Chương III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Mục đích: phân tích thành phần hóa học của nguyên liệu làm cơ sở để xây dựng phương pháp chế biến các thí nghiệm tiếp theo.
Chỉ tiêu cần phân tích:
- Ẩm độ: xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy khô ở nhiệt độ 105oC đến khối lượng không đổi.
- Acid toàn phần: xác định bằng phương pháp chuẩn độ với NaOH 0,1N.
- Đường tổng số: định lượng bằng phương pháp Bertrand.
- pH: sử dụng máy đo pH.
- Hàm lượng chất khô hòa tan: chiết quang kế.
3.2.2 Sơ đồ quy trình đường hóa mít 3.2.2.1 Qui trình
3.2.2.2 Thuyết minh quy trình:
a. Xử lý nguyên liệu
- Mít thu mua về đem rửa, xẻ mít chỉ lấy phần xơ và múi.
b. Quá trình chần
- Tinh bột sống không hòa tan trong nước, do vậy khi đường hóa enzyme tác dụng vào rất chậm. Quá trình chần giúp phá vỡ tế bào tinh bột, biến tinh bột từ trạng thái không tan thành trạng thái hòa tan, giúp cho quá trình xúc tác giữa enzyme và tế bào tinh bột được dễ dàng. Bên cạnh đó chần ở 900C trong thời gian 10 phút nhằm mục đích vô hoạt enzyme oxy hóa (ascorbatoxydase, phenoloxydase, peroxydase), các enzyme oxy hóa này là nguyên nhân gây tổn hao vitamin C và sẫm màu sản phẩm
Mít (Múi +Xơ)
Chần ( 900C,10 phút )
xay
Đường hóa
Lên men Glucoamylase
α- amylase
Pectinase (0,04%) Nước (tỉlệ 70%)
trong quá trình bảo quản, chúng oxy hóa các chất poluphenol làm cho polyphenol chuyển màu, rượu bị đục. Để xác định enzyme oxy hóa đã bị vô hoạt chưa ta tiến hành thử định tính enzyme peroxidase bằng 2 giọt guaicol + 2 giọt H2O2, Nếu không xảy ra phản ứng màu => enzyme peroxidase đã bị vô hoạt, chọn enzyme peroxydase làm enzyme chỉ thị vì enzyme peroxydase có khả năng chịu nhiệt cao nhất trong nhóm enzyme oxy hóa.
c. Bổ sung nước và xay
- Nước được bổ sung theo tỉ lệ 70% nước: 30% mít.
- Theo Nguyễn Đức Lượng (2004) thì việc làm nhỏ nguyên liệu là khâu kĩ thuật rất quan trọng, quyết định đến hiệu quả tác động của enzyme và hiệu suất thu nhận dịch quả cũng như chất lượng dịch quả. Khi thực hiện một trong các biện pháp cơ học trên, một số tế bào sẽ bị phá hủy mất tính bán thấm, do đó việc lựa chọn phương pháp cơ học làm nhỏ quả phù hợp với từng loại quả rất có ý nghĩa công nghệ. Xay nhằm tạo điều kiện để tăng quá trình lý học và hóa sinh học trong khi hòa thấm hạt vào nước, đảm bảo quá trình trích ly tối đa. Mít càng nghiền nhỏ diện tích tiếp xúc với enzyme càng lớn, các enzyme phân hủy dễ dàng và chuyển thành dạng hòa tan trong nước một cách triệt để. Tuy nhiên mức độ nghiền nhỏ còn phụ thuộc vào dụng cụ nghiền. Nghiền nhỏ càng có tác dụng làm tăng cường tiếp xúc giữa nước và xác quả giúp hòa tan các chất màu, tanin, chất có mùi thơm.
d. Bổ sung enzyme pectinase
- Bổ sung pectinase nhằm mục đích tăng hiệu suất thu dịch quả, làm trong do sự phá hủy hệ keo trong dịch quả, vị của quả tốt hơn, ít bị đục trở lại, đồng thời làm giảm độ nhớt của dịch quả giúp glucoamylase tiếp xúc với cơ chất dễ dàng hơn.
e. Quá trình dịch hóa
- Thủy phân tinh bột bằng enzyme là phân cắt nối glucozit trong phân tử amyloza và amylopectin và đính vào đó một phân tử nước.
