KHOA KỸ THUẬT HỐ HỌC , ` LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC SVTH : HÀ MINH QUANG MSSV : 60302199
CBHD: PGS.TS LE VAN VIET MAN BO MON KY THUAT THUC PHAM
Trang 5
LOF CAM ON
Với khoảng thời gian hơn bốn năm ngồi trên ghế giảng
đường, và đặc biệt là hơn bốn tháng làm luận văn tốt
nghiệp vừa qua, em đã trưởng thành rất nhiều trong việc nghiên cứu cũng như trong rèn luyện nhân cách bản thân Để cĩ được những điều này, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến tất cả các quý thầy cơ trường Đại học Bách
Khoa, và đặc biệt là các thầy cơ trong Bộ mơn Cơng nghệ
thực phẩm, những người đã giúp đỡ và dầu dắt em rất nhiều
trên con đường trở thành một kỹ sư, một trí thức trẻ trong tương lai
Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến thầy Lê Văn Việt Mẫn đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo và động viên em trong suốt thời gian làm luận văn vừa qua
Xin trân trọng cam ơn sự giúp đỡ tận tình của anh Trần Quốc Hiền đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em thực hiện
đề tài này
Trang 6MỤC LỤC
LỜI CẲM ƠN 22-2222 2212111122111 E121 xe Error! Bookmark not defined
ÿI0en/ 1 A iii
DANH MUC HINH .cccscsccsssssesssssssssssecssssssccsssessssusccssssccsssseessusccssssecsssessesusessssscesseceesseesess v MEN YI0e8:7 cm 45 3133 )H ) ƠỎ viii
TOM TẮT LUẬN VĂN -2222222222222222222222222222.2 1 1.0101111111111.1 eerre 3
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 2 2£ ©S2SE22EE2E3121321271211211111.1.21111E 11111 1
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN - 22222222120221220 101 1 ee 3
2.1 CỐ ĐỊNH TẾ BÀO: - 222EE2+2+++EE21222111111111122221111 11 1 10001011 ca 3
2.1.1 Định nghĩa: 6 5c - 2E E121 21121 12H TH TT HH HT TH ngư 3
2.1.2 So sánh tế bào cố định so với tế bào tự đO: - ¿+52 2s+£+S+Seszzx+xzxzxexe sex 3 2.1.3 Các kĩ thuật cố định tế bào 2222222222++222222222111111222221111112 2 1 e 4 2.2 CỐ ĐỊNH NẤM MEN TRONG GEL ALGINATE: 2.2.1 Nấm men bia: .eeeeseeseessessessessessessessessesueenessesuecuesuesuessesnesuesuesueaeenesueesesnesneeseeneens 8 , 2 Y¿ 9
2.2.3 Cơ chế tạo Ø€]: 52t 2t x2 + E223 2121121111111112121111111111111111211.1e 11 2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ bêển của gel alginat€: -. ¿:-5++>+sxss+ 13 2.2.5 Một số đặc điểm của nấm men cố định trong gel alginate: :- 14
2.3 ỨNG DỤNG NẤM MEN CỐ ĐỊNH TRONG LÊN MEN BIA NONG ĐỘ CAO: 19
2.3.1 Khái niệm lên men bia nơng lo .-A-A 19
2.3.2 Quy trình cơng nghệ sản xuất bia sử dụng phương pháp lên men bia nồng độ
cao: 20
2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men bia nơng độ cao sử dụng nấm men
cố định trong øel aÏØÏIDAfC: cĩ + St St 2txExxEEEEE E3 EE1171711111111111111 11t teE 21
CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27
E00 27
Trang 7
3.1.2 NAM MEME 27
3.1.3 Chat mang c6 dimh t& Da0: oe eeceseeeseesesesesseseeseseeseseeseseeseeneseseseeneneeeneecsseeneaees 27
3.2 Phương pháp nghiên cứu: 27
3.2.1 Mục đích và nội dung nghiên CỨU: . - 2 ¿+52 + *++*£+£+vE+v£veeeeeseese 27 3.2.2 Quy trình cơng nghệ sản xuất bia trong nghiên cứu: -.- 5+5: 30 3.2.3 Các phương pháp phân tÍCH: ¿+ - + xxx vn ngàng nưy 35
Trang 8DANH MỤC HÌNH
CHƯƠNG 2:
Hình 2 1: Các phương pháp cố định tế bào . ¿+ 2 St 22t£E+E‡E+EvEESveErvexrxrrrsrrr 5
Hình 2 2: Quá trình lên men €thannO Ì - - «<< + xxx E3 vn kHkrưy 9
Hình 2 3: Các monomer của acid alginic
Hình 2 4: Cấu trúc các block của phân tử cửa acid alginic A: Block G,B: Block M, C:
000 Ss - - 10
Hình 2 5: Sự liên kết giữa ion Ca”” và gốc G -. ¿ ©222+2222222EEEteEEEvrttrkrrerrrrrrrres 13
Hình 2 6: Phương pháp tạo gel khuếch tán . - ¿+ ¿52+ 5+2 S+E+EE+EvEtexertrxerrrxrrrrs 13 Hình 2 7: Phương pháp tạo gel nỘi - - + x11 E3 vn nh nh nhà 13 Hình 2 8: Con đường hình thành và phân huỷ điac€tyÌ ¿- ¿5s «+ £+xeesxexe+ 19
Hình 2 9: Sơ đổ quy trình sẩn xuất bia ứng dụng kĩ thuật lên men bia nơng độ cao 20 Hình 2 10: Sự thay đổi hình thái của các tế bào nấm men S.cerevisiae (nấm men chìm)
A: trước khi chịu tác động của áp lực thẩm thấu, B: sau 15 phút tiếp xúc với dung dịch SOTItOI 2G SG 11T TH TH HH TH TH HH TT TH TH TT TH TT HH 24 Hình 2 11: Sự thay đổi hình thái của các tế bào nấm men chìm (A): trước khi chịu tác động của ethanol, (B): sau 15 phút tiếp xúc với dung dịch ethanol 10% (v/v) CHƯƠNG 3:
Hình 3 1: Sơ đồ nghiên cứu
Hình 3.2: Sơ đồ quy trình sản xuất bia non trong nghiên cứu - 5s s+5++x+sx+x 30
Hình 3 3: Giản đổ nấu dịch nha . ¿+ S2 +2 8 SE SE2E£ SE EeEEEEEE2E2EE 3E rxErkrrxer 31
Hình 3 4: Quy trình cố định nấm men trong gel Ca-alginaf€ -:- +5 x+z++xvzxsx 33
CHƯƠNG 4:
Hình 4 I: Sự biến đổi mật độ nấm men trong quá trình lên men chính, sử dụng dịch nha cĩ
Trang 9Hình 4 2: Hình chụp cấu trúc gel Ca-alginate trước khi lên men bằng kính hiển vi điện tử
quét A,B: bể mặt và lõi hạt gel ở độ phĩng đại 300 lần C,D: bể mặt và lõi hạt gel ở độ phĩng đại 1000 lẦn - - 5:25 SEE2322321221212171212121711111112111111111111111 xe 40
Hình 4 3: Hình chụp cấu trúc hạt gel Ca-alginate sau quá trình lên men bằng kính hiển vi
điện tử quét A,B: bể mặt và lõi hạt gel ở độ phĩng đại 300 lần C,D: bể mặt và lõi hạt gel ở độ phĩng đại 500 lần „41
Hình 4 4: Sự biến đổi nồng độ đường khử trong quá trình lên men chính, sử dụng dịch nha
cĩ nồng độ chất khơ ban đầu 24”Bx, mật độ giống cấy thay đổi từ 10 triệu tế bào/ml đến 40 triệu tế bàO/Hl - St St‡xEEEkEExSY SE 111111111111 111111111111 1111111 Trkrke 44
Hình 4 5: Sự biến đổi nơng độ FAN trong quá trình lên men chính, sử dụng dịch nha cĩ
nơng độ chất khơ ban đầu 24°Bx, mật độ giống cấy thay đổi từ 10 triệu tế bào/ml đến 40
i08 1027Ẽ2757 :.-."2s 46
Hình 4 6: Sự biến đổi nơng độ ethanol tạo thành trong quá trình lên men chính, sử dụng
dịch nha cĩ nơng độ chất khơ ban đầu 24°Bx, mật độ giống cấy thay đổi từ 10 triệu tế bào/mI đến 40 triệu tế bầo/ml - - ¿- + ¿+2 SE S8 9E £E2E SE E#EE£E£E£vEEEEErxrkrkrsrkreerree 48
Hình 4 7: Sự biến đổi pH trong quá trình lên men chính, sử dụng dịch nha cĩ nồng độ chất
khơ ban đầu 24”Bx, mật độ giống cấy thay đổi từ 10 triệu tế bào/ml đến 40 triệu tế
bao/ml 50
Hình 4 §: Sự biến đổi nơng độ diacetyl tạo thành trong quá trình lên men chính, sử dụng
dịch nha cĩ nơng độ chất khơ ban đầu 249Bx, mật độ giống cấy thay đổi từ 10 triệu tế bào/mI đến 40 triệu tế bầo/ml - - ¿+ ¿2E SE +8 E+S£ +E+EE#EEEE£EEEEE+EEEESEEEkekrxrxrxcrrke 50
Hình 4 9: Sự biến đổi mật độ nấm men trong quá trình lên men chính, sử dụng dịch nha cĩ
nồng độ chất khơ ban đầu 24°Bx, mật độ giống cấy 10 triệu tế bào/ml, thời gian sục khí
thay đổi từ 0 — 20h 54
Hình 4 10: Sự biến đổi nơng độ đường khử trong quá trình lên men chính, sử dụng dịch
nha cĩ nồng độ chất khơ ban đâu 24°Bx, mật độ giống cấy 10 triệu tế bào/ml, thời gian
sục khí thay đổi từ Ư — 20Hh 2: 25+ S2t+x22E£Y2E2EE232121123121211711111211112121111111.2 x1 58
Hình 4 11: Sự biến đổi nổng độ FAN trong quá trình lên men chính, sử dung dịch nha cĩ nơng độ chất khơ ban đâu 249Bx, mật độ giống cấy 10 triệu tế bào/mI, thời gian sục khí
thay đổi từ Ĩ — 20h ¿5522222122 2321123121121121121121121121121111121211111111111111212111111 2 x1 60
