy phân trong thời gian t Ta sẽ có:

)(a x k dt dx

Sau một số biến đổi ta sẽ có hệ thức để tính lượng cơ chất bị thủy phân trong khoảng thời gian t bất kì

)1

( e kt a

Và hằng số vận tốc của phản ứng thủy phân bởi enzyme k1:

x a

a t

Ngoài ra, pH và nhiệt độ cũng là yếu tố điều chỉnh phản ứng thủy phân bởi enzyme Mỗi enzyme thủy phân (hydrolase) có một nhiệt độ và pH tối ưu riêng Ngay cùng một enzyme hydrolase, nhưng lấy từ các nguồn khác nhau cũng có pH, nhiệt độ tối ưu khác nhau Các quá trình đường hóa trong sản xuất rượu, bia, bánh mì là những quá trình thủy phân bằng enzyme với mức độ khác nhau Ở đây người ta chủ yếu dựa vào nhiệt

độ và pH để điều chỉnh các phản ứng thủy phân theo chiều hướng mong muốn

- Khi thủy phân bằng enzyme hydrolase có một số ưu nhược điểm sau:

Khi thủy phân bằng enzyme còn cho phép điều chỉnh được thành phần hóa học của sản

Dung dịch do enzyme thủy phân thường khó lọc hơn khi thủy phân bằng axit

Nhằm khắc phục những nhược điểm và phát huy những ưu điểm của phương pháp thủy phân bằng enzyme, hiện nay một số ngành sản xuất thực phẩm đang xuất hiện phương pháp thủy phân mới: phương pháp thủy phân bằng axit – enzyme, và bằng enzyme – axit

Phương pháp mới này kết hợp được tính chất nhanh chóng và đơn giản của thủy phân bằng axit và khả năng to lớn, tiềm tàng và đầy triển vọng của thủy phân bằng enzyme

(Lê Ngọc Tú, 2004)

2.2.8 Hệ enzyme sử dụng và đặc tính kỹ thuật

2.2.8.1 Enzyme amylase (EC 3.2.1.1)

Giới thiệu chung về hệ enzyme amylase

Enzyme amylase có cả ở thực vật, động vật và vi sinh vật

Amylase được tổng hợp bằng con đường sinh học, chúng không thể tổng hợp bằng con đường hóa học Do đó muốn thu nhận amylase chỉ có con đường là thu nhận từ cơ thể sinh vật hay nói cách khác là bằng con đường sinh tổng hợp

Hoạt tính enzyme amylase sinh ra từ nấm mốc và vi khuẩn là tương đương nhau nhưng khả năng đường hóa của enzyme nấm mốc tốt hơn enzyme của vi khuẩn, ngược lại khả năng dịch hóa (tạo dextrin) của enzyme vi khuẩn lại cao hơn của enzyme nấm mốc Enzyme có nhiều tính chất ưu việt hơn hẳn các chất xúc tác hóa học do có tính đặc hiệu cao và hiệu lực xúc tác lớn

Amylase thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác sự phân giải liên kết glucoside nội phân tử trong các polysaccharide với sự tham gia của nước Enzyme amylase thuộc loại hydrolase, chỉ chứa những phân tử protein thuần, nghĩa là sản phẩm phân giải của enzyme này hoàn toàn chỉ gồm những acid amin Vì vậy chúng thuộc enzyme đơn giản

Enzyme amylase là một loại enzyme có ý nghĩa quan trọng trong thực phẩm Amylase xúc tác thủy phân tinh bột, được sử dụng nhiều nhất trong lĩnh vực đường hóa trong thực phẩm Thủy phân tinh bột trước tiên cho những polymer mạch ngắn gọi là dextrin sau đó thành maltose và cuối cùng thành glucose Các enzyme trong lĩnh vực đường hóa tinh bột là α-amylase, β-amylase, γ-amylase, glucose isomerase…

α – amylase (α – 1,4-glucan 4- glucanhydrolase)

Amylase là enzyme nội thủy phân có khả năng phân cắt liên kết 1,4 glucoside của

cơ chất một cách ngẫu nhiên Sản phẩm tạo thành gồm chủ yếu là các dextrin có phân

tử lượng thấp và ít maltose và glucose Enzyme amylase có khả năng thủy phân hạt tinh bột và dung dịch hồ tinh bột, dung dịch hồ tinh bột sẽ bị làm loãng nhanh chóng và các dextrin sẽ được tạo thành cho phản ứng màu với iodine hay cho màu đỏ nâu Do đó, có thể xác định hoạt tính của α-amylase bằng cách đo độ nhớt của dung dịch tinh bột hoặc xác định lượng tinh bột đã bị phân giải dựa vào phản ứng màu với iodine hoặc bằng cách xác định đường khử tạo thành