- α- amylaza chỉ tác dụng lên nối α-1,4 glucozit ở vị trí bất kì nhưng tập trung vào giữa mạch amyloza và amylopectin, nhờ đó mà tinh bột nhanh chóng được phân cắt thành những dextrin có khối lượng phân tử khác nhau, ít nhớt hơn. Do làm giảm nhanh độ nhớt của tinh bột nên α- amylaza còn được gọi là enzyme dịch hóa. Sản phẩm do α- amylaza tạo thành gồm các dextrin, đường maltoza và một ít glucoza.
- Quá trình dịch hóa bằng enzyme α- amylase làm giảm nhanh độ nhớt, tinh bột chuyển sang trạng thái hòa tan tạo điều kiện thuận lợi cho glucoamylaza thực hiện quá trình đường hóa.
f. Quá trình đường hóa
- Sau quá trình chần và dịch hóa thì tinh bột trong dịch cháo đã chuyển thành trạng thái hòa tan nhưng chưa thể lên men trực tiếp để biến thành rượu được mà phải trải qua quá trình thủy phân do xúc tác của glucoamylase để biến thành đường. Quá trình trên được gọi là quá trình đường hóa và đóng vai trò quan trọng trong công nghệ
sản xuất cồn etylic. Nó quyết định phần lớn hiệu suất thu hồi rượu do giảm bớt sự gia tăng đường và tinh bột sót sau khi lên men.
- Sử dụng enzyme glucoamylase để đường hóa là do enzyme glucoamylase không chỉ có khả năng phân cắt nối α-1,4 glucozit mà còn phân cắt được nối α-1,6 glucozit và biến 100% tinh bột thành đường glucose. Cụ thể ở giai đoạn này sử dụng chế phẩm AMG 300 L của hãng NOVO Nordish A/S, B296 & B194, AMG – Amyloglucosidase Novo - là một chất exo-1,4-α-D-glucosidase (gluco-amylase) thủy phân liên kết α- 1,4 glucozit và α-1,6 glucozit.
Các giai đoạn phản ứng của quá trình đường hóa:
Giai đoạn đầu: xảy ra khi lượng cơ chất rất lớn so với lượng enzyme. Vì thế tốc độ đường hóa phụ thuộc vào lượng enzyme một cách tuyến tính. Theo nghiên cứu của Denxicop với amylase của A. Oryzae giai đoạn này sẽ xảy ra khi hàm lượng tinh bột trong dịch thủy phân ít hơn 50%, nhưng với amylase của A. Awamori lại nhỏ hơn hoặc bằng 30% so với toàn bộ lượng có trong dịch tinh bột (Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2005). Dưới tác dụng của glucoamylase các phân tử amylose và amylopectin đồng thời bị phân cắt ở nhiều vị trí nên ngay trong giai đoạn đầu trong dịch thủy phân đã xuất hiện cả sản phẩm cuối và các dextrin có phân tử lượng khác nhau và đường oligo. Tiếp đó phân tử lượng của hỗn hợp sẽ giảm dần.
Giai đoạn sau: phản ứng tiến triển chậm hơn và không còn phụ thuộc vào nồng độ enzyme. Sự tiến triển của giai đoạn này diễn ra khác nhau phụ thuộc vào tác nhân đường hóa khác nhau.
g. Sau đường hóa là công đoạn lên men.
3.2.3 Thí nghiệm 1a: Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme α - amylase trong quá trình thủy phân tinh bột
Mục đích: tìm giá trị pH và nhiệt độ tối ưu cho sự phân giải chất bột đường trong nguyên liệu mít nghệ, từ đó áp dụng cho quá trình đường hóa mít nghệ.
Thí nghiệm được tiến hành ngẫu nhiên với 2 nhân tố, 2 lần lặp lại Nhân tố A: các giá trị nhiệt độ (5 mức độ);
A1 = 75oC; A2 = 80oC; A3 = 85oC; A4 = 90oC; A5 = 95oC Nhân tố B: trị số pH (7 mức độ);
B1 = 5,0; B2 = 5,5; B3 = 6,0; B4 = 6,5; B5 = 7,0; B6 = 7,5; B7 = 8,0.
+ Phương pháp tiến hành:
Chuẩn bị 1 mẫu đối chứng không chỉnh pH và nhiệt độ, bổ sung enzyme nồng độ 0.1%
Lấy 100g mít đã pha loãng và xay nhuyễn. Chỉnh nhiệt độ và pH ở các mức độ khác nhau như sơ đồ trên, cho mẫu vào waterbath đợi đến khi nhiệt độ dung dịch mít bằng với nhiệt độ cần phản ứng mới bổ sung enzyme α -amylase với nồng độ 0,1% vào.