Hình 4 12: Sự biến đổi nỗng độ ethanol sinh ra trong quá trình lên men chính, sử dụng
dịch nha cĩ nồng độ chất khơ ban đầu 24°Bx, mật độ giống cấy 10 triệu tế bào/ml, thời
Trang 10Hình 4 13: Sự biến đổi pH trong quá trình lên men chính, sử dụng dịch nha cĩ nồng độ
chất khơ ban đâu 249Bx, mật độ giống cấy 10 triệu tế bào/mI, thời gian sục khí thay đổi từ 0 — 20h 63
Hình 4 14: Sự biến đổi nơng độ diacetyl trong quá trình lên men chính, sử dụng dịch nha
cĩ nồng độ chất khơ ban đâu 24°Bx, mật độ giống cấy 10 triệu tế bào/mI, thời gian sục
khí thay đổi từ 0 — 20h
Hình 4 15: Nơng độ một số sản phẩm phụ tạo thành trong quá trình lên men chính, sử
dụng dịch nha cĩ nồng độ chất khơ ban đầu 24°Bx, mật độ giống cấy 10 triệu tế bào/mI,
thời gian sục khí thay đổi từ O — 20h ¿- ¿5+ 2t S222 E221 66
Trang 11DANH MỤC BẢNG
CHƯƠNG 2:
Bảng 2 I: Tỉ lệ M/G của một số chế phẩm acid alginic [63]
Bảng 2 2: So sánh tốc độ sử dụng glucose và tốc độ tạo thành ethanol của nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate: [1043] - ¿+ 5+ x+xex+xsxvexervererevervrkerves 15 Bảng 2 3: Sự hình thành một số sản phẩm trung gian trong chu trình đường phân của nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate [103]
Bảng 2 4: Hàm lượng một số sản phẩm phụ trong bia non được lên men bằng mấm men tự do và nấm men cố định trong øel Ca-a]ginf€ ¿25:52 232 2SEEE‡E£Y£EeEvEEEvzvrvexrxrsrse 17
Bảng 2 5: Lượng cthyl acetate và iso-amyl acetate trong bia non lên men bằng nấm men
cố định trong gel alginate và nấm men tự do 18
Bảng 2 7: Thời gian lên men các dịch nha nồng độ 12 - 30% (w/w) ở 13°C, sử dụng
Š.cerevisiae cố định trong gel alginate so với nấm men tự do 23
Bảng 2 8: Tốc độ tổng hợp ethanol của S.cerevisiae c6 dinh trong gel alginate trong quá
trình lên men các dịch nha nồng độ 12— 30% (w/v) ở 13C .- -¿cc se cxccxsecexexee 23
Bảng 2 9: Khả năng sống sĩt của nấm men chìm S.cerevisiae cố định trong gel alginate
trong quá trình lên men các dịch nha nơng độ 12 - 30% (w/w) ở 13°C 26
CHƯƠNG 3:
Bang 3 1: Khối lượng nguyên liệu sử dụng cho một mẻ nấu dịch nha trong nghiên cứu 32
CHƯƠNG 4:
Bảng 4 1: Sự biến đổi mật độ nấm men trong quá trình lên men chính, sử dụng dịch nha
cĩ nồng độ chất khơ ban đâu 249Bx, mật độ giống cấy thay đổi từ 10 triệu tế bào/ml đến
40 triệu tế bào/mI
Bảng 4 2: Sự biến đổi nồng độ đường khử trong quá trình lên men chính, sử dụng dịch nha cĩ nồng độ chất khơ ban đâu 24Bx, mật độ giống cấy thay đổi từ 10 triệu tế bào/ml đến F00008 0100 0 ẼẺ -:3+a a 43
Trang 12Bảng 4 3: Tốc độ trung bình sử dụng đường khử của nấm men trong quá trình lên men chính, sử dụng dịch nha cĩ nồng độ chất khơ ban đầu 242Bx, mật độ giống cấy thay đổi từ 10 triệu tế bào/mI1 đến 40 triệu tế bầo/ml ¿ - ¿+22 25s +E£E+E+E2 #E£E+E£EzE+E+E£E+E£+xzezxzxrz 44
Bảng 4 4: Sự biến đổi nồng độ FAN trong quá trình lên men chính, sử dụng dịch nha cĩ
nơng độ chất khơ ban đầu 249Bx, mật độ giống cấy thay đổi từ 10 triệu tế bào/mI đến 40 triệu tế bào/mI 45
Bảng 4 5: Sự biến đổi nồng độ ethanol tạo thành trong quá trình lên men chính, sử dụng
dịch nha cĩ nổng độ chất khơ ban đầu 242Bx, mật độ giống cấy thay đổi từ 10 triệu tế bào/ml đến 40 triệu tế bầo/ml ¿ ¿252252 +2 E‡SE£EEE+E£EEESEEEEEESEEESEEEEEESEEESEEErkrrkrkrrree 47
Bảng 4 6: Tốc độtrung bình sinh tổng hợp ethanol trong quá trình lên men chính, sử dụng
dịch nha cĩ nổng độ chất khơ ban đầu 249Bx, mật độ giống cấy thay đổi từ 10 triệu tế bào/mI đến 40 triệu tế bầo/ml - - ¿- + ¿+2 SE S8 9E £E2E SE E#EE£E£E£vEEEEErxrkrkrsrkreerree 47
Bảng 4 7: Sự biến đổi pH trong quá trình lên men chính, sử dụng dịch nha cĩ nồng độ
chất khơ ban đầu 24°Bx, mật độ giống cấy thay đổi từ 10 triệu tế bào/mI đến 40 triệu tế
bao/ml 49
Bảng 4 8: Sự biến đổi nơng độ diacetyl tạo thành trong quá trình lên men chính, sử dụng
dịch nha cĩ nồng độ chất khơ ban đầu 242Bx, mật độ giống cấy thay đổi từ 10 triệu tế bào/mI đến 40 triệu tế bầo/ml - - ¿+ ¿2E SE +8 E+S£ +E+EE#EEEE£EEEEE+EEEESEEEkekrxrxrxcrrke 51
Bảng 4 9: Nơng độ một số sản phẩm phụ tạo thành trong quá trình lên men chính, sử dụng
dịch nha cĩ nơng độ chất khơ ban đầu 249Bx, mật độ giống cấy thay đổi từ 10 triệu tế bào/mI đến 40 triệu tế bầo/ml - - ¿+ ¿2E SE +8 E+S£ +E+EE#EEEE£EEEEE+EEEESEEEkekrxrxrxcrrke 52 Bảng 4 10: Nồng độ một số sản phẩm phụ tạo thành trong quá trình lên men chính, sử dụng dịch nha cĩ nơng độ chất khơ ban đầu 249Bx, mật độ giống cấy thay đổi từ 10 triệu tế bào/ml đến 40 triệu tế bào/mI, kết quả phân tích được quy đổi thành bia non 5% độ cồn
52
Bảng 4 I1: Nồng độ một số sản phẩm phụ tạo thành trong quá trình lên men chính, sử dụng dịch nha cĩ nơng độ chất khơ ban đầu 249Bx, mật độ giống cấy thay đổi từ 10 triệu tế bào/ml đến 40 triệu tế bào/mI 53
Bảng 4 12: Một vài thơng số lên men chính dịch nha 24Bx, sử dụng mật độ giống cấy từ
10 — 40 triệu tế bào/mIl, độ lên men 75 Ø6 .-¿ + +28 +8 SE++E£E+E+E#EEEEE#EzE+E+E£E£EEexzezxrecz 53
Bảng 4 13: Sự biến đổi mật độ nấm men trong quá trình lên men chính, sử dụng dịch nha
cĩ nơng độ chất khơ ban đầu 24°Bx, mật độ giống cấy 10 triệu tế bào/mIl, thời gian sục
khi thay G61 ti? O— 20R nh Ề 4 55
Trang 13Bảng 4 14: Sự biến đổi nổng độ đường khử trong quá trình lên men chính, sử dụng dịch nha cĩ nồng độ chất khơ ban đâu 249Bx, mật độ giống cấy 10 triệu tế bào/ml, thời gian
sục khí thay đổi từ Ư — 20Hh 2: 25+ S222 223 SE 2E2EEEY21211232121171121121111212111111 2 xe 57 Bảng 4 15: Tốc độ trung bình sử dụng đường khử trong quá trình lên men chính, sử dụng
dịch nha cĩ nồng độ chất khơ ban đâu 24°Bx, mật độ giống cấy 10 triệu tế bao/ml, thời
gian sục khí thay đổi từ 0 — 20h 57
Bảng 4 16: Sự biến đổi nồng độ FAN trong quá trình lên men chính, sử dụng dịch nha cĩ
nơng độ chất khơ ban đầu 24”Bx, mật độ giống cấy 10 triệu tế bào/mI, thời gian sục khí thay G6: th O 0U 59
Bảng 4 17: Sự biến đổi nồng độ ethanol sinh ra trong quá trình lên men chính, sử dụng
dịch nha cĩ nơng độ chất khơ ban đầu 24°Bx, mật độ giống cấy 10 triệu tế bào/ml, thời E0108114/ 00 000 n0 v0 06 ad 61
Bảng 4 18: Sự thay đổi tốc độ trung bình sinh ethanol trong dịch lên men khi lên men chính dịch nha cĩ nồng độ chất khơ ban đầu 24°Bx, với các thời gian sục khí khác nhau.6I Bảng 4 19: Sự biến đổi pH trong quá trình lên men chính, sử dụng dịch nha cĩ nổng độ
chất khơ ban đầu 24Bx, mật độ giống cấy 10 triệu tế bào/mI, thời gian sục khí thay đổi từ 0 — 20h 62
Bảng 4 20: Sự biến đổi nơng độ diacetyl tao thành trong quá trình lên men chính, sử dụng
dịch nha cĩ nồng độ chất khơ ban đâu 24°Bx, mật độ giống cấy 10 triệu tế bào/ml, thời gian sục khí thay đổi từ 0 — 20h 64 Bảng 4 21: Nồng độ một số sản phẩm phụ tạo thành trong quá trình lên men chính, sử dụng dịch nha cĩ nồng độ chất khơ ban đầu 24°Bx, mật độ giống cấy 10 triệu té bao/ml, thời gian sục khí thay đổi từ Ư — 20H - 2-6 2 ©ESESE+S2E£EEEEEE2EEEEEEEEEEEEEkrEerkrkrrrrkrrres 65
Bảng 4 22: Nơng độ một số sản phẩm phụ tạo thành trong quá trình lên men chính, sử
dụng dịch nha cĩ nồng độ chất khơ ban đầu 24°Bx, mật độ giống cấy 10 triệu tế bào/ml,
