Thí nghiệm đường cong sinh trưởng nấm men Trong thí nghiệm này, chủng nấm men nuôi cấy bình tam giác thuỷ tinh, thay đổi nồng độ tế bào kiểm soát cách dùng ba kỹ thuật khác nhau: đếm kính hiển vi, xác định khối lượng khô, độ đục dịch huyền phù tế bào Nguyên liệu - Một chủng nấm men sinh trưởng nuôi cấy dịch huyền phù Chúng ta thu chủng nấm men từ phòng thí nghiệm vi sinh vật mua chủng đặc biệt từ công ty - Glucose, dịch chiết nấm men, NH4Cl, MgSO4, CaCl2 chất chống tạo bọt để pha môi trường - Hai bình tam giác 125 mL - Pipette vô trùng - Đèn Bunsen - Nồi khử trùng - Tủ ấm - Hemocytometer - Ly tâm - Cân hóa chất - Máy quang phổ Phương thức tiến hành - Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: Môi trường sinh trưởng đặc trưng nấm men: - Glucose: 100g - Dịch chiết nấm men: 8,5g - NH4Cl : 1,32g - MgSO4 : 0,11g - CaCl2 : 0,06g - Chất chống tạo bọt: 0,2 ml - Nước bổ sung vừa đủ :1 L - Rót 50 mL/bình vào bình tam giác loại 125 mL - Nút bình tam giác số vật liệu sau: giấy nhôm, nút plastic chịu nhiệt, nắp inox, không thấm nước - Khử trùng bình tam giác đựng môi trường 121oC 20 phút - Tiếp mẫu (inoculate) mL dịch nuôi cấy nấm men trước vào bình tam giác chứa môi trường vô trùng Tiến hành cẩn thận để khỏi bị nhiễm bẩn pipette, nắp đậy bình tam giác suốt trình tiếp mẫu Để giảm thiểu hội nhiễm bẩn, nên đốt nắp đậy cổ bình tam giác sau lấy nắp để cấy nấm men vào - Đặt bình tam giác vào tủ ấm 37oC - Lấy mL mẫu khoảng thời gian khác trình nuôi cấy để xác định nồng độ tế bào cách đếm kính hiển vi, xác định trọng lượng khô đo độ đục (mật độ quang) máy quang phổ Thời gian lấy mẫu phải xếp thu cho đường cong sinh trưởng tốt thể ba phase sinh trưởng Trước lấy mẫu phải trộn tất thành phần bình tam giác cách lắc Bất động tế bào Phương pháp bất động (immobilization) tế bào hoàn chỉnh có nhiều ưu điểm kỹ thuật nuôi cấy truyền thống Bằng cách bất động tế bào, việc thiết kế quy trình đơn giản tế bào gắn với phần tử lớn bề mặt phân tách dễ dàng khỏi dòng sản phẩm Điều đảm bảo hoạt động liên tục hệ lên men không bị nguy rửa trôi tế bào Sự bất động cung cấp điều kiện có lợi cho phân hóa tế bào truyền đạt thông tin tế bào, cách thúc đẩy sản phẩm có sản lượng chất trao đổi thứ cấp cao Sự bất động bảo vệ tế bào cách làm giảm cố liên quan tới lực trượt (shear forces) gây tổn thương tế bào Các phương pháp bất động tế bào: Phương pháp Vật liệu Mảnh gỗ mỏng, Gắn lên bề mặt collagen, microcarrier, cácnhựa trao đổi ion, oxide kimloại Tạo thể xốp Cordierite, poreglass, acrylamide, alginate, collagen, κ-carrageenan Polylysine, Bao vi thể ethylcellulose, emulsion, màng tổng hợp Các tiểu thể hệ sợi, Tự kết khối polyelectrolytes, nhân tố liên kết ngang Gắn lên bề mặt Các tế bào gắn lên bề mặt mảnh gỗ nhỏ, collagen, microcarrier, nhựa tổng hợp trao đổi ion (resin) Một ví dụ kiểu bất động sử dụng microcarrier cho tế bào động vật Ưu điểm microcarrier cung cấp diện tích bề mặt lớn để gắn tế bào Vật liệu cho microcarrier bao gồm nhựa tổng hợp trao đổi ion, hạt nhỏ dựa sở dextran bọc gelatin, hạt polyacrylamide, hạt polystyrene, hạt thủy tinh rỗng, hạt cellulose hình trụ, giọt floruacarbon nhỏ ổn định polylysine