Điểm đẳng điện enzyme amylase nằm trong vùng pH 4,2 – 5,7 Trong phân tử amylase có ít nhất một ion Ca2+ có tác dụng làm bền cấu trúc bậc 2, bậc 3 của phân tử enzyme α-amylase sẽ hoàn toàn mất hết khả năng thủy phân cơ chất nếu bị loại bỏ ion này Enzyme α -amylase được hoạt hóa bởi ion đơn hóa trị Cl- > Br - > I- nếu chúng có nguồn gốc động vật và vi sinh vật Nếu có nguồn gốc thực vật thì được hoạt hóa bởi ion hóa trị II (Ca2+, Mg2+) Chúng bị kiềm hãm bởi ion kim loại nặng như: Cu2+, Hg2+… α –amylase kém bền trong môi trường acid nhưng khá bền nhiệt (bền nhất trong hệ enzyme amylase) Đặc tính kĩ thuật của enzyme α-amylase được trích ly từ các nguồn khác nhau được thể hiện ở bảng 4

α-Bảng 4 Đặc điểm của α-amylase từ các nguồn khác nhau

3 α- amylase nấm sợi Aspergilus oryzae 4,0 – 7,0 55 - 60

4 α- amylase malt Dịch malt 3,5 – 7,5 60 - 70

(Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Bảng 5 Độ bền nhiệt của α-amylase từ các nguồn khác nhau

Nhiệt độ (0 C)

Hoạt độ α- amylase (% so với hoạt độ ban đầu)

β-amylase là một loại albumin Tâm xúc tác của nó chứa gốc -SH, -COOH cùng với vòng imidazol của gốc histidin β-amylase chỉ phổ biến trong thực vật, đặc biệt

có nhiều trong hạt nảy mầm β- amylase rất bền khi không có ion Ca2+, bền với acid hơn α- amylase nhưng không bằng glucoamylase và bị kìm hãm bởi ion kim loại nặng như Cu2+, Hg2+ , urê, ozon, iod…

Glucoamylase (EC 3.2.1.3)

Glucoamylase có khả năng thủy phân liên kết 1,4 và 1,6 glucoside Ngoài ra còn

có khả năng thủy phân các liên kết 1,2 và 1,3 glucoside

Glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glucogen, dextrin…

thành glucose mà không cần có sự tham gia của các amylase khác

Đa số glucoamylase có hoạt lực cao nhất ở vùng pH 3,5 - 5,5 và nhiệt độ 50oC, enzyme này khá bền với acid nhưng lại kém bền dưới tác dụng của rượu etylic, aceton,

không bền với ion kim loại nặng như Cu2+, Hg2+.… có tác dụng thủy phân tinh bột, glucogen, polysacarit đồng loạt ở các mối nối liên kết 1,4 glucoside Nó có giá trị đặc biệt trong sản xuất rượu, chuyển những dextrin có phân tử cao không lên men được

và do đó nâng cao được hiệu suất nấu rượu từ các tinh bột (Lương Đức Phẩm, 2004) Đặc tính kĩ thuật của enzyme glucoamylase được trích ly từ các loại nấm mốc khác nhau được thể hiện ở bảng 5

AMG - Amyloglucosidase Novo - là một chất exo-1,4-α-D-glucosidase

(gluco-amylase) được sản xuất từ chủng vi sinh vật chọn lọc có tên là Aspergillus niger bằng

sự lên men chìm Tên theo hệ thống là 1,4-α-D-Glucan glucohydrolase (EC.3.2.1.3) Enzyme thuỷ phân các cầu nối α-1,4 và α-1,6 trong tinh bột

Trong quá trình thuỷ phân các gốc glucose được tách rời theo thứ tự từ đầu không khử của phân tử chất nền Mức độ thuỷ phân tuỳ thuộc vào loại liên kết cũng như chiều dài chuỗi các mối nối; liên kết α-1,4 dễ dàng thuỷ phân hơn liên kết α-1,6

Chế phẩm AMG 300L ở dạng lỏng, có màu nâu, có độ đặc chung là 1,2g/ml Khi AMG (ở dạng lỏng) được tồn trữ ở 25oC, hoạt tính phổ biến được duy trì ít nhất

06 tháng Khi tồn trữ ở 5oC sản phẩm giữ được hoạt tính phổ biến trong ít nhất một năm Đối với các phản ứng lâu (40 - 100 giờ) như là để sản xuất đường glucose sirúp với năng suất cao, các điều kiện tối ưu được đề nghị là pH 4,5 và nhiệt độ 60oC

Sự trao đổi ion hay xử lý carbon của dung dịch đường thường sẽ làm mất hoạt tính của chế phẩm AMG Với hình thức khác, hoạt tính của chế phẩm AMG có thể mất bằng cách đun dung dịch đến 80oC trong 5 phút hoặc 75oC trong khoảng 40 phút (NOVO Nordish A/S, B296 & B194)

Isoamylase(EC 3.2.1.68) và pullulanase (EC 3.2.1.41)

