Lời cảm ơn Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo Nguyễn D ơng Tuệ đà quan tâm h ớng dẫn tận tình giúp đỡ em suốt thời gian xây dựng hoàn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn cán phòng thí nghiệm Di truyền - Vi sinh, thầy cô giáo khoa đà giúp đỡ, tạo điều kiện để em hoàn thành luận văn Cảm ơn quan tâm, giúp đỡ, động viên tất bạn bè đồng nghiệp suốt thời gian qua Vinh, ngày 25 tháng năm 2004 Sinh viên Nguyễn Việt Hoa Đặt vấn đề Vi sinh vật giới sinh vật vô phong phú Nó phân bố khắp nơi Trái đất : Từ đỉnh núi cao đến tận đáy biển sâu, không khí, đất, hầm mỏ, sông ngòi, ao hồ, da, phận thể ngời, động vật, thực vật, sản phẩm lơng thực, thực phẩm, vật liệu, hàng hoá Ngay nơi tởng chừng khắc nghiệt thÊy cã sù ph¸t triĨn cđa vi sinh vËt Vi sinh vật đóng vai trò quan trọng thiên nhiªn cịng nh cc sèng cđa ngêi Nã biến đá mẹ thành đất trồng, làm giàu chất hữu đất, tham gia vào tất vòng tuần hoàn vật chất tự nhiên Nó khâu quan trọng chuỗi thức ăn hệ sinh thái Nó đóng vai trò định trình tự làm môi trờng tự nhiên Từ xa xa, ngời đà biết sử dụng vi sinh vật đời sống ngày Các trình làm rợu, làm dấm, làm tơng, muối chua thực phẩm ứng dụng đặc tính sinh học nhóm vi sinh vật Về phơng diện phòng trừ bệnh tật loài ngời sớm tích luỹ đợc nhiều kinh nghiƯm phong phó Tõ Antonie van leeuwenthoek (1632 - 1723) chế tạo kính hiển vi ngời bắt đầu khám phá giới sinh vật Khi khoa học phát triển biết rõ vai trò cđa vi sinh vËt th× viƯc øng dơng nã sản xuất đời sống ngày rộng rÃi có hiệu lớn Ví dụ nh chế biến văcxin phòng bệnh, sản xuất chất kháng sinh dợc phẩm quan trọng khác Đặc biệt phát triển vi sinh vật ngời ngày tạo nhiều quy trình sản xuất, ứng dụng vi sinh vật tạo nhiều sản phẩm có giá trị nh : - Sản xuất sinh khối : Từ năm 1981 trờng Đại học Automoma metropôlitana thủ đô Mêhycô, Raimboult đà tiến hành sử dụng Aspergillus niger cho phát triển bột khoai, bột sắn để tạo sinh khối có hàm lợng Prôtêin cao - Vi sinh vật nguån thu nhËn enzim quan träng Ngêi ta dïng vi sinh vật để sản xuất Enzim: amilaza, prôtêaza, xenluloza nuôi cấy Aspergillus niger (Albert Sasson - 1992) - Sản xuất sản phẩm trao đổi chất sơ cấp thủ cấp nh axitamin, axit hữu cơ, vitamin, rợu, chất kháng sinh nớc ta sắn đợc trồng phổ biến từ lâu Bột sắn đà nguồn thức ăn trực tiếp cho ngời động vật Ngày bột sắn đợc bán rộng rÃi thị trờng với giá thành rẻ, tinh bột sắn lại nhiều nên sử dụng vi sinh vật lên men để làm thức ăn cho động vật thiết thực Đáng ý nấm men Saccharomyces cerevisiae đợc sử dụng nhiều sản xuất prôtêin đơn bào, công nghiệp bia, rợu, sản xuất men nở bột mỳ Tế bào nấm men S.cerevisiae chứa hầu nh tất chÊt cÇn thiÕt cho sù sèng, cã thÕ cã tíi 52,41% prôtêin, 1,72% lipit, 2530% polisaccharit, 5,86% xenluloza, hemixenluloza, 8,76% chất tro Nấm men giàu vitamin loại, đặc biệt vitamin nhóm B (mg/kg khối lợng khô): B1 (thiamin) - 156,0; B2 (riboflavin) - 100,0; B3 (axit pantotenic) 100,0; B4(axit choric) - 710,0; B6(pyridoxin) - 20,0 ; PP (niaxin) - 22,0; H(biotin)0,6, ngời ta thấy có 20 loại axitamin nấm men bánh mỳ này, có nhiỊu axitamin kh«ng thay thÕ nh lyzin, methionin, hystidin (Nguyễn Thành Đạt - Cơ sở sinh học vi sinh vật, 2001) Do sử dụng S.cerevisiae để tạo sinh khối chắn đem lại hiệu kinh tế cao Trong năm gần việc nuôi trồng thuỷ sản đợc phát sâu rộng nhiều vùng Đây hớng phát triển kinh tế đà đem lại nguồn thu nhập cao cho ngời tạo đợc việc làm cho nhiều ngời Để đáp ứng nhu cầu cho động vật thuỷ sản phù hợp với giai đoạn phát triển khoa học theo hớng công nghiệp hoá, đại