thời gian sục khí thay đổi từ 0 - 20h, kết quả phân tích được quy đổi về bia non 5% độ
cổn 65
Bảng 4 23: Một vài thơng số lên men chính dịch nha 24°Bx với thời gian sục khí thay đổi
Trang 14TOM TAT LUAN VAN
Hiện nay, bia là một trong những loại thức uống phổ biến trên thế giới Để
đáp ứng nhu câu sử dụng bia ngày càng gia tăng, các nhà máy sản xuất bia cĩ thể sử dụng nhiều giải pháp kĩ thuật khác nhau Giải pháp triển vọng nhất là sử dụng kĩ
thuật lên men bia nơng độ cao Tuy nhiên việc sử dung nấm men tự do để lên men
bia nơng độ cao cĩ khà nhiều nhược điểm Để khắc phục những nhược điểm của
việc sử dụng nấm men tự do, nhiều nghiên cứu sử dụng nấm men cố định trong sản
xuất bia đã được thực hiện và thu được các kết quả đáng chú ý
Trong nghiên cứu này, chúng tơi khảo sát ảnh hưởng của mật độ giống cấy ban đầu và hàm lượng oxi hịa tan ban đầu trong dịch nha đến động học quá trình
sinh trưởng của nấm men cố định trong gel alginate, quá trình sử dụng cơ chất
đường khử, nitơ amin và quá trình hình thành một số sẩn phẩm trao đổi chất của vi
sinh vật Trong nghiên cứu này chúng tơi sử dụng chất mang alginate — là một chế
phẩm được sản xuất trong nước từ lồi tảo nâu phát triển tại vùng biển miễn trung
Trang 15CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
Như chúng ta đã biết, bia là một trong những sản phẩm lên men cĩ lịch sử lâu
đời nhất Theo các tài liệu cổ, bia cĩ xuất xứ từ Ai Cập vào khoảng thế kỷ thứ 6
trước Cơng nguyên Hiện nay, bia đã trở thành một trong những loại thức uống phổ
biến trên thế giới
Để đáp ứng nhu cầu sử dụng bia ngày càng gia tăng, các nhà may san xuất
bia cĩ thể sử dụng nhiễu giải pháp kĩ thuật khác nhau Giải pháp triển vọng nhất là
sử dụng kĩ thuật lên men bia nồng độ cao Thơng thường dịch nha trong quá trình lên men bia cĩ nơng độ chất khơ 10 — 12°Bal Người ta sẽ thực hiện quá trình lên
men dịch nha với nơng độ chất khơ cao (16 - 249Bal) để thu được sản phẩm bia
đậm đặc Sau đĩ, bia đậm đặc được pha lỗng với nước rồi bão hịa CO; để tạo ra
bia thành phẩm Kĩ thuật lên men bia nồng độ cao đã mang lại nhiều ưu điểm:
— Tăng năng suất của nhà máy bia mà khơng cân đầu tư thêm nhiều thiết bị — Cải thiện một số chỉ tiêu của sản phẩm như: độ trong, độ bển keo của sẩn
phẩm
— Cải thiện chỉ tiêu vi sinh của bán thánh phẩm bia non — Tang tỉ lệ thế liệu, giúp giảm giá thành sản phẩm
Vi sinh vật chủ yếu được sử dụng trong quá trình lên men bia là lồi
Saccharomyces cerevisiae Nhitng thanh tuu vé ki thuat di truyén, đột biến và tái tổ
hợp gen đã giúp cho các nhà khoa học tìm được những chủng nấm men mới với
nhiều đặc tính cơng nghệ ưu việt như chịu được áp suất thẩm thấu và nồng độ cồn
cao Tuy nhiên, việc sử dụng nấm men tự do trong quy trình lên men bia nơng độ
cao cĩ khá nhiều nhược điểm như:
Thời gian lên men dài, lượng cơ chất sĩt cao
—_ Khả năng tái sử dụng nấm men rất thấp
Để khắc phục những nhược điểm trên, nhiều nghiên cứu sử dụng nấm men cố định trong sản xuất bia đã được thực hiện Kết quả cho thấy nấm men cố định cĩ nhiều ưu điểm hơn so với nấm men tự do:
Trang 16—_ Hiệu suất sử dụng cơ chất cao, rút ngắn thời gian lên men
— Bảo vệ nấm men trước những tác động bất lợi của mơi trường (áp suất
thẩm thấu cao, nơng độ cơn cao ) nhằm ổn định hoạt tính của nấm men — Nâng cao khả năng tái sử dụng của nấm men
Các nghiên cứu trước đây về ứng dụng nấm men cố định trong quá trình
lên men bia nơng độ cao chủ yếu khảo sát sự ảnh hưởng của nơng độ cơ chất đến hoạt tính trao đổi chất của nấm men cố định và chất lượng bia thành phẩm Trong nghiên cứu này chúng tơi khảo sát ảnh hưởng cửa mật độ giống cấy ban đầu và
hàm lượng oxi hịa tan ban đầu trong dịch nha đến động học quá trình sinh trưởng
của nấm men cố định trong gel alginate, quá trình sử dụng cơ chất đường khử, nitơ
amin và quá trình hình thành một số sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật Trong
nghiên cứu này chúng tơi sử dụng chất mang alginate - là một chế phẩm được sản xuất trong nước từ lồi tảo nâu phát triển tại vùng biển miễn trung của Việt Nam
Trang 17CHUONG 2: TONG QUAN
2.1 CO DINH TE BAO:
2.1.1 Dinh nghia:
Kỹ thuật cố định tế bào được định nghĩa là: “Kỹ thuật bao bọc hoặc định vị các tế bào cịn nguyên vẹn trong một “vùng khơng gian nhất định” nhằm bảo vệ
các hoạt tính xúc tác mong muốn” (Karel và cộng sự, 1985)
Cố định tế bào là sự bắt chước hiện tượng các tế bào vi sinh vật cĩ khả năng
phát triển trên bể mặt hay bên trong cấu trúc của một vài nguyên liệu cĩ trong tự
nhién [38]
Kĩ thuật cố định tế bào bắt đầu được nghiên cứu sâu rộng từ những năm 70 của thế kỉ trước Nhiều chất mang cũng như kĩ thuật mới đã được nghiên cứu và áp dụng nhằm mở rộng và phát triển các ứng dụng của tế bào cố định [39]
2.1.2 So sánh tế bào cố định so với tế bào tự do:
2.1.2.1 Ưu điểm:
e Tạo điều kiện thuận lợi cho việc tách sinh khối ra khỏi mơi trường lên
men, đơn giản hĩa quá trình tách sinh khối và thu sản phẩm lên men [5] e Tang khả năng tái sử dụng của tế bào [5, 13]
e_ Tăng mật độ tế bào sử dụng trong thiết bị lên men [5, 13]
e_ Dễ dàng điều khiển mật độ tế bào trong thiết bị lên men [13]
e Hạn chế sự ảnh hưởng của các vi sinh vật tạp lên tế bào [56]
e_ Thực hiện được quá trình lên men liên tục mà tế bào ít bị rửa trơi [5, 13]
e_ Tăng khả năng chống lại các điều kiện bất lợi của mơi trường lên tế bào
như sự thay đổi về nhiệt độ, pH, áp suất thẩm thấu hay sự xuất hiện các chất ức
chế trong mơi trường lên men [5, 13, 56, 69]
2.1.2.2 Nhược điểm:
e_ Khơng áp dụng cho các quá trình lên men mà sản phẩm thu được là sinh
khối vi sinh vật hay các sản phẩm trao đổi chất nội bào [5, 13]
Trang 18e Sự phát triển sinh khối bên trong chất mang cĩ thể phá hỏng cấu trúc
của nĩ, làm cho các tế bào bị rửa trơi ra khỏi chất mang Khi đĩ việc tách và thu nhận sản phẩm cũng khĩ khăn như quá trình lên men sử dụng tế bào tự do [39]
e Một số chất mang và phương pháp cố định cĩ thể làm ảnh hưởng đến
hoạt tính của tế bào [5, 39]
e_ Cấu trúc của chất mang cĩ thể ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất của
tế bào với mơi trường [5, 39]
e Chi phí của việc sử dụng chất mang cũng như phương pháp cố định sẽ ảnh hưởng đến giá thành sản phẩm([7]
Như vậy, ưu điểm nổi bật của kĩ thuật cố định là giúp cho tế bào giữ được hoạt tính sinh học ổn định trong thời gian dài, tế bào cố định phù hợp cơng nghệ
lên men liên tục, khẩ năng tái sử dụng của tế bào cố định cao hơn so với tế bào tự
do Ngày này, việc ứng dụng tế bào cố định trong cơng nghiệp ngày càng mở rộng
và thu được hiệu quả cao [5, 13, 39] 2.1.3 Các kĩ thuật cố định tế bào:
Để thu được hiệu quả cao nhất khi sử dụng tế bào cố định, ngồi việc lựa
chọn giống vi sinh vật và chất mang, chúng ta cịn phải lựa chọn kĩ thuật cố định phù hợp cho từng loại tế bào tùy theo mục đích sử dụng Mỗi kĩ thuật cố định đều
cĩ ưu nhược điểm riêng và chỉ phù hợp cho một số lồi vi sinh vật cũng như một số
mục đích sử dụng Dựa vào tương tác giữa tế bào và chất mang, các kĩ thuật cố
định tế bào cĩ thể chia làm 4 nhĩm chính [41]:
e_ Cố định tế bào lên bể mặt chất mang rắn (carrier — binding)
e Nhét té bao trong cau tric gel (entrapment) e Két bong té bao (aggregation)
e Vi bao té bao (microencapsulation)
Khi lựa chọn phương pháp cố định tế bào cần xem xét một số yêu cầu sau: e_ Khơng gây ảnh hưởng bất lợi đến hoạt tính tế bào
e_ Đảm bảo được hiệu quả kinh tế
Trang 19e Kithuat cé dinh don gidn dé thuc hién va tfng dung vao san xuat quy m6
(A1) (A2 (A3
WOM , Sa? OO@Q@ Tế bào hấp phụ trên bể mặt Tế bào liên kết tĩnh điện Tế bào liên kết đồng hĩa trị (B) «ch (C2) QO CSD NPY L CS
Tế bào kết bơng nhân tạo Nhốt tế bào bên trong Tế bào kết bơng tự :
cấu trúc øel nhiên (liên kết ngang) (D1) (D2) (D3) gor Su e - :mmmmmmm.mmnn SSS: CS * G) = ® @ @) @) + @ - * @© tmeeee eee eee *ane* Vi bao tế bào bằng Vi bao tế bào bằng Chặn tế bào giữa hai màng lỏng polvmer bán thấm màng membrane
SS WWW Chait mang khong tan x ế Bà ^ Als A.CO DINH TE BAO TREN BE MAT
CT Oo pha tang I D
Giá ất mang xốp - CHẤT MANG RẮN x < ` x
m.m.m.m.mm B.NHĨT TE BẢO TRONG CÂU Membrane „ TRÚC GEL Tác nhân liên kết ngang C.KẾT BƠNG TẾ BÀO s2 Ta 3 Lực tĩnh điện D.VIBAO TE BAO Hình 2 1: Các phương pháp cố định tế bào [41]
2.1.3.1 Kĩ thuật cố đỉnh tế bào trên chất mang rắn (carrier — binding)
Quá trình cố định tế bào trên chất mang rắn thực chất là sự hấp phụ vật lý thơng qua các liên kết ion, tĩnh điện, liên kết đồng hố trị hoặc liên kết đặc trưng giữa tế bào và chất mang Chiểu dày của lớp tế bào hấp phụ thường rất mỏng vào
khoảng Imm và giảm dần trong quá trình lên men [41]
Các chất mang cĩ thể sử dụng là các polysaccharide cĩ nguồn gốc tự nhiên
(DEAE-cellulose, gỗ, mùn cưa, dextran ), polysaccharide tổng hợp (các dẫn xuất
của polystyrene, polyurethane ) hay các hợp chất vơ cơ (ceramic, thuỷ tinh xốp,
Trang 20silicate ) Các chất mang này cĩ thể được sử dụng ngay hoặc xử lý với hố chất nhằm làm tăng khả năng hấp phụ của chúng [41]
s* Ưu điểm: Tế bào dễ dàng tiếp xúc với cơ chất do nằm trên bể mặt của chất mang Vì thế, quá trình trao đổi chất của tế bào ít bị ảnh hưởng Bên cạnh đĩ, liên kết giữa tế bào và chất mang khá bền vững (đối với liên kết đồng hĩa tri) [41]
s* Nhược điểm: Đối với liên kết ion hay lực hấp phụ vật lý, liên kết giữa tế bào và chất mang khơng bền, các tế bào dễ bị rửa trơi Vì vậy, hiệu suất cố định tế bào thấp, khoảng 40 — 60% Mặt khác, khả năng bảo vệ tế bào trước những điều kiện bất lợi của mơi trường xung quanh thấp do tế bào được cố định trên bể mặt chat mang [16]
2.1.3.2 Kĩ thuật nhốt tế bào trong cấu trúc gel (entrapment):
Kĩ thuật nhốt tế bào trong cấu trúc gel là quá trình bao bọc tế bào vào trong cấu trúc gel nhằm ngăn cần tế bào khuếch tán ra mơi trường xung quanh nhưng vẫn cho phép tế bào trao đổi chất với mơi trường xung quanh Hình dạng của chất mang
thường là các hạt gel hình cầu cĩ đường kính từ 0.3-5mm [16]
Các loại chất mang thường sử dụng trong kĩ thuật này chủ yếu là các chất
mang cĩ nguồn gốc hữu cơ như polysaccharide (alginate, K-carrageenan, agar, pectin ), protein (gelatin, collagen ) hay polymer tổng hợp (polyvinyl alcohol, polyacrylamide ) Trong đĩ, alginate là chất mang được sử dụng phổ biến trong ngành cơng nghệ lên men thực phẩm
Quá trình trao đổi chất giữa mơi trường bên trong và bên ngồi hạt gel được thực hiện do sự chênh lệch nồng độ cơ chất ở bên trong và bên ngồi hạt gel và
quá trình này phụ thuộc vào kích thước, độ chặt của hạt gel, mật độ tế bào bên
trong hạt gel và mật độ hạt gel trong mơi trường lên men [ 16]
s* Ưu điểm: Đây là phương pháp cố định đơn giản, dễ tối ưu hĩa quy trình cố định, chi phi cố định thấp, hạt gel cĩ độ bển cao và cĩ thể chứa được mật độ tế bào rất cao Mặt khác, hạt gel bảo vệ tế bào cố định trước những điều kiện bất lợi của
mơi trường (sự thay đổi nhiệt độ, pH ) Bên cạnh đĩ, việc tối ưu hĩa điều kiện lên
men cũng như điều khiển quá trình cĩ thể thực hiện đễ dàng [15]
s* Nhược điểm: Tế bào cĩ thể phát triển trên bể mặt hạt gel và giải phĩng
khỏi thể hạt, làm cho mơi trường lên men chứa hỗn hợp tế bào tự do và tế bào cố
Trang 21định Nơng độ cơ chất và các sản phẩm tại bể mặt hạt gel và tâm hạt cĩ sự khác
nhau Do đĩ hoạt tính và các đặc điểm sinh lý của tế bào tại các vị trí trong hạt gel
cũng khác nhau Mặt khác, khí CO; sinh ra do quá trình lên men cĩ thể làm nứt vỡ
hat gel [16, 41]
2.1.3.3 Kĩ thuật kết bơng té bao (aggregation) [16]:
Một số lồi vi sinh vật như nấm men cĩ khả năng tự kết lại với nhau thành một khối (kết bơng) Ta cĩ thể sử dụng hiện tượng này như một phương pháp cố
định đơn giản và rẻ tiền Mặt khác ta cĩ thể thay đổi điều kiện mơi trường (pH, nhiệt độ ) hay sử dụng một số tác nhân hĩa học như glutaraldehyde, diisocyanate
nhằm kết nối các tế bào với nhau thành những khối hạt Tuy nhiên phương pháp
này ít được áp dụng trong thực tế vì cĩ khá nhiều nhược điểm: việc điều khiển quá
trình cố định hết sức phức tạp và tốn kém, các tác nhân hố học dùng để kết bơng
cĩ thể gây hại cho sức khoẻ người tiêu dùng nên ít được áp dụng trong ngành cơng
nghệ thực phẩm Mặt khác các tác nhân hố học này gay can trở cho việc trao đổi
chất của các tế bào ở tâm khối hạt
2.1.3.4 Kĩ thuật vi bao (microencapsulation) [41]: Kĩ thuật vi bao gồm cĩ: e Sử dụng bao vi thể (micorencapsulte type): tế bào được nhốt trong các bao vi thể bằng các polimer bán thấm e Kiểu lipoxome: tế bào được nhốt trong màng lỏng từ các chất mang cĩ tính lưỡng cực (amphiphatic)
e Sử dụng membrane: tế bào được nhốt bằng màng vi lọc hay siêu lọc
Phương pháp này thường được sử dụng để liên tục tách sản phẩm ra khỏi tế
bào Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là sự vận chuyển các chất cĩ
phân tử lượng lớn qua màng cĩ thể bị tắc nghẽn
2.1.3.5 Yêu cầu lựa chọn chất mang [19,40,55,70]:
Khi lựa chọn chất mang cố định tế bào, cần xem xét các yêu cầu sau:
e Kha năng và hiệu quả cố định tế bào cao, giá thành hợp lý, dễ sử dụng
và tái sinh
Trang 22¢ D6 bén cơ, dO bén héa va dO bén sinh hoc cao Dién tich bé mat chat mang lớn, cấu trúc xốp, đơng nhất, tạo điều kiện thuận lợi cho việc trao đổi chất của tế bào cố định Mặt khác, chất mang phải khơng độc và khơng ảnh hưởng đến
hương vị cũng như chất lượng của sản phẩm
e Giữ được khả năng sống sĩt và hoạt tính tế bào trong thời gian dài
2.2 cố ĐỊNH NẤM MEN TRONG GEL ALGINATE:
2.2.1 Nấm men bia:
Nấm men là vi sinh vật cĩ nhiều ứng dụng trong sản xuất thực phẩm, đặc biệt
là trong sản xuất thức uống lên men như bia, rượu vang Trong quá trình lên men
bia, bên cạnh các sản phẩm chính là ethanol và CO;, nấm men cịn tạo thành nhiều
sản phẩm phụ như các acid hữu cơ, các rượu bậc cao, aldehyde và ester Những sản
phẩm phụ này gĩp phần ảnh hưởng đến hương vị chất lượng của biab [1, 2, 4]
s* Phân loại [1]:
Trong ngành sắn xuất bia, các giống nấm men bia được chia thành 2 nhĩm:
e_ Nhĩm nấm men nổi cĩ các đặc tính:
— Nhiệt độ lên men khoảng 14 — 25°C
— Khi kết thúc quá trình lên men, các tế bào nấm men nổi lên bể mặt
dịch lên men và khơng thể thu hồi để tái sử dụng cho mẻ lên men tiếp theo
— Lên men 1/3 đường tam raffinose