Isoamylase là enzyme thu nhận từ nấm men và nấm sợi còn pullulanase là enzyme thu

nhận từ vi khuẩn Aerobacter aerogenes hay từ Klebsiella

Dưới tác dụng của isoamylase hoặc pullulanase, sản phẩm tạo thành sẽ là glucose Trong quá trình thuỷ phân, người ta thường sử dụng enzyme này với amyloglucosidase Hoạt tính tối ưu của chúng ở pH 6,0 và nhiệt độ 60oC Khi thuỷ phân cùng với amyloglucosidase, hoạt tính tối ưu của chúng ở pH 4,0-5,0 và nhiệt

a Pectinesterase (PE)

Loại enzyme phân cắt liên kết ester giữa methanol và nhóm carboxyl của acid galacturonic Chúng thủy phân trước nhất là nhóm methylester nằm giữa hai nhóm carboxyl tự do Và sau đó sẽ thủy phân lần lượt các ester nằm dọc theo phân tử pectin Kết quả là tạo thành acid pectinic, acid pectic, và rượu ethanol

b Polygalacturonase (PG)

Là enzyme tác dụng lên pectin , acid pectic và acid pectinic Các sản phẩm trung gian của quá trình thủy phân pectin bởi Polygalacturonase có thể là các acid penta, tetra, tri

và digalacturonic D

Dựa vào cơ chế tác dụng có thể chia polygalacturonase thành hai nhóm:

o Endopolygalacturonase phân cắt liên kết α-1,4 ở phía trong mạch phân tử pectin cũng như ở phía trong phân tử polygalacturonic

o Endopolygalacturonase có khả năng phân cắt dần dần từng phân tử

acidgalacturonase ở đầu mạch pectin

pH và nhiệt độ tối ưu của các polygalactucacsic cũng phụ thuộc vào nguồn thu và cơ chất

Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzymepectinase:

 Ảnh hưởng của thành phần hoá học của nguyên liệu:

Tình trạng chất lượng pectin ảnh hưởng nhiều tới sự tạo độ nhớt của dịch quả và khả năng thuỷ phân của enzyme pectinase Pectin có độ ester hoá càng cao thì độ nhớt càng cao và hiệu quả tác dụng của polygalacturonase càng thấp

Các acid hữu cơ có trong quả ức chế enzyme pectinase với mức độ khác nhau Acid citric và acid tartric ở nồng độ 0,4% có tính chất ức chế hầu như giống nhau Ở nồng

độ 0,8%, acid citric ức chế enzyme pectinase mạnh hơn so với acid tartric

Hiệu quả tác dụng của enzyme pectinase cũng bị ảnh hưởng bởi các ion có trong dịch quả

 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme pectinase:

Khi lựa chọn nồng độ chế phẩm enzyme nên chọn lựa tối thiểu mà bảo đảm được các biến đổi cần thiết với thời gian mà công nghệ của dạng nước quả cho phép Không tuỳ

thuộc vào hoạt độ của một chế phẩm hoặc của một enzyme, hiệu quả tác dụng của chế phẩm hoàn toàn phụ thuộc vào thành phần của enzyme và đặc điểm của nguyên liệu chế biến

 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Trong vài phút đầu, nhiệt độ không ảnh hưởng tới hoạt tính của enzyme Ảnh hưởng của nhiệt độ biểu hiện sau 3÷5 phút tính từ lúc bắt đầu phản ứng Sự giảm độ nhớt chậm lại phụ thuộc vào nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzyme Endo-polygalacturonase bị ức chế hoàn toàn ở 700C sau 1 giờ, nhưng ở 45÷500C tốc độ thủy phân do enzyme tăng Khi xử lý lâu ở nhiệt độ cao chất lượng quả của nhiều loại nguyên liệu bị giảm đi, vì vậy thường sử dụng nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ tối thích của enzyme

 Ảnh hưởng của pH:

Các enzyme pectinase có nguồn gốc khác nhau có pH tối thích khác nhau Pectinesterase có nguồn gốc thực vật tác dụng mạnh trong khoảng pH=6,5÷9,5, pectinesterase của nấm có khoảng pH tối thích 4,0÷5,2, còn pectinesterase của vi khuẩn hoạt động mạnh nhất ở pH=7,0÷9,0, pH tối thích của enzyme không cố định,

có thể thay đổi tuỳ theo nguồn gốc và các chất đã tạo nên trị số đó (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.2.9 Động thuyết của quá trình thủy phân tinh bột

Do thành phần cần thủy phân trong mít nghệ là chất bột đường (chủ yếu là tinh bột), nên trong phần này tôi chọn tinh bột là cơ chất

Phản ứng và tốc độ thủy phân tinh bột

Phản ứng thủy phân tinh bột có thể biểu diễn như sau:

Tinh bột + nước Sản phẩm đường

Phản ứng thủy phân tinh bột bằng enzyme amylase là phản ứng lưỡng phân nhưng vì lượng nước trong dịch rất lớn nên xem như nồng độ nước không thay đổi trong suốt thời gian phản ứng Do đó tốc độ thủy phân chỉ phụ thuộc vàonồng độ cơ chất là tinh bột và thủy phân tinh bột là phản ứng đơn phân Do vậy tốc độ phản ứng được biểu diễn như sau:

 