hoá, việc tạo môi trờng nớc, bón phân, sử dụng thức ăn tự nhiên, việc chế biến thức ăn tổng hợp ba mục tiêu chiến lợc (giống, bệnh, thức ăn) Nhà nớc ngành chăn nuôi thuỷ sản Trong ngành chăn nuôi thuỷ sản giống cá rô phi đợc nuôi phổ biến, mà bật dòng rô phi vằn Oreochromis niloticus đợc nuôi rộng rÃi địa phơng có tốc độ tăng trởng nhanh, thịt thơm ngon, dễ nuôi, dễ tiêu thụ Từ thực tế tiến hành đề tài "Sinh khối nấm men Saccharomyces cerevisiae từ nguyên liệu bột sắn đến tăng trởng cá Rô phi vằn Oreochromis niloticus", với mục đích: Tìm hiểu giá trị dinh dìng cã sinh khèi nÊm men Saccharomices cerevisiae từ nguyên liệu bột sắn Tìm hiểu ảnh hëng cđa chÕ ®é dinh dìng sinh khèi vi sinh vật đến tăng trởng cá Rô phi vằn hiệu suất sử dụng thức ăn giống cá Đây dịp để làm quen với phơng pháp nghiên cứu khoa học nâng cao hiểu biết nấm men nh nâng cao tầm hiểu biết nghề nuôi trồng thuỷ sản Từ ®ã cã thĨ vËn dơng thùc tiƠn s¶n xt sau Đề tài thực phòng thí nghiệm vi sinh học trờng Đại học Vinh từ tháng 9/2003 đến tháng 12/2003 với giúp đỡ tận tình, quý báu thầy giáo Nguyễn Dơng Tuệ, cán phòng thí nghiệm Di truyền - Vi sinh, thầy cô giáo tổ Di truyền - Vi sinh , thầy cô giáo khoa Sinh bạn bè đồng nghiệp Do bớc đầu làm quen với công tác nghiên cứu nên không tránh khỏi khiếm khuyết Rất mong nhận đợc góp ý thầy cô bạn bè đồng nghiệp Phần I: Tổng luận I.Sơ lợc nấm men Nấm men (Yeast, Lenere) tên chung nhóm nấm men có cấu tạo đơn bào thờng sinh sản cách nảy chồi phân cắt Nhóm có nhiều tự nhiên, môi trờng có chứa đờng, có pH thấp, chẳng hạn nh hoa quả, rau da, mËt mÝa, rØ ®êng, mËt ong, ®Êt ruéng mÝa, đất vờn ăn quả, đất có nhiễm màu mỡ Nhiều loài nhóm có khả lên men rợu đợc áp dụng sản xuất rợu, bia, rợu vang, làm bánh mỳ Tế bào nấm men giàu prôtein, vitamin, đặc biệt vitamin nhóm B - bổ sung dinh dỡng vào thức ăn gia súc dùng để chế số dạng thực phẩm cho ngời Nấm men vi sinh vật điển hình cho nhóm nhân thật Tế bào nấm men thờng lớn gấp 10 lần so với tế bào vi khuẩn, kích thớc tế bào nấm men vào khoảng - 15 µm Tuú loµi nÊm men mµ tÕ bµo cã hình trứng (men bia) hình elip (men rợu vang), hình cầu, hình gậy, hình chanh (hình 1) Có loài nấm men có khuẩn ty khuẩn ty giả Khuẩn ty giả cha thành sợi rõ rệt mà nhiều tế bào nối với thành chuỗi dài Có loài tạo thành váng nuôi cấy môi trờng dịch thể ảnh Khác với vi khuẩn xạ khuẩn, nấm men có cấu tạo phức tạp, gần giống nh tế bào thực vật Có đầy đủ cấu tạo thành tế bào, màng tế bào chất, tế bào chất, ty thể, nhân, không bào hạt dự trữ số nấm men thành tế bào có khả kết dính, chúng kết với Quá trình gọi kết lắng có ý nghĩa lớn nghề nấu bia làm rợu vang, tế bào dính với nhanh lắng xuống dới làm cho dịch lên men sáng men gọi men chìm Những nấm men khả kết lắng gọi men Nấm men sinh sản bµo tư (tõ - 12, thêng lµ tõ - bào tử) Bào tử gặp điều kiện phát triển thành tế bào nấm men Tuy nhiên nấm men sinh sản chủ yếu cách nảy chồi Tế bào mẹ nảy sinh chồi nhỏ lớn dần lên tách ra, trình xẩy khoảng số nấm men, tế bào không tách rời mà kết thành chuỗi Theo J.A Barnett, R.W.Payne D.Yarrow (1983) xác định có 483 loài nấm men thuộc 66 chi Trong loài Saccharomyces cerevisiae đợc sử dụng nh công cụ đắc lực để mang ADN tái tổ hợp phục vụ cho việc sản xuất sản phẩm hệ kỹ tht di trun NÊm men lµ nhãm vi sinh vËt phân bố rộng rÃi thiên nhiên, đất, nớc, không khí, lơng thực thực phẩm, hoa Nó tham gia vào trình chuyển hoá vật chất, phân huỷ chất hữu đất Hoạt tính sinh lý loài nấm men đợc ứng dụng công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp ngành khác Thí dụ nh trình sản xuất loại rợu, cồn, nớc giải khát lên mem, làm thức ăn cho gia súc Ngoài hoạt tính sinh lý, thân tế bào nấm men có nhiều loại vitamin, đặc biệt axit amin không thay nh lizin, mêthyonin, systein, trêonin, triptophan Đặc tính đợc dùng để chế tạo thức ăn gia súc từ nấm men, chí thức ăn giành cho ngời chế tạo từ nấm men (Albert Sasson 1993) Tuy nhiên bên cạnh nấm men có lợi có không nấm men có hại, chúng gây tợng làm h hỏng thực phẩm tơi sống thực phẩm chế biến Có khoảng 13 - 15 loài nấm men có khả gây bệnh cho ngời động vật chăn nuôi Đáng ý loài Candida albicans, Cruptococcus neoformans, Trichosporon cutaneum Do vËy t×m hiĨu nấm men giúp biết đợc mặt có lợi để khai thác ,sử dụng, đồng thời hạn chế, phòng tránh, ngăn ngừa tác hại không mong muốn chúng gây nên, góp phần vào việc chung tất ngời phát triển kinh tế, nâng cao chất lợng sống II Một số đặc điểm cá rô phi Cá rô phi đợc nhập từ nguồn giống Đài Loan số giống rô phi đỏ từ Malaixia Cá có u điểm lớn nhanh, thịt ngon, xơng dăm, nuôi sau -> tháng cho ăn đầy đủ đạt từ 0,4 -> 0,6 kg/ Cá rô phi có khả chống chịu giỏi với điều kiện môi trờng không thuận lợi, bệnh tật, dễ tạo giống nuôi Chính sản lợng cá rô phi toàn giới đà tăng nhanh năm gần Theo công bố FAO có 100 quốc gia giới nuôi cá rô phi Sản lợng cá rô phi nuôi tăng nhanh 10 năm gần Năm 1986 đạt 253 nghìn tấn, năm 1990 đạt 410 nghìn tấn, đến năm 1995 đà đạt 659 nghìn Cá rô phi tiếp tục trở thành loại cá nuôi có tầm quan trọng quốc tế Đến đà có hội thảo quốc tế với chủ đề "cá rô phi nuôi trồng thuỷ sản" đợc tổ chức với quy mô lớn : Lần (1983) Israel, lần (1988) Thái Lan lần thứ (1993) Israel Hàng loạt công trìnhvề nuôi cá rô phi đà đợc công bố Hội thảo Ba loài cá rô phi nuôi quan trọng giới Rô phi vằn O niloticus, Rô phi xanh O.aureus rô phi đen O mossambicus Sản lợng chúng chiếm 90% tổng sản lợng cá rô phi nuôi Nói chung cá sống nớc ngọt, nớc lợ, nuôi đợc ao hồ, ruộng nuôi đợc lồng, khả chịu rét Cá có tập tính ăn tạp: ăn mùn bà hữu cơ, loại phân gia súc, đặc biệt sử dụng thức ăn công nghiệp cho cá, cá nhanh lớn Nếu nuôi ®¹t cë 0,4 - > 0,5 kg cã thĨ xt đợc theo hình thức đóng nguyên con, gần tỉnh An Giang đà xuất đợc 400 - > 500 cá cho thị trờng Mỹ vào tháng đầu năm 1996 Cá sinh sản bình thờng nh cá rô phi trớc đây, song đo áp dụng tiến khoa kỹ thuật mới,đà dùng hoá chất làm tính cái, tạo đàn cá rô phi toàn đực với u điểm lớn nhanh, kích cỡ đồng đáp ứng đợc tiêu dùng xuất Ngoài sản phẩm cá rô phi nuôi có phẩm chất thịt thơm ngon, màu sắc hấp dẫn đợc ngời tiêu dùng a chuộng Giá 1kg cá thịt rô phi năm 1995 thị trờng giới 14 USD Nh cá rô phi đợc đánh giá cao, điếu đáng mừng, báo hiệu phát triển mạnh mẽ nghề nuôi cá rô phi giới nói chung, Châu nói riêng Thị trờng cá rô phi lớn hịên Trung Quốc,đà sản xuất gần sản lợng cá rô phi giới nhng chủ yếu phục vơ cho nhu cÇu níc, vËy hä vÈn phải nhập thêm cá rô phi nguyên Đài Loan Ngời tiêu dùng Trung Quốc a chuộng cá rô phi nuôi đến mức mà vạch kế hoạch phát triển nuôi cá nớc tới năm 2010 Họ xếp rô phi vằn bốn loài cá đợc u tiên phát triển hàng đầu (cïng víi c¸ håi níc ngät, c¸ chim níc ngät cá chép) Các nhận định đếu cho thị trờng đầy triển vọng cho sản phẩm cá rô phi nuôi Thị trờng cá rô phi nuôi Mỹ sôi động Mặc dù đà tăng nhanh sản lợng cá nuôi nớc từ 2.268 (năm 1991) lên 7.242 (năm 1996), nhng Mỹ phải nhập tới 25 nghìn (năm 1995), 28 nghìn (năm 1996) 33 nghìn (năm 1997) Nh Mỹ nớc nhập cá rô phi nuôi lớn giới Cá rô phi nuôi đứng hàng thứ sản phẩm nuôi trồng nhập vào Mỹ, sau tôm biển cá hồi nuôi Việt Nam điều