e_ Nhĩm nấm men chìm cĩ các đặc tính:
— Nhiệt độ lên men khoảng 6 — 120C
—_ Khi kết thúc quá trình lên men, các tế bào kết chùm và lắng xuống đáy thùng lên men Các nhà sản xuất sẽ thu hồi sinh khối, xử lý và tái sử dụng cho mẻ lên men kế tiếp
— Cĩ khả năng lên men tồn bộ đường raffinose
s* Cấu tạo tế bào: Søccharomyces cerevisiae là lồi vi sinh vật đơn bào thuộc nhĩm Eukariote Tế bào thường cĩ hình cầu hay hình oval, đường kính tế bào khoảng 5-10um Hình thức sinh sản chủ yếu là phương pháp nảy chổi [2]
Trang 23s* Thành phần hố học cửa tế bào nấm men: Thanh phần hố học cửa tế bào
nấm men phụ thuộc vào chủng nấm men, trạng thái sinh lý mơi trường cũng như
điểu kiện nuơi cấy Trung bình tế bào nấm men chứa 75% nước và 25% chất khơ Thành phần chất khơ của nấm men gồm: 30-50% protein, 24-40% glucid, 2-5%
lipid, 5-11% khống [2]
s* Tổng hợp năng lương ở nấm men: Søccharomyces cerevisiae là lồi vỉ sinh vật kị khí tuỳ tiện Chúng cĩ khả năng phát triển ở mơi trường cĩ hay khơng cĩ oxi
Sự sinh trưởng của nấm men trong điều kiện hiếu khí nhanh mà mạnh hơn [2] Ở điều kiện hiếu khí, Saccharomyces cerevisiae tổng hợp năng lượng theo con đường hơ hấp hiếu khí, biến đường maltose cĩ trong dịch nha thành CO; và H;O và tăng sinh khối
Ở điều kiện ki khi, Saccharomyces cerevisiae tổng hợp năng lượng bằng
con đường lên men ethanol Quá trình lên men cồn được bắt đầu bằng chu trình đường phân, chuyển hĩa một phân tử đường maltose thành 4 phân tử ethanol 4
phân tử CO; và 4 ATP (Hình 2.3) H— —ệ~on _ Cụ 2 Ethanol 2 Acetylaldehyde 2 NAD* 2 NADH 2CO; Glucose ———— | _
2 ADP 2 ATP 2 Pyruvate
Hình 2 2: Quá trình lên men ethanol [2]
2.2.2 Alginate [6, 7, 26, 37, 44]:
Alginate cĩ nhiễu trong thiên nhiên và được thu nhận từ nhiều nguồn gốc khác nhau Alginate cĩ trong thành phần cấu trúc của tảo nâu (Phaeophyceae),
chiếm đến 40% khối lượng chất khơ Alginate cũng là polysaccharide trong màng
bao nhây một số loại vi khuẩn Tuy nhiên, các loại alginate thương mại hiện nay
Trang 24déu c6 nguén géc tit tio nau va dude sit dung dudi dang mudi sodium, potassium,
amonium hay calcium cia acid alginic [26, 36, 44]
Acid alginic 18 mét copolymer khơng phân nhánh, bao gdm cdc monomer B-
D-mannuronic acid (gọi tắt là M) và ơ-L-guluronic acid (G) liên kết với nhau thơng
qua liên kết 1,4 - glucoside Các monomer này phân bố trong mach alginic theo
các block (Hình 2.5) [26]
e_ BlockM: gồm các gốc acid mannuronic nối tiếp nhau
e_ Block G: gồm các gốc acid guluronic nối tiếp nhau
¢ _ Block MG: gồm các gốc acid mannuronic và acid guluronic luân phiên nối với nhau
Acid alginic thu được từ các loại tảo khác nhau thì cĩ các tính chất khác nhau
chủ yếu là đo tỉ lệ M/G và trật tự sắp xếp các block trong phân tử Sự khác nhau về
tỉ tệ M/G của acid alginic thu được từ các loại tảo khác nhau được biểu diễn qua bảng 2.1
QOH COOH
H
B- D- Mannuronic Aeid tư -L- Guluronie Aeid
Trang 25Bang 2 1: Ti lệ M/G của một số chế phẩm acid alginic [26] Acid alginic từ Tỉ lệ M/G Ascophyllum rodosum 1,85 Eckloniacava 2,64 - 3,08° Laminaria digitata 0,62 Laminaria hyperborea 1,28 Laminaria japonica 2,26 Macrocystis pyrifera 1,56 Undaria pinnatifida 1,45 — 2,65°
b: mẫu acid alginic thương mại
c: khoảng thay đổi của tỉ số M/G trong một năm
2.2.3 Cơ chế tạo gel:
Alginate thường được sản xuất dưới dạng các dẫn xuất của muối tan như
sodium alginate, potassium alginate Khi các muối này được cho tiếp xúc với các
ion kim loại đa hĩa trị như Ca?*, Zn””, PbỶ” các ion kim loại đa hĩa trị sẽ thay thế
các ion ban đầu trong phân tử alginate hình thành liên kết ngang giữa các lớp trong cấu trúc mạng phân tử alginate và tạo thành cấu trúc gel Khả năng tạo gel của alginate với các ion kim loại đa hĩa trị giảm dần theo trình tự: Pb”', Cu”, Cd”,
Ba”, Sr”, Ca”*, Co”* Acid gulurunie được ưu tiên liên kết với các ion đa hố trị
bằng liên kết ion (Hình 2.6) Trong ngành cơng nghệ thực phẩm, ion Ca?” được sử
dụng làm tác nhân tạo gel alginate vì hầu hết ion cịn lại cĩ thể ảnh hưởng khơng
tốt đến sức khoẻ của người sử dụng và cĩ khả năng gây độc cho nấm men [6,7]
Cĩ hai phương pháp tạo gel alginate là phương pháp tạo gel khuếch tán (difussion gelation) và phương pháp tạo gel nội (internal gelation)
2.2.3.1 Phương pháp tạo gel khuếch tán: (diffusion gelation)
s* Nguyên tắc: khuếch tán các ion Ca”” từ bên ngồi vào trong dung dịch
alginate Cac ion Ca”* sẽ thay thế các ion kim loại ban đâu trong muối alginate và
tạo thành các liên kết ngang, hình thành cấu trúc khơng gian cho mạng gel [26] “+ Phuong pháp thực hiện: đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi trong ki
thuật cố định tế bào Hỗn hợp dung dịch alginate trong nước và huyền phù nấm
Trang 26men được nhỏ giọt vào dung dịch chứa ion Ca”” thường là CaCl; để tạo thành các
hạt gel Ca-alginate cĩ chứa nấm men bên trong (Hình 2.7) [5,68]
Quá trình tạo gel bắt đầu từ bể mặt ngồi cửa giọt alginate Khi tiếp xúc với
ion Ca” trong dung dịch, bỀ mặt ngồi của giọt alginate lập tức bị gel hố Do gel
alginate cĩ cấu trúc xốp nên các ion Ca”" tiếp tục khuếch tán vào bên trong giọt
alginate làm cho các phân tử alginate bên trong tiếp tục được gel hố Vì sự khuếch tán ion Ca” đi từ bên ngồi hạt gel đến tâm hạt gel nên mật độ alginate trên bể
mặt hạt gel cao hơn nhiễu lần so với tâm hạt Do đĩ tính đơng thể của hạt gel khơng cao [5,25,68] s* Ưu điểm: phương pháp đơn giản dễ thực hiện, khơng tốn thời gian, chỉ phí thấp s* Nhược điểm: tính đồng nhất của hạt gel thấp, hình đạng của hạt gel chỉ cĩ thể là hình cầu
2.2.3.2 Phương pháp tạo gel nội: (internal gelation)
Nguyên tắc: khuếch tán đều ion Ca” ở dạng vơ hoạt trong hỗn hợp dung
dịch alginate trong nước và huyền phù nấm men, sau đĩ hoạt hĩa giải phĩng ra các ion Ca”* Quá trình gel hố diễn ra bên trong hat alginate [5,26]
s* Phương pháp thực hiên: người ta thường sử dụng các muối vơ cơ khơng tan của calcium như CaCO;, CaSO¿, hay một vài muối hữu cơ khơng tan của canxi như
Ca-EDTA, calcium citrate Các muối trên được trộn đều trong hỗn hợp dung dịch
alginate trong nước và huyền phù nấm men Sau đĩ hỗn hợp này cĩ thể được cho vào khuơn để hạt gel cĩ được hình dạng mong muốn [5,26]
Sử dụng một số tác nhân acid hĩa nhu D-glucono-8-lactone (GDL) nhim lam
giảm pH của dung dịch Khi pH giảm, ion Ca” được giải phĩng dân và tham gia vào quá trình tạo gel với alginate [5,26]
s* Ưu điểm: hạt gel cĩ tính đồng nhất cao, độ bến của hạt gel tốt hơn khi tạo gel bằng phương pháp khuếch tán
s* Nhược diểm: Khĩ thực hiện, chi phi cao, tốn nhiều thời gian
Trang 27pein oh
VY AN
Dung dich CaCl»
Hình 2 6: Phương pháp tạo Hình 2 7: Phương pháp tạo gel nội
gel khuếch tán [5] [5] 2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ bền cia gel alginate:
2.2.4.1 Ảnh hưởng của khối lượng phân tử:
Johansen và Flink (1986) đã nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng phân tử
alginate dén d6 bén gel va kha nang lên men của nấm men cố định Kết quả thực nghiệm cho thấy độ bền gel (được đo bằng khả năng chống chịu đối với lực nén