TB K dt

TB d

v  [TB]: nồng độ tinh bột

 TB const K

v n Suy ra n=0 Như vậy trong giai đoạn đầu của thủy phân tinh bột phản ứng là bậc “0”

Theo nghiên cứu của Denxicốp với amylase của A.Oryzae phản ứng bậc 0 sẽ xảy ra khi

hàm lượng tinh bột trong dịch được thủy phân ít hơn 50%, nhưng với amylase của

A.awamori lại nhỏ hơn hoặc bằng 30% so với toàn bộ lượng có trong dịch tinh bột

Tính chất này được áp dụng để xác định lượng enzyme và thời gian phản ứng khi xác định hoạt độ enzyme

Càng về sau nồng độ cơ chất càng giảm dần, đồng thời nồng độ sản phẩm tạo thành tăng, lúc đó tốc độ phản ứng không còn là hằng số nữa mà biến đổ theo thời gian Bậc của phản ứng không còn là bậc “0” nữa mà có thể là bậc 1, bậc 2 hoặc hơn nữa

Tốc độ phản ứng có thể biểu diễn theo lượng sản phẩm tạo thành và bằng:

 

dt

M d

v 

[M] : lượng đường tạo thành trong thời gian t, có thể tính theo maltose hoặc glucose Cũng có thể biểu diễn tốc độ phản ứng theo sự biến đổi tính chất hóa lý của dịch như góc quay mặt phẳng phân cực, độ nhớt hay màu với dung dịch Iot…

Nếu quan sát sự gia tăng lượng chất khử chung và tính theo glucose chẳng hạn thì giai đoạn mà ở đó mức thủy phân còn ít hơn 50%, ta có thể viết:

) (a G K dt

a t

- Trong giai đoạn đầu cuối α-1,4-glucozit được phân cắt bởi nhiều enzyme, về sau mỗi enzyme chỉ phân cắt được nối đặc hiệu của mình

- Các enzyme đều có độ bền khác nhau khi chịu tác động của nhiệt độ, pH và thời gian,

do đó khi đường hóa mỗi enzyme ít nhiều đều bị giảm hoạt độ với mức khác nhau (Bùi

Ái, 2003)

2.2.10 Quá trình đường hóa, các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình đường hóa và sự biến đổi các chất khác trong quá trình đường hóa

 Quá trình đường hóa: sử dụng enzyme glucoamylase phân cắt nối α-1,4

glucozit và α-1,6 glucozit và biến tinh bột thành đường glucose

 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình đường hóa:

Tốc độ thủy phân tinh bột của enzyme amylase phụ thuộc vào sự liên kết “enzyme – tinh bột” Sự tạo liên kết này là do hấp thụ lẫn nhau giữa các nhóm háo nước có trên

bề mặt của các hạt tinh bột và enzyme như – COOH, - OH, - CHO, - CO, - NH2, - SH Các nhóm này khi tác dụng lẫn nhau sẽ làm giảm năng lượng bề mặt, làm biến dạng các phần riêng biệt của phân tử amylose và amylopectin cuối cùng dẫn đến làm đứt các nối glucoside để tạo ra sản phẩm giải phóng enzyme Enzyme được giải phóng lại tiếp tục liên kết mới và thực hiện nhiều chu trình tiếp theo Mỗi enzyme chỉ có thể hoạt động tốt khi ở trạng thái nhất định Trạng thái này phụ thuộc nhiệt độ, pH, và sản phẩm của môi trường phản ứng (Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2005)

=>Vì thế tốc độ thủy phân tinh bột phụ thuộc vào các yếu tố: nhiệt độ, pH, nồng độ enzyme

Ảnh hưởng của nhiệt độ

Tốc độ phản ứng enzyme tăng giảm theo nhiệt độ, nhưng sự tăng giảm nhiệt độ chỉ trong giới hạn nhất định, thường trong khoảng 550C – 600C Đại lượng đặc trưng cho ảnh hưởng của nhiệt độ đến vận tốc phản ứng là hằng số Q10:

t

t k

Do đó, hiệu suất thu hồi giảm

Khi sản phẩm đường hình thành với lượng ít thì nhiệt độ tối thích để bảo vệ hoạt độ của enzyme amylase là 500C – 560C Khi sản phẩm đường hình thành nhiều, nhiệt độ

hồ hóa không nên vượt quá 570C – 580C Nếu vượt quá nhiệt độ này thì hiệu suất tổng thu hồi thấp Nhiệt độ thủy phân thấp 400C – 450C sẽ bị vi khuẩn có trong dịch cháo

tấn công Tuy nhiên, đường hóa ở nhiệt độ thấp sẽ tạo ra nhiều đường đơn có thể đạt 67% – 80%, quá trình lên men triệt để hơn (Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2004).