Hiện nay, microcarrier dựa dextran sử dụng rộng rãi để bất động tế bào động vật Tạo thể xốp Phương pháp cho phép tế bào khuếch tán thể xốp có sẵn cordierite pore glass (hạt thủy tinh có nhiều lỗ rỗng nhỏ), chúng sinh trưởng giữ lại Ưu điểm phương pháp vật liệu tạo thể xốp có sẵn chống chịu phân hủy bình nuôi có khuấy từ loại vật liệu tạo thể xốp khác (alginate, acrylamide…), thể xốp thường hại tế bào Tuy nhiên, phương pháp gặp khó khăn việc hướng tới nồng độ cao tế bào thể tích lỗ thủy tinh (pore) bị giới hạn chúng làm sẵn loại vật liệu tạo thể xốp đặc trưng Một phương thức khác bọc tế bào thể xốp tạo thành điều kiện in situ Các vật liệu thuộc gelatin khác acrylamide, alginate, collagen, κ-carrageenan, trộn với dịch huyền phù tế bào tạo gel dạng kích thước khác Một phương thức đơn giản khác tạo hạt hình cầu dạng gel alginatecalcium sau: Các tế bào dịch huyền phù sau cô lại trộn với alginate để tạo nồng độ alginate cuối từ 1-3% (w/v) hỗn hợp alginate-tế bào bơm kim tiêm thuốc vào dung dịch calcium chloride Các hạt tạo thành tức thời có đường kính từ 1-5 mm tùy thuộc vào nồng độ tế bào alginate dung dịch kích thước mũi kim tiêm Cần lưu ý thêm phải trì vô trùng suốt trình bất động tế bào Nhược điểm việc sử dụng alginate để bất động tế bào để lọt tế bào từ phân chia tế bào xuất bên hạt riêng rẽ Việc lọt tế bào giảm thiểu cách tăng nồng độ alginate calcium chlorite hạt cách tạo hạt nhỏ Tuy nhiên, việc tăng nồng độ alginate calcium chloride hạt làm giảm tốc độ khuếch tán chất thông qua gel ảnh hưởng đến khả sống sót tế bào bao bọc Sử dụng bao vi thể Các tế bào bất động bao vi thể (microcapsule) có màng màng bán thấm không cố định cố định Ưu điểm kỹ thuật đóng vỏ bao tạo diện tích bề mặt lớn cho tiếp xúc chất tế bào Màng bán thấm cho qua cách chọn lọc thành phần có trọng lượng phân tử thấp Các màng dạng sợi rỗng tạo thành cấu trúc hình ống thường hàng bó sợi song song bên buồng hình trụ Các tế bào giữ lại thành sợi rỗng môi trường dinh dưỡng thông khí luân chuyển quanh sợi Loại màng cung cấp thêm bảo vệ chống nhiễm bẩn môi trường Tuy nhiên, nhược điểm hệ thống màng giá thành cao, tắc nghẽn màng làm trở ngại cho việc chuyển khối gây khó khăn việc thông khí Tự kết khối Các tế bào tự kết khối kết thành cụm len xem tế bào bất động kích thước lớn chúng có ưu điểm tương tự bất động phương pháp khác Trong nấm mốc tạo tiểu thể tự nhiên, tế bào vi khuẩn nấm men lại cần đến kết cụm Các nhân tố kết thành cụm nhân tạo nhân tố liên kết ngang (cross-linkers) bổ sung để tăng cường trình ... Phương thức tiến hành - Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: Môi trường sinh trưởng đặc trưng nấm men: - Glucose: 100g - Dịch chiết nấm men: 8,5g - NH4Cl : 1,32g - MgSO4 : 0,11g - CaCl2 : 0,06g - Chất... đo độ đục (mật độ quang) máy quang phổ Thời gian lấy mẫu phải xếp thu cho đường cong sinh trưởng tốt thể ba phase sinh trưởng Trước lấy mẫu phải trộn tất thành phần bình tam giác cách lắc Bất... kích thước lớn chúng có ưu điểm tương tự bất động phương pháp khác Trong nấm mốc tạo tiểu thể tự nhiên, tế bào vi khuẩn nấm men lại cần đến kết cụm Các nhân tố kết thành cụm nhân tạo nhân tố liên