ép) tăng đáng kể khi tăng độ nhớt dung dịch alginate ban đầu từ 5 - 70cP, nhưng khi độ nhớt tăng cao hơn nữa (250 — 600cP) thì độ bền gel tăng rất ít (Ýamagiwa và
cộng sự, 1995; Johansen và Flink, 1986)
2.2.4.2 Anh hưởng của tỉ lệ G/M:
Tỷ lệ G/M là tỉ lệ số gốc của L-guluronic acid so với số gốc D-mannuronic acid trong phân tử alginate Khi tăng tỉ lệ G/M thì độ bền gel tăng vì ion Ca?” ưu
tiên liên kết với block G Do đĩ gel cĩ hàm lượng G cao sẽ khơng bị phơng nở hay
Trang 28co rút, giữ được hình dạng tốt hơn, khả năng tái sử dụng nấm men cố định sẽ cao
hơn và khơng ảnh hưởng đến khả năng khuếch tán glucose vào trong hạt gel [25,35] Tuy nhiên, khi gel cĩ hàm lượng G cao lại cẩn trở sự phát triển của nấm
men (Johansen và Flink, 1986)
2.2.4.3.Ảnh hưởng của nơng độ dung dịch alginate sử dụng để tạo gel:
Yamagiwa và cộng sự, (1995) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ alginate đến độ bền gel và khả năng lên men của nấm men cố định Họ cho rằng độ bén cửa gel tăng khi tăng nồng độ dung dịch alginate sử dụng để tạo gel và nơng độ
alginate thích hợp để cố định nấm men khoảng 2% [81] 2.2.4.4.Anh hưởng của nhiệt độ và pH tạo gel:
Theo Yamagiwa và cộng sự (1995), pH thích hợp của dung dịch alginate cho quá trình tạo gel khoảng 6 - 8 Các phân tử alginate sẽ bị thay đổi hình dạng khi pH của dung dịch nằm ngồi khoảng trên Điều này làm cho độ bền gel giảm Mặt
khác, nhiệt độ thích hợp cho quá trình tạo gel khơng được vượt quá 25°C [81]
2.2.5 Một số đặc điểm của nấm men cé dinh trong gel alginate:
Nấm men cố định trong gel alginate cĩ nhiều điểm khác biệt so với nấm men
tự do
2.2.5.1 Hình thái cấu trúc:
Nấm men cố định trong hạt gel alginate cĩ hình dạng và kích thước khác nhau, phụ thuộc vào khoảng khơng gian bên trong hạt gel, chúng thường cĩ xu hướng kết tụ lại với nhau [43]
Melzoch và cộng sự (1994) và Doran và cộng sự (1985) đã nghiên cứu hình
thái của nấm men cố định trong gel Ca-alginate và nhận thấy rằng các tế bào nấm
men cố định cĩ kích thước đa dạng và hình dạng khơng đơng đều Sự phát triển của
các tế bào nấm men trong hạt gel phụ thuộc vào khoảng khơng gian bên trong hạt, chúng sẽ tận dụng tồn bộ các khoảng trống trong hạt để phát triển tối đa Việc phải chen chúc nhau trong một khoảng khơng gian chật chội như vậy đã tạo nên sự
đa dạng về hình dạng và kích thước của nấm men cố định [25.4346]
Trang 292.2.5.2 Khả năng sinh trưởng:
Đã cĩ nhiều cơng trình nghiên cứu về khả năng sinh trưởng của nấm men cố
định, tuy nhiên các nghiên cứu này chưa đưa ra được một kết luận nhất quán Một
số tác giả khác kết luận tốc độ sinh trưởng của nấm men cố định cao hơn so với nấm men tự do Họ cho rằng chính tác dụng bảo vệ nấm men của chất mang trước những điều kiện bất lợi của mơi trường giúp cho nấm men cố định phát triển mạnh hơn so với nấm men tự do [68] Tuy nhiên, một số tác giả khác lại cho rằng các chất mang đã hạn chế khả năng tiếp xúc của nấm men đối với cơ chất và O;, làm
cho các tế bào bên trong hạt gel bị thiếu dinh dưỡng dẫn đến tốc độ sinh trưởng
giảm [43]
Theo Melzoch và cộng sự (1994) các tế bào nấm men cố định trong gel
alginate sau khi được hoạt hĩa, nếu được nuơi cấy trong mơi trường giàu chất dinh dưỡng thì số lượng tế bào sẽ tăng lên rất nhanh (khoảng 10)” tế bào/mL gel) và sau đĩ hầu như khơng đổi [46]
2.2.5.3 Hoạt tính trao đổi chất:
Galazzo và Bailey (1990) đã sử dụng phương pháp quang phổ cộng hưởng từ
hạt nhân để khảo sát sự biến đổi cơ chất bên trong tế bào của nấm men ty do va
nấm men cố định trong gel alginate trong suốt quá trình chuyển hĩa glucose thành ethanol 6 nhiét d6 20°C Ho da quan sat thay ring su tao thanh ethanol, glycerol
cửa các tế bào nấm men cố định trong gel alginate cũng cao hơn khoảng 2 lần so
với nấm men tự đo vì sự sử dụng glucose và hàm lượng các sản phẩm trung gian của chu trình đường phân (glucose-6-P, fructose-6-P, 3-P-glycerate) ở nấm men cố
định tăng khoảng 2 lần so với nấm men tự do Kết quả được trình bày ở bảng 2.2,
2.3) [31.32]
Bảng 2 2: So sánh tốc độ sử dụng glucose và tốc độ tạo thành ethanol của nấm
Trang 30Bảng 2 3: Su hinh thanh m6t s6 san pham trung gian trong chu trình đường phân
của nấm men tự do va nấm men cé dinh trong gel alginate [31]
pH Ham lugng mMol/L (mM) Tốc độ mMol/ phút
mơi Glucose- Fructose- 3-P- Glucose- Fructose- 3-P-
trường 6-P 6-P Glycerate 6-P 6-P glycerate Nấm men 5,5 1,4 0,8 0,1 14,5 26,7 1,8 tự do 45 0,7 043 0,1 173 32,2 1,9 Nấm men 5,5 44 1,8 4,5 35,1 25 3,7 cOdinh 4.5 3,1 16 L4 38,2 49 3,8
2.2.5.4 Khả năng chịu đựng các yêu tố bật lợi của mơi trường:
s* Ethanol: Nấm men bia tự do khơng chịu được hàm lượng cthanol lớn hơn
9% (v/v), nhưng khi chúng được cố định thì khả năng này tăng lên đáng kể Sau 5
phút tiếp xúc với ethanol 80% (v/v) thì nấm men tự do bị tiêu diệt hồn tồn trong
khi số tế bào sống nấm men cố định vẫn tương tự như ở thời điểm ban đầu
(Desimone và cộng sự, 2002) Mặt khác, theo Nadodawithana va Steinkraus (1976)
nấm men cố định cĩ khả năng giải phĩng ethanol nội bào ra ngồi mơi trường tốt hơn nấm men ty do Vi vay kha năng chịu đựng ethanol của nấm men cố định tốt
hơn nấm men tự do [29]
s* Nhiệt đơ và pH mơi trường: Nấm men cố định cĩ khả năng chịu đựng sự thay đổi của pH và nhiệt độ tốt hơn nấm men tự do
Theo Buzas và cộng sự (1989), nấm men $.cerevisiae nhốt trong gel alginate khơng bị ảnh hưởng bởi pH thấp 2,5 - 3 trong một khoảng thời gian dài Mặt khác,
pH nội bào của nấm men cố định khơng thay đổi trong suốt quá trình lên men,
trong khi đĩ, pH nội bào của nấm men tự do lại cĩ khuynh hướng giảm [18]
s* Ấp suất thẩm thấu của mơi trường: Nấm men cố định cĩ khả năng lên men dịch nha nồng độ cao tốt hơn nấm men tự do Khả năng sống sĩt của nấm men cố
định trong gel alginate trong dung dịch đường glucose 20% là 72% (Krisch và
Szajáni, 1997) Mặt khác, theo Holceberg và Margalith (1981) nấm men cố định
vẫn cĩ khả năng lên men dung dịch đường glucose từ 40 — 50% [42]
Trang 312.2.5.5 Khả năng tạo hương và các sản phẩm phụ của quá trình lên
men:
Hoạt tính trao đổi chất của nấm men, đặc biệt là sự trao đổi acid amin ảnh hưởng đến hương vị và chất lượng bia thành phẩm Acid amin cĩ liên quan mật thiết đến các quá trình sinh tổng hợp các hợp chất hương như diacetyl, ester, các
aldehyde, rượu bậc cao, các acid hữu cơ
Các ester của ethanol và các acid mạch trung bình, cũng như ester cửa acid acetic và rượu bậc cao đĩng vai trị quan trọng trong việc tạo ra hương đặc trưng sản phẩm bia Ngược lại, rượu cao phân tử, aldehyde và diacetyl lại được coi là các
yếu tố gây ảnh hưởng khơng tốt đến mùi vị của sản phẩm [78]
s* Rượu bậc cao:
Cĩ nhiều cơng trình nghiên về hàm lượng rượu bậc cao sinh ra trong quá trình
lên men chính Mặc dù các kết quả thu được chưa nhất quán nhưng các tác giả đều cho rằng hàm lượng rượu bậc cao tùy thuộc vào mức độ phát triển của tế bào nấm
men cũng như khả năng sử dụng FAN của nấm men Valine, isoleucine và leucine
cĩ ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình sinh tổng hợp các hợp chất hương như