đáng mừng gần số sở nuôi cá miền Nam đà mạnh dạn phát triển nuôi dòng cá rô phi có phẩm chất tốt theo phơng pháp công nghiệp Sản phẩm cá rô phi có chất lợng cao đà có bán thị trờng ®· xt khÈu sang mét sè níc Cã c¬ së nhập có rô phi đông nguyên liệu từ Đài Loan vào để tái chế biến xuất cá nhập có khối lợng lớn cỡ đồng giá lại "mềm" Tuy nhiên cá rô phi nớc ta phục vụ cho nhiều đối tợng ngời tiêu dùng Vì sản phẩm cá thơng mại phải đa dạng chất lợng, kích cỡ đặc biệt giá Những sản phẩm rô phi nuôi cã chÊt lỵng cao chđ u phơc vơ cho xt khẩu, cho khách sạn cho ngời có mức sống khá, chủ yếu đô thị Phần lớn ngời lao động cần sản phẩm cá rô phi cỡ trung bình có giá phù hợp Với cố gắng to lớn nhà khoa học, kinh nghiệm sản xuất sáng tạo ngời nuôi cá nớc ta, hy vọng cá rô phi nuôi lấy đợc thiện cảm ngời tiêu dùng nớc tiến tới có sức cạnh tranh cao thị tr- ờn giới Vì nghiên cứu đối tợng cá rô phi phù hợp với thực tiễn chăn nuôi với động vật thuỷ sản III Cơ sở lý luận thực tiễn đề tài Trong năm gần nghề chăn nuôi động vật thuỷ sản đà trở thành phổ biến nhiều nơi đà đem lại hiệu kinh tế cao Ngoài khả cung cấp cho nhu cầu tiêu dùng nớc sản phẩm nghề chăn nuôi thuỷ sản nguồn hàng xuất có giá trị Do quan tâm tới nhu cầu đặc điểm dinh dỡng động vật thuỷ sản điều thiết thực đảm bảo thành việc chăn nuôi động vật thuỷ sản Động vật thuỷ sản (cá thuỷ đặc sản) sống nớc, thở mang, thân nhiệt thay đổi theo nhiệt độ môi trờng nớc Do đặc điểm nên yêu cầu dinh dỡng chúng mang đặc tính riêng, khác với gia súc gia cầm Thức ăn vật chất cung cấp lợng giúp cho động vật nuôi sinh trởng, phát triển, nâng cao suất chất lợng sản phẩm Trong thức ăn có thành phần cần thành phần có ảnh hởng đến vật nuôi Đó vấn đề cần tìm hiểu để sở kết hợp với nhu cầu dinh dỡng vật nuôi thuỷ sinh, chế biến loại thức ăn thích hợp nhất, kinh tế làm cho vật nuôi lớn nhanh, phát dục tốt, suất cao Một biện pháp hữu ích mang lại hiệu sử dụng nấm men tạo sinh khối để chăn nuôi hay nói cách khác sử dụng thức ăn lên men Lợi dụng công nghệ lên men vi sinh vật để sản xuất, nhờ có đặc điểm nấm men phát triển nhanh nên thời gian ngắn ta có đợc lợng nấm men lớn Trong điều kiện thích hợp cấy 1kg nấm men giống sau ngày thu đợc 25kg nÊm men Tèc ®é sinh trëng cđa nÊm men gấp 2000 lần động vật mà thiết bị công nghệ đơn giản, môi trờng nuôi cấy nấm men phong phú, không chịu ảnh hởng thời tiết khí hậu, biến phế thải thành vật chất hữu ích, bảo vệ môi trờng không cạnh tranh đất đai với trồng trọt Hàm lợng đạm loại sản phẩm cao 30-70%, lợng tiêu hoá cao, hàm lợng can xi, photpho không bột cá, bột thịt Vì hớng đi, quy trình công nghệ có triển vọng dùng S.cerevisiae để sản xuất sinh khối từ nguyên liệu bột sắn, loại sản phẩm giàu tinh bột, giá thành rẻ chắn mang lại hiệu cao Cây sắn đợc bà sản xuất nhiều, đặc biệt đợc trồng nhiều Thanh Chơng - Nghệ An Đây loại chịu đất khô cằn nên sử dụng bột sắn đồng nghĩa với giải đợc vấn đề việc làm cho bà vùng cao Trong loại nấm men để sản xuất sinh khối, loài thuộc chi Saccharomyces đợc nghiên cứu nhiều cả, đặc biệt loài S.cerevisiae Trên thực tế đà có nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng sản phẩm loài Tuy nhiên việc sử dụng loài S.cerevisiae để sản xuất sinh khối từ bột sắn làm thức ăn cho cá vấn đề mẻ Từ thực tế nghiên cứu, triển khai đề tài với hy vọng tìm hiểu số tiêu liên quan đến khả tạo prôtêin, gluxit, vitamin, axit amin nguyên liệu bột sắn Loại nguyên liệu dồi nhng đợc chế biến sử dụng Đồng thời tìm hiểu khả tác dụng loại sinh khối đến sinh trởng phát triển cá rô phi điều kiện thí