Thủy phân dịch mít đã được điều chỉnh pH ở các mức độ như trên. Thời gian thủy phân là 40 phút, sau khi thủy phân lấy mẫu ra cho vào nồi đã đun sẵn nước đến 1000C thật nhanh, rồi giữ ở nhiệt độ 1000C trong 10 phút để vô hoạt enzyme.
Lưu ý: tránh đun nước quá sôi khi vô hoạt enzyme vì sẽ làm đường trong mẫu bị caramen hóa, làm tổn thất đường
Xác định hàm lượng đường khử trong dung dịch thủy phân bằng phương pháp Bertrand.
Chỉnh nhiệt độ và pH
Bổ sung enzyme α – amylase nồng độ 0,1%
Thủy phân (40 phút)
……….
Mít (múi+xơ ) 30%
A1 A2 A3 A4 A5
B1B2B3B4 B5B6B7 B1B2B3B4 B5B6B7 B1B2B3B4B5B6B7 B1B2B3B4B5B6B7 B1B2B3B4B5B6B7
Vô hoạt enzyme (1000C, thời gian 10 phút)
Phân tích đường khử
3.2.4 Thí nghiệm 1b: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme α- amylase và thời gian thuỷ phân đến khả năng thủy phân nguyên liệu mít nghệ
+ Mục đích: xác định nồng độ enzyme α- amylase và thời gian thủy phân thích hợp cho hiệu suất thủy phân nguyên liệu đạt hiệu quả cao.
+ Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được tiến hành ngẫu nhiên với 2 nhân tố, 2 lần lặp lại.
Nhân tố C: nồng độ enzyme α- amylase (7 mức độ);
C0 = 0%; C1 = 0,05 %; C2 = 0,1%; C3 = 0,2 %; C4 = 0,3 %; C5 = 0,4%; C6 = 0,5%
Nhân tố D: thời gian thủy phân (5 mức độ),
D1 = 20 phút; D2 = 30 phút; D3 = 45 phút; D4 = 60 phút; D5 = 75 phút Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
+ Phương pháp tiến hành: Lấy 100g mít đã pha loãng và xay nhuyễn.Chỉnh nhiệt độ và pH ở điều kiện tối ưu đã được xác định ở thí nghiệm trước, cho mẫu vào waterbath đợi đến khi nhiệt độ dung dịch mít bằng với nhiệt độ cần phản ứng mới bổ sung enzyme alpha amylase với từng mức nồng độ khác nhau. Thủy phân với 5 mức độ thời gian: 20
C0C1C2C3C4C5C6 C0C1C2C3C4C5C6 C0C1C2C3C4C5C6 C0C1C2C3C4C5C6 C0C1C2C3C4C5C6 D1 D2 D3 D4 D5
Vô hoạt enzyme (1000C,10 phút)
Phân tích đường khử Chỉnh nhiệt độ và pH tối ưu
Bổ sung enzyme α- amylase với nồng độ khác nhau
Thủy phân Mít (xơ + múi) 30%
……….
phút; 30 phút; 45 phút; 60 phút, 75 phút và đợi hết từng khoảng thời gian cần thí nghiệm, rồi lấy mẫu ra ứng với từng khoảng thời gian, sau khi thủy phân lấy mẫu ra cho vào nồi đã giữ nhiệt ở 1000C thật nhanh, rồi giữ trong 10 phút để vô hoạt enzyme.
Lưu ý: tránh đun nước quá sôi khi vô hoạt enzyme vì sẽ làm đường trong mẫu bị caramen hóa, làm tổn thất đường.
+ Chỉ tiêu theo dõi:
Xác định hàm lượng đường khử trong dung dịch thủy phân bằng phương pháp Bertrand.
3.2.5 Thí nghiệm 1c: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ mít đến vận tốc phản ứng, xác định phương trình Michaelis Menten trên cơ chất mít.