isobutanol, amyl alcohol và iso-amyl alcohol Do tác dụng bảo vệ của alginate trước sự thay đổi của nhiệt độ, áp suất thẩm thấu và lượng ethanol nên hàm lượng
một số loại rượu bậc cao sinh ra khi lên men bằng nấm men cố định cao hơn nấm
men tu’ do (Sablayroles va Ball, 1995; Masschelein va cộng sự, 1985; Smogrovicová và Domeny, 1999) (bảng 2.4)
Trang 32+ Ester:
Các hợp chất ester tao hudng chinh trong bia g6m cé: ethyl acetate (hudng trái cây), isoamyl acetate (hương chuối), ethyl caproate và ethylcaprilate (hương táo), 2-phenylethyl acetate (hương mật ong) Tuy nhiên các ester trên chỉ cĩ tác dụng
tạo hương cho bia ở nơng độ thấp, chúng gây mùi khĩ chịu khi nồng độ quá cao
(Meilgaard, 1975 va Peddie, 1990) Các ester chủ yếu được tế bào nấm men sinh tổng hợp trong pha logarite (60%) và một phần ở pha ổn định (40%)
Masschelein và cộng sự (1985) cho rằng khả năng sinh tổng hợp các ester của
nấm men cố định cao hơn nấm men tự do (Bảng 2.5) Tác giả cho rằng, hàm lượng
O; hịa tan cĩ trong dịch nha cĩ ảnh hưởng quyết định đến khả năng sinh tổng hợp
cấu tử hương của nấm men vì O; ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh trưởng của tế
bào cũng như khả năng sinh tổng hợp các acid béo, qua đĩ ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp các ester của các acid béo Mặt khác, khả năng tổng hợp ester
của nấm men cố định cịn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như chủng nấm men sử dụng, mật độ giống cấy, tốc độ sinh trưởng riêng, nhiệt độ áp suất, nguồn nitơ và nguồn
carbon (Hammond, 1993) và Calderbank và Hammond, 1994)
Bang 2 5: Lượng ethyl acetate và iso-amyl acetate trong bia non lên men bằng
nấm men cố định trong gel alginate và nấm men tự do Ester (mg/L) Nấm men cố định trong gel alginate Nấm men tự do Ethyl acetate 18,8 15,2 Tso-amyl acetate 1,25 0,85 “= Diacetyl:
Vicinal diketones (VDK) 1a san pham phụ của chu trình Iso-leucine, leucine,
valine Trong bia, hai hợp chất quan trọng nhất của VDK là diacetyl (2,3-
butanedione) và 2,3-pentanedione (hình 2.9) [78]
Wainwright (1973) cho ring diacetyl 1A san phẩm phụ của quá trình phân hủy
isoleucine, leucine, valine Sau đĩ, tế bào phân huỷ chúng thành acetoin và cuối
cùng thành 2,3-butanediol [77] Diacetyl khơng ảnh hưởng tích cực đến hương vị của bia Do đĩ hàm lượng diacetyl trong sẩn phẩm bia phải thấp Diacetyl được hình thành trong suốt quá trình lên men chính và phần lớn bị phân huỷ trong quá
Trang 33Jones và Pierce (1964) các yếu tố kích thích quá trình sinh trưởng của nấm men cũng như sự cĩ mặt cửa các acid amin làm tăng lượng diacetyl
Willaert và Nedovic (2006) cho rằng tế bào nấm men cố định cĩ khả năng
tổng hợp diacetyl cao hơn các tế bào tự do Họ đã tiến hành thí nghiệm với các chất
mang khác nhau (bảng 2.6) Các tác giả cho rằng hàm lượng enzyme acetohydroxy
acid synthetase trong tế bào cố định cao hơn trong tế bào tự do [78]
Hình 2 8: Con đường hình thành va phân huỷ diacetyl [78]
Bảng 2 6: Hàm lượng diacetyl trong bia non của nấm men tự do và nấm men cố
định trong gel Ca — alginate [78] Nấm men cố định Nấm men tự do Diacetyl (mg/L) 0,7 0,4 2.3 UNG DUNG NAM MEN cố ĐỊNH TRONG LÊN MEN BIA NONG ĐỘ CAO:
2.3.1 Khái niệm lên men bia nơng độ cao:
Lên men bia nơng độ cao là quá trình lên men dịch nha cĩ nồng độ chất khơ
cao hơn thơng thường (trung bình khoảng 16 — 18°P), sau đĩ sản phẩm tạo thành
(cĩ độ cơn cao) sẽ được pha lỗng để tạo ra bia thành phẩm cĩ độ cơn như bia được lên men từ dịch nha cĩ nơng độ chất khơ thơng thường (10 — 12°P)
Trang 342.3.2 Quy trình cơng nghệ sản xuất bia sử dụng phương pháp lên men
bia nơng độ cao:
Trang 35s* Thuyết minh quy trình: Nhìn chung quy trình cơng nghệ sản xuất bia bằng
phương pháp lên men bia nơng độ cao cũng tương tự như quy trình sản xuất bia
truyền thống Tuy nhiên, cĩ một số điểm khác biệt sau:
— Dịch nha ban đầu cĩ nơng độ chất khơ cao hơn so với dịch nha sử dụng trong phương pháp lên men truyền thống Dịch nha thu được từ quá trình nấu dịch
nha thường cĩ hàm lượng chất khơ khoảng 10-12PP Để thu được dịch nha cĩ nồng
độ chất khơ cao, ta cĩ một số giải pháp như: giảm lượng nước sử dụng trong quá
trình nấu dịch nha (nước phối trộn nguyên liệu, nước rửa bã malt ), bổ sung thêm
đường glucose, maltose hay saccharose và trong dịch nha trước khi lên men hay cơ
đặc dịch nha trước khi lên men
Tuy nhiên, đối với phương pháp giảm lượng nước để nấu dịch nha, chúng ta chỉ cĩ thể thu được dịch nha với nơng độ chất khơ khoảng 16-18°Bal Khi giảm lượng nước sử dụng trong quá trình nấu, hiệu suất trích ly các chất cĩ trong hạt malt
vào trong nước cũng giảm Do đĩ khi cần dịch nha cĩ hàm lượng chất khơ cao, các
nhà sản xuất thường bổ sung đường hay cơ đặc dịch nha ban đầu
Sau quá trình lên men phụ, ta sẽ thu được dịch lên men cĩ hàm lượng cồn và
các thành phần khác cao hơn bia thành phẩm được sản xuất theo phương pháp lên
men truyền thống Vì vậy, ta cần pha lỗng dịch lên men với nước rồi bão hồ CO;
để thu được sản phẩm bia cĩ nơng độ cồn và các sản phẩm trao đổi chất khác với
nơng độ thích hợp
Tiêu chuẩn nước dùng để pha lỗng là: Trong suốt, khơng màu, khơng mùi,
khơng chứa tạp chất và các vi sinh vật Nước phải loại được khơng khí, oxi hồ tan tối đa là 0,05 ppm Mặt khác, nước phải cĩ các thành phần khống và pH thích hợp
để khơng ảnh hưởng đến độ bên keo của bia sau khi pha lỗng [15]
2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men bia nồng độ cao sử
dụng nấm men cố định trong gel alginate:
2.3.3.1 Chủng nấm men sử dụng:
Để thu được loại bia thành phẩm cĩ chất lượng tốt, yếu tố then chốt đầu tiên
là chủng nấm men sử dụng Việc lựa chọn một chủng nấm men phù hợp cho điều
kiện sản xuất cụ thể là tiền để cho sự thành cơng trong cơng nghệ sản xuất bia
Trang 36Đặc điểm của lên men bia nồng độ cao là cĩ áp suất thẩm thấu của dịch nha
ban đầu cao và hàm lượng ethanol cao trong dịch lên men làm ảnh hưởng đến khả
năng trao đổi chất của nấm men Mặt khác, hàm lượng cơ chất trong dịch lên men
của lên men bia nơng độ cao lớn hơn so với lên men truyền thống, do đĩ chủng
nấm men sử dụng phải cĩ hoạt lực tốt để tránh việc kéo dài thời gian lên men và
lượng cơ chất sĩt quá lớn trong bia non Chính vì vậy, yêu cầu khi lựa chọn nấm men sử dụng trong lên men bia nồng độ cao phải chịu được áp suất thẩm thấu và
hàm lượng ethanol cao, cĩ hoạt lực lên men tốt
2.3.4.2 Mật độ tế bào nấm men gieo cấy
Bên cạnh việc lựa chọn chủng nấm men thích hợp, mật độ giống cấy cũng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm bia Mật độ giống cấy ban đầu ảnh hưởng đến thời gian và hiệu suất lên men Mặt khác, mật độ giống
cấy cịn ảnh hưởng đến thành phần và tỉ lệ các sản phẩm của quá trình lên men
Đến nay, chưa cĩ một cơng trình nghiên cứu nào được cơng bố về mật độ
giống cấy nấm men cố định trong lên men bia nồng độ cao Chính vì vậy, việc xác định mật độ giống cấy nấm men cố định phù hợp để tối ưu hĩa quy trình lên men bia nồng độ cao sử dụng nấm men cố định đã trở thành một vấn để cấp thiết Đối
với nấm men tự do, khi tăng mật độ giống cấy thay đổi từ 10”— 10” tế bào/ml thì
mật độ tế bào trong Iml dịch lên men khi kết thúc quá trình lên men chính khơng