Nhiệt độ mà ở đó tốc độ phản ứng đạt cao nhất được gọi là nhiệt độ tối ưu Nhiệt độ tối

ưu phụ thuộc vào nhiều yếu tố như là: nguồn gốc hệ enzyme, thời gian tác dụng, pH của môi trường

 Nhiệt độ tối ưu phụ thuộc vào nguồn gốc hệ amylase: ví dụ như enzyme α - amylase của vi khuẩn chịu nhiệt có nhiệt độ tối thích cao và đạt 950C – 1000C; nhưng α-amylase của của thóc mầm nhiệt độ tối ưu chỉ 730C – 760C, còn α-amylase của

A.oryzae lại có nhiệt độ tối ưu là 500C – 550C

 Nhiệt độ tối ưu phụ thuộc vào nồng độ cơ chất trong dung dịch Ví dụ, với dung

dịch 1 % tinh bột, nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme amylase A Oryzae là

500C và của A awamorii là 550C Trong dung dịch 5 % tinh bột nhiệt độ tối ưu của

amylase A Oryzae là 550C và của A awamorii là 600C Khi tăng nồng độ tinh bột lên đến 10 % thì nhiệt độ tối ưu của enzyme amylase A Oryzae và của A awamorii vẫn

chỉ là 550C và 600C Như vậy hoạt độ của enzyme sẽ được bảo vệ khi tăng nồng độ cơ chất trong dung dịch nhưng chỉ trong giới hạn nhiệt độ xác định với mỗi enzyme

 Nhiệt độ tối ưu còn phụ thuộc vào thời gian tác dụng Thời gian tác dụng lâu sẽ làm giảm khả năng chịu nhiệt của enzyme Quá trình đường hóa trong sản xuất rượu từ tinh bột không được phân hủy hoàn toàn, thường chỉ đạt 20% – 30% Vì vậy không nên kéo dài thời gian đường hóa quá lâu để tạo thành nhiều đường vì như vậy thì chu kỳ sản xuất kéo dài hoạt tính enzyme amylase bị ảnh hưởng Trong thực tế sản xuất rượu người ta luôn tìm cách rút ngắn thời gian đường hóa hoặc tiến hành ở nhiệt độ thấp hơn

20C – 30C so với nhiệt độ tối ưu

 Nhiệt độ tối ưu còn phụ thuộc vào pH của môi trường phản ứng, tăng cùng với pH trong giới hạn nhất định

Ảnh hưởng của pH

Tất cả các protein đều là lưỡng tính Tính chất này phụ thuộc vào pH của môi trường Các nhóm axit hoặc kiềm của enzyme có khả năng ion hóa Khi thay đổi pH của môi trường sẽ xảy ra liên kết nào đó với ion H+ hoặc OH- Do đó mức độ ion hóa của nhóm này hoặc nhóm khác trong phân tử enzyme sẽ bị giảm Nếu nhóm đó lại đóng vai trò trung tâm hoạt động của enzyme thì sự tạo thành liên kết enzyme – cơ chất sẽ bị ức chế

và do đó sẽ ảnh hưởng tới quá trình thủy phân Sự phụ thuộc hoạt tính của enzyme vào

pH được thể hiện trong hình 8

Hình 8 Sự phụ thuộc của hoạt tính enzyme vào pH

Nếu tăng hoặc giảm pH sẽ làm giảm tác dụng thủy phân tinh bột của amylase Trong

đó sự giảm pH sẽ ảnh hưởng nhiều hơn so với tăng pH Khi tăng nhiệt độ phản ứng thì

pH tối ưu sẽ dịch chuyển về phía pH lớn hơn Đa số pH của dịch cháo đều trong khoảng 4,8 – 5,2 rất phù hợp với hoạt động của hệ enzyme amylase

Bảng 8 Sự phụ thuộc pH tối ưu vào nhiệt độ

(Nguồn: Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2005)

Ảnh hưởng của nồng độ enzyme

Sự thủy phân tinh bột là tổng các tác dụng của một số enzyme chứa trong thóc mầm, nấm mốc hoặc vi khuẩn Mỗi hệ amylase đều có số lượng và hoạt độ khác nhau của từng enzyme Thực tế sản xuất chỉ cần biết hoặc là khả năng đường hóa chung của chế phẩm hay cần xác định cả hoạt độ α–amylase và glucoamylase Khi tăng nồng độ enzyme thì tốc độ thủy phân tinh bột sẽ tăng và tỉ lệ thuận với lượng enzyme đưa vào trong điều kiện không thay đổi về nồng độ cơ chất, nhiệt độ môi trường, pH môi trường

Trong thực tế sản xuất, lượng chế phẩm enzyme đưa vào khi đường hóa được tính theo phần trăm so với lượng tinh bột chứa trong cháo nấu Tùy theo chất lượng của chế phẩm amylase, tỉ lệ này có thể rất khác nhau và dao động trong giới hạn khá lớn Tỉ lệ

này cũng không cố định mà giảm theo trình độ công nghệ đạt được trong sản xuất chế phẩm amylase