nghiệm Từ vận dụng vào thực tiễn chăn nuôi cá nói riêng, động vật thuỷ sản nói chung Bộ máy tiêu hoá cá rô phi gồm thực quản ngắn, dày nhỏ, ruột dài uốn khúc nhiều, dài gấp 14 lần chiều dài thân cá Miệng rộng hớng lên Răng hàm ngắn nhiều, xếp lộn xộn Với cấu tạo đà làm cho tính ăn cá rô phi vằn có điểm đáng ý: Đây loài cá ăn tạp, chúng ăn tảo sợi, loại động thực vật phù du, mùn bà hữu , ấu 140 136,82 120 100 80 105,9 90,79 60 60,54 70,13 40 20 ĐC CT1 CT2 CT3 CT4 trùng loại côn trùng, động vật sống nớc, cỏ, bèo v phân hữu c Cá có khả ăn thức ăn tinh bổ sun g nh cám gạo, bột ngô, bánh khô dầu phụ phế phẩm khác ảnh 1: Rô phi vằn O.niloticus Đặc điểm sinh cá rô phi vằn Tuổi kích thớc thành thục lần đầu cá rô phi phụ thuộc vào loài cá, môi trờng sống chế độ dinh dỡng cá Sống điều kiện thuận lợi, giàu thức ăn cá lớn nhanh phát dục cỡ lớn Còn sống nơi thiếu thức ăn cá thành thục cỡ nhỏ Bình thờng cá rô phi giống Oreochoromis thành thục lần đầu sau - tháng tuổi (nuôi ao) cỡ cá đạt 100 - 150g Nhng có trờng hợp cá thành thục cỡ dới 100g Khác với cá rô phi vằn, rôphi đen thành thục cỡ nhỏ hơn, dới 40 - 50g Hầu hết loài rô phi vằn đẻ nhiều lần năm Trong điều kiện khí hậu ẩm quanh năm nh tỉnh phía Nam, dòng cá rô phi vằn O niloticus đẻ từ 10 - 12 lần năm, tỉnh phía Bắc cá đẻ - lần mùa lạnh từ tháng 11 đến tháng cá ngừng đẻ Nhng cá từ tháng tuổi đến năm tuổi đẻ dày cá từ năm tuổi trở lên Rô phi vằn có đặc tính sinh sản đực làm tổ đẻ, ®êng kÝnh tỉ thêng lµ 20 - 30cm vµ thÝch hợp nhấy độ sâu 0,3 - 0,6m Sau đẻ cá mẹ áp trứng ngậm nở miÖng Thêi gian Êp trøng tõ - ngày nhiệt độ 300C thời gian ngậm kéo dài - ngày đến cá bột tiêu hết noÃn hoàng chúng khỏi miệng cá mẹ Sau giải phóng hết cá cá mẹ tiếp tục bắt mồi tham gia vào chu kỳ sinh đẻ Thời gian hai lứa đẻ kéo dài từ - tuần Trung bình lần cá đẻ từ 100 - 200 trứng Tuy nhiên số lợng trứng kích thích trứng tùy thuộc vào cỡ tuổi cá mẹ Cá cỡ lớn đẻ nhiều trứng hơn, 200 trứng cỡ trứng lớn Hiện viện nghiên cứu NTTS lu giữ số dòng nhập nội loài cá rô phi vằn Oreochromis niloticus, dòng : Rô phi vằn dòng Việt dòng cá đợc nhập từ Đài Loan, rô phi vằn dòng Thái Lan (gọi tắt dòng Thái), rô phi vằn dòng Ai Cập, rô phi vằn dòng GIFT Cả bốn dòng cá rô phi vằn nhập nội đà đợc đa vào nuôi thử nghiệm viện NCNTTS nhiều địa phơng miền Bắc nớc ta Sau năm thử nghiệm đà cho thấy dòng Gift cho kết tốt dòng Thái dòng Việt, dòng Ai Cập có tốc độ sinh trởng Tuy nhiên cá rô phi vằn dòng Việt cho kết nuôi không thua nhiều chọn nuôi dòng cá rô phi vằn chủng, điều kiện cho ăn chăm sóc tốt II Nấm men Saccharomyces cerevisiae Đơn vị phân loại Theo hệ thống phân loại Saccharomyces cerevisiae thc : Giíi nÊm (Fungi) Ngµnh: NÊm thËt (Mycota) Líp: NÊm tói (Ascomycetes) Ph©n líp: Hemiascomycetidae Bé: Endomycetales Họ: Saccharomycetaceae Chi: Saccharomyces Loài: Saccharomyces cerevisiae Đặc điểm sinh học Saccharomyces cerevisiae 2.1 Hình thái cấu tạo Saccharomyces cerevisiae loại nấm men có màu trắng thuộc chi Saccharomyces Nó có cấu tạo đơn bào, hình bầu dục, có kích thớc thay đổi khoảng 2,5 - 10àm x 4,5 - 21 àm (Nguyễn Lân Dũng - Vi sinh vËt häc, 1980) (H×nh 2) H×nh 2: Saccharomyces cerevisiae Nhân tế bào Saccharomyces cerevisiae có chứa 17 đôi nhiễm sắc thể ADN tế bào nấm men đơn bội có khối lợng phân tử x 1010Da (Dalton, Da = 1,67 x 10-24g), so với khối lợng phân tử ADN vi khuẩn Escherichia Coli lớn 10 lần nhng so với AND ngời nhỏ 100 lần Ngoài nhiễm sắc thể có loại Plasmid đợc phát năm 1967 tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae đợc gọi "2àm