cĩ sự khác biệt (Huseyin và cộng sự, 2007), Mặt khác, khi tăng mật độ giống cấy
thì tốc độ lên men tăng, hàm lượng cơ chất sĩt giảm (Youssef và cộng sự, 1989) Bên cạnh đĩ, khi tăng mật độ giống cấy thì hàm lượng các sản phẩm phụ của quá trình lên men cũng giảm (Huseyin và cộng sự, 2007) Khi tăng mật độ giống cấy từ 10 — 20.10 tế bào/mIl dịch nha thì hàm lượng diacetyl giảm từ 0,45 mg/l xuống cịn 0,32 mg/1, các sản phẩm phụ khác như aldehyde, ester cũng giảm (Kurger, 1998 và Van Den Berg và cộng sự, 1983)
2.3.3.3 Nơng độ dịch nha:
Nấm men cố định chịu áp suất thẩm thấu tốt hơn nấm men tự do Khả năng
sống sĩt và hoạt tính của nấm men S.cerevisiae trong gel Ca-alginate khá ổn định và chỉ giảm khoảng 20% sau khi lên men hơn 1,5 tháng (Melzoch và cộng sự,
1994)
Trang 37Pratt và cộng sự (2000) cho rằng khi tăng áp suất thẩm thấu thì hoạt tính của tế bào và độ lên men đều giảm Sự thay đổi hình thái của nấm men tự do khi chịu
tác động của áp suất thẩm thấu trong dung dịch đường sorbitol 20%w/v được trinh bày trên hình 2.11 Khi khảo sát quá trình lên men dịch nha cĩ nơng độ thay đổi từ
12 - 30% (w/v) sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate thì nấm men cố định rút ngắn thời gian lên men chính 50% so với nấm men tự do
(bảng 2.8).Mặt khác, tốc độ sinh ethanol đạt cực đại ở nồng độ dịch nha 24% (w/v)
(bảng 2.9) Nguyên nhân do cấu trúc mạng gel đã giảm bớt một phần áp suất thẩm thấu tác động lên tế bào cố định Chính vì vậy, hoạt tính của nấm men cố định
trong gel alginate vẫn khơng bị ảnh hưởng khi lên men dịch nha cĩ nồng độ đến
24% (Patkova và cộng sự 2000)
Nhìn chung, nấm men cố định chịu đựng áp suất thẩm thấu tốt hơn so với nấm
men tự do Tuy nhiên, hạt gel cũng chỉ cĩ khả năng bảo vệ tế bào khỏi áp suất
thẩm thấu ở một mức độ nhất định Theo Patkova và cộng sự (2000), khi nồng độ
dịch nha 28% và 30% thì thời gian lên men và tốc độ sinh ethanol đều giảm so với
khi lên men dịch nha cĩ nồng độ 24% (bảng 2.8, 2.9) [55, 56]
Bảng 2 7: Thời gian lên men các dịch nha nơng độ 12 - 30% (w/w) 6 13°C, sử dụng $.cerevisiae cố định trong gel alginate so với nấm men tự do [55] Nấm men cố định Nấm men tự do Dich nha (% w/w) 12 20 22 24 28 30 20° 24° Thời gian lên men 115 159 187 187 234 234 336 336 (gid)
Bảng 2 8: Tốc độ tổng hợp ethanol của S.cerevisiae c6 dinh trong gel alginate
Trang 38A B
Hình 2 10: Sự thay đổi hình thái của các tế bào nấm men S.cerevisiae (nấm men
chìm) A: trước khi chịu tác động của áp lực thẩm thấu, B: sau 15 phút tiếp xúc với
dung dich sorbitol 20% [55]
2.3.4.4 Nhiệt độ và pH lên men:
Nhiệt độ là một yếu tố rất quan trọng trong quá trình lên men vì nhiệt độ ảnh hưởng rất mạnh mẽ đến sự sinh trưởng và hoạt động trao đổi chất của nấm men Bên cạnh đĩ, nhiệt độ cịn ảnh hưởng rất lớn đến sự hình thành và tỉ lệ các sản phẩm phụ cửa quá trình lên men Trong lên men bia nơng độ cao, nhiệt độ thấp (khi sử dụng nấm men chìm) kết hợp với áp suất thẩm thấu cao của dịch nha cũng
gĩp phần ức chế sự phát triển của các vi sinh vật cĩ hại trong canh trường lên men Dragon và cộng sự (2004) cho rằng so với nồng độ ban đầu của dịch nha và tỉ lệ sử dụng thế liệu thì nhiệt độ cĩ ảnh hưởng nhiều hơn đến khả năng sinh tổng
hợp ethanol trong lên men bia nồng độ cao [27]
Willaert và Nedovic (2006) tổng hợp các nghiên cứu khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ (5 — 20°C) lên quá trình tổng hợp các hợp chất hương trong quá trình
lên men bia sử dụng nấm men cố định trong gel Ca-alginate và một số chất mang khác Các tác giả cho rằng các tế bào cố định trong gel sinh tổng hợp hàm lượng
các rượu bậc cao và diacetyl đều thấp hơn so với nấm men tự do ở tất cả các giá trị
nhiệt độ khảo sát Bên cạnh đĩ, ở nhiệt độ 5-15°C, hàm lượng ester và
acetaldehyde tạo thành của nấm men cố định cũng thấp hơn so với nấm men tự do
[78]
Trang 392.3.4.5 Hàm lượng oxygen hồ tan:
Quá trình lên men bia được thực hiện trong điều kiện yếm khí Tuy nhiên, khi
bắt đầu quá trình lên men, mơi trường cần cĩ một lượng oxygen để nấm men sinh
trưởng và phát triển Nếu cung cấp lượng oxygen khơng đủ sẽ làm giảm khả năng sống sĩt của nấm men, làm chậm tốc độ sử dụng acid amin do sự sinh trưởng của tế
bào bị kìm hãm Điều này làm giảm kha năng trao đổi chất của tế bào Mặt khác,
oxygen rất cần thiết cho sự sinh tổng hợp các acid béo, các sterol là những chất rất
cần thiết cho màng tế bào Các acid béo cũng là chất giúp tế bào chống chịu áp
suất thẩm thấu cao, nơng độ ethanol cao trong dịch lên men và chúng là tiền chất
của quá trình tổng hợp các ester tạo hương Tuy nhiên nếu lượng oxygen dư thừa
thì các tế bào sẽ sinh năng lượng bằng con đường hơ hấp hiếu khí, tăng sinh khối
mà khơng lên men sinh tổng hợp cthanol
Vì vậy, trong cơng nghệ sản xuất bia, thơng thường dịch nha được sục khí đạt
được hàm lượng oxi hoa tan khoảng 6 - 8 ppm trước khi thực hiện quá trình lên
+ 4 +2 ay
men để đảm bảo cho sự phát triển của nấm men
Theo O’Connor-Cox va Ingledew (1990) thì tốc độ sinh ethanol của nấm men
tự do trong trường hợp lên men bia cĩ sục khí tăng 20% so với khơng sục khí Việc sục khí sau khi cấy giống làm tăng lượng acid béo tích luỹ trong tế bào so với việc
chỉ sục khí trước khi cấy giống Các tác giả đã cho rằng tế bào nấm men tự do tăng cường sử dụng FAN khơng phải để tăng trưởng sinh khối mà chủ yếu được sử dụng
để sinh tổng hợp các rượu bậc cao Việc sục oxy trong giai đoạn đầu của quá trình
lên men cĩ thể thay thế được giải pháp bổ sung lipid, chất chiết nấm men vào dịch
nha lên men bia nơng độ cao [35, 52, 53]
2.3.4.6 Nơng độ của sản phẩm lên men:
Sản phẩm chính của quá trình lên men là ethanol và khí cacbonic Khi nồng
độ của ethanol trong mơi trường lên men tích tụ đến một giá trị nhất định thì các tế bào nấm men bắt đầu bị ức chế Đối với nấm men tự do, khi nổng độ cơn dưới 2%
thì các hoạt động của nấm men vẫn xảy ra bình thường; nhưng khi vượt quá 2% thì
khả năng nảy chổi của nấm men bắt đầu giảm Khi nồng độ ethanol tăng lên đến
5% thì khả năng nảy chổi của nấm men chấm dứt nhưng quá trình lên men vẫn tiếp diễn
Trang 40Patkova và cộng sự (2000) đã nghiên cứu khả năng sống sĩt của nấm men cố
định trong gel Ca-alginate dưới tác động của các nồng độ ethanol tạo thành khác
nhau khi lên men dịch nha 12 — 30% Kết quả cho thấy rằng khẩ năng sống sĩt của
nấm men cố định trong suốt quá trình lên men dịch nha nồng độ 12 — 24% khơng
thấp hơn 95% khi nồng độ ethanol trong bia non trên 10%(v/v) Họ cho rằng hạt gel
đã cĩ tác dụng bảo vệ tế bào [55]
Bang 2 9: Khả năng sống sĩt của nấm men chìm $.cerevisiae cố định trong gel
alginate trong quá trình lên men các dịch nha nỗng độ 12 — 30% (w/w) 6 13°C [55] Nấm men „ „ Nấm men cố định tự do Nồng độ dich nha (%) 12 24 12 20 22 24 28 30 Nồng độ cthanol cuối cùng(%v/v) 53 62 60 7,4 81 9,5 10,5 10,0 Khả năng sống sĩt của tế bào(%) 74 69 96 95 94 95 86 84
Hình 2 11: Sự thay đổi hình thái của các tế bào nấm men chìm (A): trước khi chịu
tác động của ethanol, (B): sau 15 phút tiếp xúc với dung dịch ethanol 10% (v/v)[55]