+ Mục đích: xác định nồng độ cơ chất tối ưu cho phản ứng, và khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất như thế nào đến vận tốc phản ứng, tìm vận tốc phản ứng theo phương trình Michaelis Menten và km (hằng số cho biết ái lực của enzyme đối với cơ chất)
+ Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được tiến hành ngẫu nhiên với 1 nhân tố, 2 lần lặp lại;
Nhân tố : nồng độ cơ chất : 5%; 10%; 15%; 20%; 25%; 30%; 35%; 40% ( 8 mức độ) Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Phân tích đường khử Chuẩn đường khử
Vô hoạt enzyme (1000C,10 phút) Chỉnh nhiệt độ và pH tối ưu Bổ sung enzyme α-amylase với nồng độ
0,1%
Thủy phân (20 phút) Mít (xơ + múi) pha loãng
với nồng độ thích hợp
……….
+ Phương pháp tiến hành: Lấy 100g mít đã xay nhuyễn và pha loãng với nồng độ thích hợp. Chỉnh nhiệt độ và pH ở điều kiện tối ưu đã được xác định ở thí nghiệm trước, cho mẫu vào waterbath đợi đến khi nhiệt độ dung dịch mít bằng với nhiệt độ cần phản ứng mới bổ sung enzyme glucoamylase nồng độ 0,1%. Thủy phân với thời gian: 20 phút và đợi hết thời gian cần thí nghiệm, rồi lấy mẫu ra cho vào nồi đã giữ nhiệt ở 1100C thật nhanh, rồi giữ trong 10 phút để vô hoạt enzyme.
Lưu ý: tránh đun nước quá sôi khi vô hoạt enzyme vì sẽ làm đường trong mẫu bị caramen hóa, làm tổn thất đường.
+ Chỉ tiêu theo dõi: Xác định hàm lượng đường khử trong dung dịch thủy phân bằng phương pháp Bertrand.
3.2.6. Thí nghiệm 2a: Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme glucoamylase trong quá trình thủy phân tinh bột
Mục đích: tìm giá trị pH và nhiệt độ tối ưu cho sự phân giải chất bột đường trong nguyên liệu mít nghệ, từ đó áp dụng cho quá trình đường hóa mít nghệ.
Thí nghiệm được tiến hành ngẫu nhiên với 2 nhân tố, 2 lần lặp lại;
Nhân tố G: các giá trị nhiệt độ (5 mức độ);
G1 = 45oC; G2 = 50oC; G3 = 55oC; G4 = 60oC; G5 = 65oC;
Nhân tố H: trị số pH (6 mức độ);
H1 = 3,0; H2 = 3,5; H3 = 4,0 ; H4 = 4,5; H5 = 5,0; H6 = 6,0;
Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
+ Phương pháp tiến hành:
Chuẩn bị 1 mẫu đối chứng không chỉnh pH và nhiệt độ, bổ sung enzyme
Lấy 100g mít đã pha loãng và xay nhuyễn. Chỉnh nhiệt độ và pH ở các mức độ khác nhau như sơ đồ trên, cho mẫu vào waterbath đợi đến khi nhiệt độ dung dịch mít bằng với nhiệt độ cần phản ứng mới bổ sung enzyme glucoamylase với nồng độ 0,1% vào.
Thủy phân dịch mít đã được điều chỉnh pH các mức độ như trên. Thời gian thủy phân là 40 phút, sau khi thủy phân lấy mẫu ra cho vào nồi đã đun sẵn nước đến 800 thật nhanh, rồi giữ ở nhiệt độ 800C trong 15 phút để vô hoạt enzyme.
Lưu ý: tránh đun nước quá sôi khi vô hoạt enzyme vì sẽ làm đường trong mẫu bị caramen hóa, làm tổn thất đường
+ Chỉ tiêu theo dõi: Xác định hàm lượng đường khử trong dung dịch thủy phân bằng phương pháp Bertrand.
Chỉnh nhiệt độ và pH
Bổ sung enzyme glucoamylase nồng độ 0.1%
Thủy phân (40 phút)
……….
Mít (múi+xơ )30%
G1 G2 G3 G4 G5
H1 H2 H3 H4 H5H6 H1 H2 H3 H4 H5 H6 H1H2 H3 H4 H5 H6 H1 H2 H3 H4 H5 H6 H1 H2 H3 H4 H5 H6
Vô hoạt enzyme (800C, thời gian 15 phút)
Phân tích đường khử
3.2.7 Thí nghiệm 2b: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian thủy phân đến khả năng thủy phân nguyên liệu mít nghệ
+ Mục đích: xác định nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian thủy phân thích hợp cho hiệu suất đường hóa nguyên liệu đạt hiệu quả cao.
+ Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được tiến hành ngẫu nhiên với 2 nhân tố, 2 lần lặp lại.
Nhân tố I: nồng độ enzyme glucoamylase (7 mức độ);
I0 = 0%; I1 = 0,02 %; I2 = 0,06 %; I3 = 0,08 %; I4 = 0,1 %; I5 = 0.3%; I6 = 0.5%
Nhân tố J: thời gian thủy phân (5 mức độ),
J1 = 20 phút; J2 = 30 phút; J3 = 45 phút; J4 = 60 phút; J5 = 75 phút Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
I0 I1 I2 I3 I4 I5 I6 I0 I1 I2 I3 I4 I5 I6 I0 I1 I2 I3 I4 I5 I6 I0 I1 I2 I3 I4 I5 I6 I0 I1 I2 I3 I4 I5 I6 J1 J2 J3 J4 J5
Vô hoạt enzyme (800C,15 phút)
Phân tích đường khử Chỉnh nhiệt độ và pH tối ưu
Bổ sung enzyme glucoamylase với nồng độ khác nhau
Thủy phân Mít (xơ + múi) 30%
……….
+ Phương pháp tiến hành:
Lấy 100g mít đã pha loãng và xay nhuyễn. Chỉnh nhiệt độ và pH ở điều kiện tối ưu đã được xác định ở thí nghiệm trước, cho mẫu vào waterbath đợi đến khi nhiệt độ dung dịch mít bằng với nhiệt độ cần phản ứng mới bổ sung enzyme glucoamylase với từng mức nồng độ khác nhau. Thủy phân với 5 mức độ thời gian: 20 phút; 30 phút; 45 phút; 60 phút, 75 phút và đợi hết từng khoảng thời gian cần thí nghiệm, rồi lấy mẫu ra ứng với từng khoảng thời gian, sau khi thủy phân lấy mẫu ra cho vào nồi đã giữ nhiệt ở 800C thật nhanh, rồi giữ trong 15 phút để vô hoạt enzyme.
Lưu ý: tránh đun nước quá sôi khi vô hoạt enzyme vì sẽ làm đường trong mẫu bị caramen hóa, làm tổn thất đường.
+ Chỉ tiêu theo dõi:
Xác định hàm lượng đường khử trong dung dịch thủy phân bằng phương pháp Bertrand.
3.2.8. Thí nghiệm 2c : Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến vận tốc phản ứng, xác định phương trình Michaelis Menten trên cơ chất mít.
+ Mục đích: xác định nồng độ cơ chất tối ưu cho phản ứng và khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất như thế nào đến vận tốc phản ứng, tìm vận tốc phản ứng theo phương trình Michaelis Menten và km (hằng số cho biết ái lực của enzyme đối với cơ chất)
+ Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được tiến hành ngẫu nhiên với 1 nhân tố, 2 lần lặp lại;
Nhân tố : nồng độ cơ chất : 5%; 10%; 15%; 20%; 25%; 30%; 35%; 40% ( 8 mức độ) Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Chuẩn đường khử Vô hoạt enzyme
(800C,15 phút)
Chỉnh nhiệt độ và pH tối ưu
Bổ sung enzyme glucoamylase với nồng độ 0,1%
Thủy phân (20 phút) Mít (xơ + múi) pha loãng
với nồng độ thích hợp
……….
+ Phương pháp tiến hành:
Lấy 100g mít đã xay nhuyễn và pha loãng với nồng độ thích hợp. Chỉnh nhiệt độ và pH ở điều kiện tối ưu đã được xác định ở thí nghiệm trước, cho mẫu vào waterbath đợi đến khi nhiệt độ dung dịch mít bằng với nhiệt độ cần phản ứng mới bổ sung enzyme glucoamylase nồng độ 0,1%. Thủy phân thời gian: 20 phút, đợi hết thời gian cần thí nghiệm, rồi lấy mẫu ra cho vào nồi đã giữ nhiệt ở 800C thật nhanh, rồi giữ trong 15phút để vô hoạt enzyme.
Lưu ý: tránh đun nước quá sôi khi vô hoạt enzyme vì sẽ làm đường trong mẫu bị caramen hóa, làm tổn thất đường.
+ Chỉ tiêu theo dõi:
Xác định hàm lượng đường khử trong dung dịch thủy phân bằng phương pháp Bertrand.