Plasmid" có vai trò quan trọng thao tác chuyển ghen kỹ thuật di truyền Loại Plasmid ADN vòng chứa 6.300 đôi bazơ ë m«i trêng nu«i cÊy cã 5% Glucoza cã tõ - ti thể, thêm 1% Glucoza số lợng ti thể tế bào vi nấm tăng lên tới 10 - 20 Nhng nuôi cấy loài điều kiện kỵ khí, tế bào ti thể (theo Bilai, 1974) 2.2 Chu trình sống Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae loại nấm men phân bố rộng rÃi thiên nhiên Chu trình sống nấm men chu trình đơn bội - lỡng bội - có hai giai đoạn đơn lỡng bội Đầu tiên tế bào dinh dỡng đơn bội (n) sinh sôi nảy nở theo lối nảy chồi Sau hai tế bào đơn bội kết hợp với nhau, có trao đổi tế bào chất nhân hình thµnh tÕ bµo lìng béi (2n) TÕ bµo lìng béi lại nảy chồi (sinh sản sinh dỡng) thành nhiều tế bào lỡng bội khác, cuối hình thành hợp tử Nhân hợp tử phân chia giảm nhiễm thành nhân đơn bội Mỗi nhân đơn bội đợc bao bọc nguyên sinh chất, hình thành màng, tạo thành bào tư n»m mét tói gäi lµ bµo tư tói Khi túi vỡ ra, bào tử phát triển thành tế bào dinh dỡng lại phân chia theo lối tiếp tục chu trình sống (hình3) Theo Trần Cẩm Vân - Vi sinh vật học môi trờng - Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội - 2002 H×nh 3: Chu tr×nh sèng cđa Saccharomyces cerevisiae 2.3 Khả lên men Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae gọi nấm men bánh mỳ, nấm men bia rợu Chúng lên men 95% đờng Glucoza theo ®êng ®êng ph©n kü khÝ, hiÕu khÝ cịng b»ng đờng chúng sử dụng đợc 70% Glucoza Hoạt tính lên men cực đại pH 4,5 - Nấm men làm bánh mỳ có khả lên men nhanh, nấm men chìm lên men chậm nhng không tạo bọt khí Saccharomyces cerevisiae sử dụng nhiều loại đờng : Glucoza, Galactoza, Mantoza, Saccaroza, nhng không đồng hoá trực tiếp đợc Lactoza không đồng hoá Nitrat (M.Bugnicourk, 1995) Do ®ã ngêi ta ®· sư dơng Saccharomyces cerevisiae để sản xuất men rợu quy mô lớn Từ có nhiều ứng dụng sản xuất đời sống từ nấm men B Nguyên liệu lên men Nguyên liệu đợc sử dụng bột sắn.Bột sắn đợc sử dụng làm chất cho nhiều trình lên men giá thành rẻ, hàm lợng tinh bột củ cao từ mà lên men bột sắn cho hàm lợng Protein cao, có hàm lợng Gluxit, Vitamin nhóm B, axitamin không thay Trên giới việc sử dụng bột sắn làm nguyên liệu để lên men phổ biến Raimbault đà nghiên cứu Senegal thuỷ phân bột sắn vi khuẩn Lactobacillus nhằm bảo quản sắn tơi cấy thêm nấm sợi đà làm giàu Protein Các chủng vi khuẩn Lactobacillus có khả thuỷ phân tinh bột đợc phân lập từ sắn đợc dùng để lên men Lactic nhằm cải thiện điều kiện bảo quản nh nâng cao giá trị dinh dìng cho bét s¾n ë níc ta, bét s¾n đợc bán rộng rÃi thị trờng với giá thành rẻ làm thức ăn cho vật nuôi Cây sắn đợc trồng phổ biến với lơng thực khác Nên sử dụng bột sắn làm nguyên liệu lên men dễ kiếm cho hiệu cao C Phơng pháp xác định tiêu nghiên cứu Sản xuất sinh khối - Sử dụng bột sắn đà vô trùng cấy giống Saccharomyces cerevisiae vào bột - Cho nớc, trộn - Cho vào khay, bọc PE, nuôi tủ cấy 30 0C trắng xốp - Làm khô, đánh mịn, đóng gói thu đợc sinh khối Xác định số lợng tế bào men sinh khối - Sinh khối 1g - Cho vào bình định mức - Pha loÃng đến 10-5 - Cấy vào môi trờng Hanxen (0,1ml/ đĩa petri) - Nuôi tủ cấy 300C 24 - Xác định số lợng khuẩn lạc a - TÝnh sè lỵng vi sinh vËt: X= a.v 1000 (TB/kg) v g Trong đó: X: Số lợng vi sinh vật kg a: Số lợng khuẩn lạc 1g v: thÓ tÝch pha lo·ng 1000: TÝnh cho 1kg g: Khối lợng nguyên liệu phân tích V0: thể tích dịch nghiên cứu cho vào đĩa petri Xác định Protein toàn phần phơng pháp quang phổ theo Gocman, Bacdavin, David * Nguyên tắc: Trong Protein có liên kết peptit liên kết với Cu môi trờng