 Một số biến đổi khác trong quá trình đường hóa

 Ngoài biến đổi chủ yếu của tinh bột thành đường, khi đường hóa còn xảy ra một

số biến đổi của các chất khác Mức độ biến đổi không nhiều và phụ thuộc vào nguồn enzyme amylase sử dụng Trong chế phẩm amylase thu nhận từ nấm mốc luôn chiếm một lượng pectinase và hemixenlulose Do đó khi đường hóa sẽ có một lượng pectin được phân hủy để tạo ra axit pectic và acol metylic Một lượng nhỏ hemixenlulose được thủy phân thành dextrin và đường pentose, glucose Dextrin sau này sẽ biến thành maltose và lên men được, còn pentose không tham gia vào phản ứng tạo rượu

 Biến đổi màu sắc do nhiều nguyên nhân:

 Biến đổi chất thơm

- Đối với các phản ứng hóa học như thủy phân, trung hòa…thì nhiệt độ tăng làm tốc

độ phản ứng tăng Kết quả của sự xúc tiến các phản ứng hóa học là sự biến đổi các thành phần hóa học trong vật liệu Một số chất được tạo thành có thể làm tăng chất lượng sản phẩm (chất thơm, chất màu, pectin ) (Lê Thị Bạch Tuyết và ctv.,1996)

- Tạo mùi trong quá trình gia nhiệt: Trong quá trình chế biến thực phẩm có nguồn gốc từ thực vật dưới tác dụng của nhiệt độ cao các hợp chất phenol đều bị oxy hóa và chuyển thành các octoquinon tương ứng Trong trường hợp này nếu trong hệ thống phản ứng có các axit amin, các octoquinon sẽ thực hiện phản ứng cộng với các axit amin đó Sau đó, các sản phẩm của phản ứng cộng, một lần nữa, lại bị oxy hóa thành các octoquinon tương ứng Chính dạng octoquinon này tiếp tục tác dụng với những axit amin còn lại để tiến hành các quá trình deamin hóa, khử CO2 và giải phóng ra các

alđehit bay hơi có mùi thơm tương ứng, (Lê Ngọc Tú và ctv.,2003)

2.2.11 Các phương pháp xác định hoạt độ Enzyme

2.2.11.1 Nguyên tắc chung của các phương pháp xác định hoạt độ enzyme

Phản ứng do enzyme có thể khái quát đơn giản hóa bằng phương trình phản ứng:

Có thể xác định hoạt độ enzyme bằng cách phân tích sự biến đổi theo thời gian trong điều kiện phản ứng xác định của: cơ chất còn lại; hoặc sản phẩm tạo thành; hoặc cả cơ chất và sản phẩm Tùy theo đặc trưng của phản ứng, sự tiện lợi của phương pháp, yêu

cầu về độ chính xác, điều kiện của phòng thí nghiệm…mà chọn cách xác định phù hợp nhất Tuy nhiên, cách đáng tin cậy nhất trong mọi trường hợp là xác định sản phẩm tạo thành theo thời gian (vì có thể hoạt độ enzyme cần xác định rất thấp, sự chuyển hóa cơ chất khó đo được chính xác, cho nên sự xuất hiện của sản phẩm có thể được xác định bằng những cách đo đặc hiệu cho phép khẳng định sự có mặt của enzyme một cách tin cậy)

2.2.11.2 Các đơn vị đo hoạt động xúc tác của enzyme

Đơn vị IU (International Unit): Một đơn vị IU là hoạt độ của một enzyme ở điều kiện tiêu chuẩn thích hợp, xúc tác cho phản ứng chuyển hóa một µmol cơ chất trong một phút

1 IU = 1 µmol cơ chất/phút = (10-6 mol/60 giây)

Đơn vị Katal (viết tắt là kat ): Một đơn vị kat là lượng enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hóa một mol cơ chất trong một giây ở các điều kiện phân tích (đơn vị kat ít được dùng)

1 kat = 1 mol cơ chất /giây

 1kat = 60 x 106 IU

2.2.11.3 Hoạt độ riêng (specific activity)

Hoạt độ riêng của enzyme được tính bằng số đơn vị hoạt độ enzyme ứng với một mililit dung dịch (nếu là dịch) hoặc một miligam protein (nếu là bột khô của chế phẩm) Hoạt độ riêng là một chỉ tiêu quan trọng đánh giá độ sạch của chế phẩm enzyme Trong quá trình tinh sạch enzyme, nếu hoạt độ tổng số của enzyme không thay đổi nhiều thì hoạt độ riêng sẽ tăng lên, nếu hoạt độ riêng không tăng lên nghĩa là chế phẩm đã có độ tinh khiết rất cao (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.2.12 Điều kiện phản ứng khi tiến hành xác định hoạt độ enzyme

Trong phản ứng xác định hoạt độ enzyme, cần sử dụng cơ chất và cofactor ở mức dư thừa (nếu enzyme cần cofactor) và thời gian xác định càng ngắn càng tốt Vì một số enzyme bị ức chế bởi cơ chất ở nồng độ quá cao; hoặc bị giảm hoạt độ nhanh chóng theo thời gian ở nhiệt độ phân tích Do đó phản ứng phân tích nên thực hiện trong khoảng thời gian nhất định và nồng độ enzyme lẫn cơ chất thích hợp

Với những enzyme cần có chất hoạt hóa hoặc chất làm bền thì phải cho các chất này vào enzyme trước khi cho cơ chất vào hỗn hợp phản ứng

Xác định hoạt độ cần tiến hành ở pH thích hợp và cố định Nhưng cần chú ý pH thích hợp có thể thay đổi khá nhiều tùy thuộc vào thành phần cơ chất và dung dịch đệm, lực ion của dung dịch đệm (thường trong phạm vi 0,01 – 0,1)

Nhiệt độ dùng để xác định hoạt độ cần phải thấp hơn nhiệt độ tối ưu của enzyme đề phòng tác dụng kìm hãm enzyme do nhiệt độ cao

Thời gian xác định hoạt độ thường từ 5 đến 30 phút Trong một số trường hợp có thể kéo dài 24 giờ nếu hoạt độ enzyme quá thấp Trong trường hợp cần phải cho thêm vào dung dịch các chất diệt vi sinh vật và tránh dùng những dung dịch đệm thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật

Cần phải chọn lựa các điều kiện sao cho có được sự biến đổi tuyến tính giữa nồng độ enzyme, thời gian phản ứng và mức độ chuyển hóa cơ chất (trong giới hạn nồng độ cơ chất đã lựa chọn) (Lê Ngọc Tú, 2004)

2.2.13 Các phương pháp xác định hoạt độ enzyme

2.2.13.2 Phân tích gián đoạn

- Là phương pháp cho enzyme tác dụng với cơ chất sau một khoảng thời gian nhất định thì ngừng phản ứng enzyme bằng cách thích hợp và sau đó đo lượng cơ chất còn lại hoặc sản phẩm tạo thành Để ngừng phản ứng có thể dùng các tác nhân làm bất hoạt enzyme: nhiệt độ cao, thay đổi pH, dùng chất tạo phức hay tách enzyme ra khỏi hỗn hợp…Phương pháp này khắc phục những hạn chế của phương pháp đo liên tục, phản ứng có thể tiến hành trong tủ ấm hay bể nhiệt ổn định, có thể tiến hành một lúc nhiều mẫu…tuy nhiên vấn đề đặt ra là phải tìm cách làm ngưng phản ứng thích hợp nhất

(Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.2.14 Dựa theo nguyên tắc xác định hoạt độ trên, có thể xác định theo một hoặc một số phương pháp chính sau đây

2.2.14.1 Phương pháp đo độ nhớt: Dùng nhớt kế đo sự biến đổi độ nhớt của dung

dịch phản ứng Áp dụng với các enzyme mà cơ chất có độ nhớt cao hơn hẳn so với sản phẩm (chất có phân tử lớn như acid nucleic, protein, cellulose…)

2.2.14.2 Phương pháp phân cực kế: Sử dụng khi cơ chất và sản phẩm có khả năng

làm quay mặt phẳng ánh sáng phân cực và có góc quay riêng khác nhau

2.2.14.3 Phương pháp đo áp suất hay áp kế: Dùng với các phản ứng enzyme có sự

tiêu hao hay sinh khí, như các phản ứng oxy hóa, decarboxyl hoá, loại amin hóa

Phản ứng sinh hay tiêu hao khí có thể trực tiếp hay gián tiếp

2.2.14.4 Phương pháp quang phổ kế: Được sử dụng phổ biến hiện nay, dựa trên

khả năng hấp thu ánh sáng ở các bước sóng xác định của cơ chất, hoặc sản phẩm phản ứng

2.2.14.5 Phương pháp chuẩn độ: Dùng cho các phản ứng enzyme có sự hình thành

acid hoặc base Phương pháp yêu cầu giữ pH môi trường cố định, lượng kiềm hoặc

acid chuẩn dung để chuẩn độ theo thời gian phản ánh hoạt độ enzyme

2.2.14.6 Phương pháp sắc ký: Sử dụng sắc ký để phân tách sản phẩm phản ứng,

như tách amino acid sau khi cho hai enzyme aminotranspherase lên cơ chất hay protein tác dụng lên cơ chất và sau đó dịnh lượng các amino acid thu được Đây là phương pháp tốn nhiều thời gian, ít sử dụng

2.2.14.7 Phương pháp hóa học: Dùng các phản ứng hóa học để định lượng cơ chất

mất đi hay lượng sản phẩm tạo thành Thông thường phải chọn phản ứng tạo nên các phức chất màu có độ hấp thu ánh sáng cực đại ở vùng nào đó để từ đó định lượng

hợp chất này

 Phương pháp định lượng cơ chất còn lại hay sản phẩm tạo thành có thể đơn giản là

sự đo cơ chất còn lại hay sản phẩm tạo thành một cách trực tiếp Tuy nhiên trong nhiều trường hợp, có thể đo một cách gián tiếp và do đó phép đo phức tạp hơn

Phương pháp phóng xạ: Dựa trên sự hình thành các bức xạ của các chất đồng

vị phóng xạ gắn vào cơ chất tại nhóm chức thích hợp để có thể đo độ phóng xạ (sự phân rã) của cơ chất còn lại, hay sản phẩm tạo thành Thường áp dụng xác định hoạt độ các enzyme mà các phương pháp thông thường ko thể đo được