kiềm tạo phức Chelat có màu tím đậm độ dung dịch màu tỷ lệ với mạch peptit cđa ph©n tư protein R2 R4 NH2 - CH - CO - NH - CH - CO - NH - CH - CO - NH - CH - COOH R1 R3 20R2 0 + Cu2+- NH - CH - C = N - CH - C - N - CH - C NaOH R1 R3 Cu 2Na+ R6 R4 - NH - CH - C - N - CH - C - N - CH - C R5 0 *Hoá chất thiết bị: Thuốc thử (Gocman hay Biore) gåm cã: a NaOH 10% b 1,5g CuSO4 5H2O + 6g NaK C4H4O6 4H2O vµ mét Ýt nớc cất, khuấy cho tan hoàn toàn Sau dïng níc cÊt dÉn ®Õn møc 500ml Thc thư Biore hỗn hợp dung dịch a, b nớc cất với tỷ lệ 3a/5b/2H2O Cách pha: Cho vào ống đong 5V dung dịch b sau cho 3V dung dịch a, khuấy đều, tiếp tục cho 2V nớc cất để dung dịch đến mức 10V hỗn hợp dung dịch Khuấy kỹ bảo quản lọ polyetilen * Tiến hành: - Nguyên liệu 0,5g - gelatin 0,5g - Cho vào bình định mức 50ml - Cho vào bình định mức 50ml, đun tan 30ml nớc - Thêm nớc đến ngấn - Thêm nớc đến ngấn - Lấy 1ml + 4ml thuèc thö - LÊy 1ml + 4ml thuốc thử - Lắc để 30phút - Lắc để 30phút - Đo màu bớc sóng 550nm - Đo màu bớc sóng 550nm - Ghi Am (A mÉu) - Ghi Ach (A chuÈn) *KÕt qu¶: X dd = A m 1% A ch ⇒ C= X dd V.1000 g Trong : C: Prôtêin nguyên liệu V: Thể tích pha loảng g: Khối lợng nguyên liệu phân tích 100: tính cho kg Xác định gluxit theo phơng pháp Couse-Bonous *Nguyên tắc: Hồ hoá tinh bột tạo thành dung dịch,trong tinh bột dạng xoắn , có iôt cho màu xanh tím Đây tợng vật lý làm cấu trúc thay đổi từ làm cho lợng thay đổi cho ta phổ nhìn thấy (khả kiến) thay đổi đậm độ dung dịch màu xanh tím cho ta biết đợc hàm lợng tinh bột * Hoá chất - Tinh bột tan, KI, I2, HCl đặc - Nguyên liệu (cám, bột sắn, sinh khối) * Tiến trình : - Dung dịch tinh bét chuÈn : 0,5g tinh bét tan + 30ml níc cho vào bình định mức 50ml lắc cách thuỷ sôi đến có màu thêm nớc đến ngấn bình định mức - Dung dịch i«t 0,1N : 0,5gKI + 50ml níc cÊt + 9ml HCl đặc + nớc đến ngấn bình định mức 0,25g I2 1000ml - Dung dịch nghiên cứu (bột sắn,cám,sinh khối): Làm tơng tự dung dịch tinh bột chuẩn đo - Đo màu: Đo bớc sóng = 550nm + èng tr¾ng 5ml níc cÊt → Ghi A0 giät thuèc thö + èng chuÈn 5ml tinh bét → Ach giät thc thư + èng nghiªn cøu 5ml dung dịch nghiên cứu Ghi Am giọt thuốc thư * KÕt qu¶: Xdd = A m 1% A ch ⇒C= X dd V.1000 g Trong ®ã: C: Gluxit nguyªn liƯu V: ThĨ tÝch pha lo·ng g: Khèi lợng nguyên liệu lấy phân tích 1000: Tính cho 1kg Xác định Vitamin B1 đo phổ (phơng pháp Axachian) * Nguyên tắc: Vitamin B1 tác dụng với thuốc thử diazo môi trờng kiềm cho phức hợp có màu đỏ da cam Khi so màu ta xác định đợc mật độ quang dung dịch nghiên cứu dung dÞch chn ë bíc sãng λ = 460nm Tõ tính lợng Vitamim B1 dung dịch nguyªn liƯu Cl NH2 N CH2 CH3 N NH2 -N≡N + 0=S- N S Na0H 0= S 0Na CH3 R - N = N- - H20 CH3 S R: CH3 NH2 NH CH2 2N: N (CH2)2- 0H (CH2)2- 0H * Ho¸ chÊt: Thc thư diazo: a - Dung dịch sở: 0,4g axit Sunfanilic 9ml HCl đặc Níc cÊt ®Õn ngÊn 100ml (che tèi) b- NaNO2 5% Thuốc thử diazo : 1,5V dung dịch sở + 1,5V dung dịch NaNO2 5% * Tiến hành: - Cân 5g nguyên liệu, tán mịn, tráng HCl 0,1N cho vào bình định mức, thêm HCl 0,1N đến ngấn 100ml, lọc - Đo màu: + 1ml B1 (chuẩn) + 5ml diazo+1ml NaOH10% + 1ml dung dịch nghiên cứu + 5ml diazo +1ml NaOH10% * Kết quả: Lợng Vitamin B1 dung dịch là: Cx = A nc C ch Ach Từ ta có lợng Vitamin B1 có nguyên liệu là: XB1= C x V.100 (mg%) g Trong ®ã: V: thĨ tÝch pha lo·ng g: Số gam lấy phân tích 100: Để tính 100g Xác định tăng trởng cá theo Blackman P= Trong ®ã: Wt − W0 100% W0 W0 : Trọng lợng cá ban đầu (lúc nuôi) Wt: Trọng lợng cá sau thời gian t Xác định hệ số thức ăn theo Viện nghiên cứu nuôi trồng Thuỷ sản I Hệ số