Có thể kết hợp phương pháp điện di với phương pháp phóng xạ để xác định hoạt độ enzyme

Phương pháp huỳnh quang: Dựa trên sự phát quang của một số hợp chất dưới

tác dụng của một nguồn sang kích thích đặc trưng Mức độ phát huỳnh quang được

đo nhờ máy huỳnh quang kế Đây cũng là phương pháp cho độ nhạy cao, cho phép phát hiện hoạt độ enzyme ở mức độ thấp

- Bên cạnh những phương pháp phân tích hoạt độ có tính định lượng nêu trên, nhiều trường hợp phân tích định tính hay bán định lượng cũng được sử dụng để nhanh chóng bước đầu xác định sự có mặt của enzyme Thường được dung hơn hết

là phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch có chứa đệm và cơ chất (tinh bột với amylase, casein với protease…) sau đó nhuộm màu (iod nhuộm với tinh bột, xanh coomassie hay amido đen với casein…) để phát hiện hay đánh giá hoạt độ enzyme qua vòng phân giải cơ chất Để khẳng định chắc chắn bản chất phản ứng có phải do enzyme xúc tác hay ko, người ta xử lý nhiệt (vì phần lớn enzyme có bản chất protein (hay RNA) đều mất hay giảm phần lớn hoạt tính xúc tác sau khi xử lý ở nhiệt độ cao Trong một số trường hợp có thể dùng chất ức chế đặc biệt khẳng định sự có mặt của enzyme trong mẫu phân tích (azid natri ức chế đặc hiệu catalase, phenyl methyl sulphonyl fluorid-PMSF ức chế đặc hiệu các protease serine…) (Nguyễn Đức Lượng, 2004).

2.2.15 Một số lưu ý khi xác định hoạt độ hay thực hiện phản ứng enzyme

Khi xác định hoạt độ enzyme cần chọn điều kiện pH và nhiệt độ phân tích ở vùng thích hợp Với những enzyme lần đầu tiên nghiên cứu, nên chọn pH trung tính,

300C-370C Sau đó có những điều chỉnh sau nếu cần thiết

Bên cạnh pH và nhiệt độ, cần lưu ý cơ chất, thành phần đệm, lực ion hay nồng độ muối, các chất làm bền

Các phân tích hoạt độ enzyme phải thực hiện ở một giá trị pH ổn định, nên phải dùng một loại đệm hay một hệ thống đệm thích hợp nào đó Nồng độ đệm thường dùng là 20-50 nM Tuy vậy các phản ứng sinh acid, base cần phải dùng đệm ở nồng

độ cao hơn tránh thay đổi pH trong quá trình thí nghiệm Cần chọn loại đệm thích hợp tránh làm kết tủa các yếu tố cần thiết cho hoạt động của enzyme như Ca2+, Zn2+

Cơ chất, sản phẩm và đệm đều phải đạt cùng nhiệt độ phân tích khi tiếp xúc với nhau để bắt đầu phản ứng Nếu phân tích nhiều mẫu, thời gian bắt đầu và kết thúc phản ứng phải duy trì như nhau

Luôn có mẫu kiểm tra thích hợp để tránh sai sót

Phải lựa chọn phương pháp làm ngừng phản ứng thích hợp, tránh làm biến đổi cơ chất hay sản phẩm cần đo; hay can thiệp quá mạnh vào phép định lượng sản phẩm phản ứng enzyme (chất làm ngừng phản ứng có cùng bước song hấp thụ ánh sáng cần đo với chất phản ứng, hay ức chế phản ứng tạo màu tiếp theo của phân tích…) Tóm lại việc xác định hoạt độ của enzyme chỉ cho số liệu tin cậy khi chọn được phương pháp thích hợp và có các bước tiến hành đúng (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

2.2.16 Tính chất ưu việt của enzyme so với các chất xúc tác khác

Thu nhận dễ dàng từ các nguồn khác nhau, có thể từ động vật, hoặc vi sinh vật, với công nghệ DNA tái tổ hợp, hiệu quả thu enzyme càng cao hơn

Hoạt động xúc tác nhẹ nhàng, điều kiện bình thường, ngay cả ở điều kiện nhiệt độ

và áp suất bình thường thì sự xúc tác của enzyme vẫn cho hiệu quả phản ứng cao nhất

Enzyme có tính đặc hiệu cao hơn các xúc tác khác, chỉ tác dụng lên những cơ chất nhất định và xúc tác cho những phản ứng nhất định do đó rất ít tạo sản phẩm phụ, hiệu suất thu được sản phẩm chính khá cao

Vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác có thể được điều chỉnh dễ dàng thậm chí có thể ngừng phản ứng bằng các yếu tố tác động như nhiệt độ, pH, hoặc áp suất, nồng

độ cơ chất

Enzyme không bị mất đi khi phản ứng kết thúc (Nguyễn Đức Lượng,2004)