thức ăn = Tổng số l ợng thức ă n Tổng trọng l ợng t ă ng trọng Xác định tỷ lệ chuyển hoá thức ăn theo Viện nghiên cứu nuôi trồng Thuỷ sản I Tổng trọng lợng tăng thịt Tỷ lệ chuyển hoá thức ăn % = 100 Tổng trọng lợng thức ăn tiêu tốn Phơng pháp dùng toán thống kê để xử lý số liệu - Xác định trị số trung bình céng : X= ∑X i n X : TrÞ sè trung bình cộng Xi: Giá trị thứ i dÃy biến số n: Số lần xuất giá trị dÃy biến số - Xác định độ lệch trung bình δ =± ∑ (X − X) n −1 i : Độ lệch trung bình Phần III: Kết nghiên cứu Chơng 1: Sản xuất sinh khối nấm men Saccharomyces cerevisiae từ nguyên liệu bột sắn I Quy trình sản xuất sinh khối Đặc điểm: Trong công nghệ truyền thống hay công nghệ sinh học để nâng cao chất lợng thành phẩm, tăng suất sản xuất ngời ta thờng sản xuất sinh khối tạo giống sản xuất (giống cấp 2) Từ lâu nhân dân ta đà biết sử dụng cơm nguội cho lên men hay dùng nếp lứt cho lên men rợu từ tạo rợu nếp thơm ngon đáp ứng nhu cầu đời sống ngời- cách sản xuất sinh khối Ngày khoa học phát triển đặc biệt phát triển công nghệ vi sinh học, ngời đà tạo quy trình sản xt sinh khèi kh¸c øng dơng nhiỊi lÜnh vùc khác Việc nuôi cấy vi sinh vật quy mô lớn để làm nguồn Protein cung cấp cho ngời gia súc đợc coi biện pháp giải nạn khan thức ăn Đức đại chiến giới lần thứ Tại Berlin, Delbruck đồng đà lần tỉ chøc viƯc nu«i cÊy nÊm men bia S.cerevisiae.Sinh khèi nấm men đợc dùng chủ yếu để bổ sung vào xúp xúc xích Hiện nấm men đợc sản xuất nh phụ phẩm công nghiệp bia Hàng năm giới sản xuất tiêu thụ khoảng 1,7 triệu nấm men làm nở bột mỳ Nấm men có nhiều u điểm so với vi sinh vật khác để tạo sinh khối: sinh trởng ph¸t triĨn nhanh (30 - 60 mét thÕ hƯ), lên men nhanh, tận dụng đợc phế liệu rẻ tiền,có thành phần dinh dỡng quý giá ngời vật nuôi đặc biệt từ S cerevisiae tái tổ hợp ngời ta đà chiết đợc nhân tố hooc môn sinh trởng bò - endorphine, kháng nguyên Hepatit B tác nhân sinh trởng gia ngời, Globulin miễn dịch E chuột (M.L, Gaurgard cộng sự, 1993) Để tổng hợp Protein từ nấm men sử dụng nhiều loại nguyên liệu khác nhau, nh nguyên liệu nguồn Cacbon, rỉ đờng, bột ngũ cốc, nớc thải nhà máy giấy, bả thực vật Năm 1974 dới lÃnh đạo Senez trờng Đại học tổng hợp Marseilles Viện nghiên cứu khoa học vi phát triển hợp tác Pháp (ORSTOM) đà nghiên cứu sản xuất Protein đơn bào từ chất giàu tinh bột Công trình nghiên cứu Raimbault (1980) nhằm sử dụng vi sinh vật để chế biến nông sản giàu tinh bột thành sản phẩm giàu protein Bột sắn loại nông sản giàu tinh bột, dùng nguyên liệu bột sắn để lên men S.cerevisiae phơng pháp sản xuất sinh khối đem lại hiệu cao, có đợc hàm lợng Protein cao chất cần thiết cung cấp cho vật nuôi nhằm tăng nhanh suất sản xuất Quy trình sản xuất sinh khối Quy trình sản xuất sinh khối nấm men S.cerevisiae nh sau: Bột sắn xay mịn, sấy khô Giống S.cerevisiae Bột sắn + S.cerevisiae Trộn Cho nớc cất vừa nhÃo Nắm thành bánh Nuôi tủ ấm 300C Trắng xốp (Bào tử mọc đều) NÊm men S.cerevisiae - ... đề tài "Sinh khối nấm men Saccharomyces cerevisiae từ nguyên liệu bột sắn đến tăng trởng cá Rô phi vằn Oreochromis niloticus" , với mục đích: Tìm hiểu giá trị dinh dỡng có sinh khèi nÊm men Saccharomices... cá rô phi vằn O niloticus đẻ từ 10 - 12 lần năm, tỉnh phía Bắc cá đẻ - lần mùa lạnh từ tháng 11 đến tháng cá ngừng đẻ Nhng cá từ tháng tuổi đến năm tuổi đẻ dày cá từ năm tuổi trở lên Rô phi vằn. .. nuôi cá rô phi đà đợc công bố Hội thảo Ba loài cá rô phi nuôi quan trọng giới Rô phi vằn O niloticus, Rô phi xanh O.aureus rô phi đen O mossambicus Sản lợng chúng chiếm 90% tổng sản lợng cá rô phi