Xác định sinh trưởng tế bào Trong hệ thống sinh học, sinh trưởng định nghĩa tăng thành phần hóa học Sự sinh trưởng tế bào xác định số lượng tế bào, sinh khối tế bào hoạt tính tế bào Xác định số lượng tế bào 1.1 Đếm kính hiển vi Số lượng tế bào quần lạc đếm kính hiển vi cách đếm tế bào đưa vào buồng đếm đặc biệt Có hai loại buồng đếm dùng để đếm số lượng tế bào mẫu dịch lỏng: - Haemocytomete Buồng đếm tế bào máu dùng cho tế bào có đường kính ≥ - Petroff-Hausser counting chamber Buồng đếm µm Petroff- Hausser dùng chủ yếu cho vi khuẩn Cả hai loại buồng đếm có đường kẻ ô vuông đặc trưng bề mặt kính (lam kính) Khung đỡ mặt đếm (grid) giữ kính phủ (cover glass) cách đếm khoảng cách biết (ví dụ: 0,1 mm) cho thể tích ô vuông biết xác Một mẫu dịch huyền phù tế bào cần đếm cho chảy qua phủ làm đầy buồng đếm Sau đó, đếm số lượng tế bào đơn vị diện tích đường kẻ kính hiển vi Các dịch huyền phù đậm đặc đếm chúng pha loãng thích hợp Một số ưu điểm phương pháp đếm trực tiếp: - Chỉ cần Các thiết kết bị thu tối thiểu nhanh - Có thể quan sát đặc điểm hình thái thể Buồng đếm haemocytometer Một số nhược điểm phương pháp đếm trực tiếp: - Thường khó phân biệt tế bào chết tế bào sống - Không thích hợp cho dịch huyền phù có mật độ thấp - Các tế bào có kích thước nhỏ thường khó quan sát kính hiển vi không thấy đếm - Phương pháp đếm thực tế gây mỏi mệt nhầm lẫn trình đếm - Không thích hợp tế bào xếp thành cụm mycelium (thể sợi nấm) 1.2 Đếm tế bào phát triển đĩa nuôi cấy (petri dish) Các tế bào phát triển định nghĩa tế bào phân chia tạo khuẩn lạc Có hai cách để thực phương pháp đếm đĩa petri: phương pháp đĩa trải (spread plate) phương pháp đĩa rót (pour plate) Với phương pháp đĩa trải, thể tích nhỏ 100 µL trải khắp bề mặt agar Với phương pháp đĩa rót, mẫu vật trộn với agar nóng chảy (đã để nguội đến khoảng 60oC) rót đĩa vô trùng Các đĩa sau nuôi xuất khuẩn lạc, số lượng khuẩn lạc đếm trực tiếp Điều quan trọng số lượng khuẩn lạc phát triển đĩa phải không lớn không nhỏ Để thu số lượng tế bào thích hợp đơn vị diện tích mẫu vật phải pha loãng Trường hợp cần pha loãng nhiều, người ta thường sử dụng kỹ thuật pha loãng (serial dilution) Ví dụ: để thực pha loãng 1/106, thực ba lần pha loãng liên tiếp 1/100 sáu lần pha loãng liên tiếp 1/10 1.3 Đếm máy đếm Để tránh đơn điệu đếm trực tiếp kính hiển vi, sử dụng phương pháp đếm máy đếm Kỹ thuật cho phép không đếm số lượng tế bào, mà đo kích thước tế bào Nhược điểm phương pháp phân biệt tế bào phần tử bẩn khác Kỹ thuật khó sử dụng với thể dạng chuỗi không đem lại kết tốt với thể dạng hệ sợi (ví dụ nấm) Xác định sinh khối tế bào 2.1 Trọng lượng khô tế bào Trọng lượng khô tế bào xác định trực tiếp cách lấy lượng tối thiểu dịch huyền phù tế bào để ly tâm Sau đổ thể nổi, tế bào rửa nước cất để loại bỏ tất chất hòa tan Dịch huyền phù ly tâm lần tế bào sau kết đặc lại sấy khô tủ sấy cân để xác định trọng lượng Đây phương thức trực tiếp để xác định số lượng sinh khối tế bào Tuy nhiên, cách xác định tốn nhiều thời gian dễ bỏ qua thay đổi nhỏ sinh khối tế bào Kỹ thuật sử dụng dịch huyền phù dày đặc tế bào phải rửa hoàn toàn khỏi chất ngoại sinh bám vào 2.2 Độ đục dịch huyền phù tế bào Sinh khối tế bào xác định phương pháp quang học thông qua xác định lượng ánh sáng bị tán xạ dịch huyền phù tế bào Kỹ thuật dựa sở lập luận phần tử nhỏ tán xạ ánh sáng cách tương xứng, giới hạn định, tới nồng độ chúng Khi tia sáng xuyên qua dịch huyền phù tế bào, lượng ánh sáng truyền qua bị giảm kết tán xạ, phương pháp xác định mật độ tế bào Việc đo độ đục dịch huyền phù tế bào thường thực máy quang phổ để đọc đơn vị hấp thụ (A) Khả hấp thụ (absorbency) định nghĩa số logarithm tỷ lệ cường độ ánh sáng va chạm vào dịch huyền phù tế bào (Io) cường độ ánh sáng truyền qua dịch huyền phù (I): A = log Io/I Đường cong chuẩn (standard curve) thu cách đo độ hấp thụ (A) mẫu với nồng độ tế bào biết trước Việc đo thường thực bước sóng từ 600-700 nm Các phương pháp gián tiếp Phương pháp gián tiếp để xác định sinh khối tế bào dựa phép tính hệ số tỷ lượng toàn phần (overall stoichiometry) cho sinh trưởng tạo thành sản phẩm, trình bày dạng chung sau: Nguồn carbon + nguồn nitrogen + phosphate + O2 → sinh khối tế bào + CO2 + H2O + sản phẩm + nhiệt Sự thay đổi sinh khối tế bào kiểm soát gián tiếp cách xác định tiêu thụ chất dinh dưỡng, tạo thành sản phẩm, thành phần tế bào, giải phóng nhiệt tính chất vật lý khác dịch nuôi cấy tế bào 3.1 Sự tiêu thụ chất dinh dưỡng Cần chọn chất dinh dưỡng mà chất không sử dụng để tổng hợp sản phẩm trao đổi chẩt Phosphate, sulfate magnesium chọn lựa tốt Khi sinh khối tế bào sản phẩm chính, nồng độ nguồn carbon lại môi trường đo để đánh giá sinh khối tế bào 3.2 Tạo thành sản phẩm Điều quan trọng cần kiểm tra sản phẩm tạo thành có kết hợp với sinh trưởng hay không Một số sản phẩm tạo thành sau sinh khối tế bào đạt tới pha tĩnh (stationary phase) chu kỳ sinh trưởng thế, không kết hợp với sinh trưởng Sự giải phóng CO2 xác định có quan hệ tỷ lượng sinh trưởng tế bào Một sản phẩm hoàn toàn chung cho phản ứng lên men ion H+ Lượng kiềm bổ sung vào dịch lên men trì độ pH thích hợp cho sinh trưởng 3.3 Các thành phần tế bào Đối với nuôi cấy trải qua sinh trưởng cân bằng, thành phần tế bào thuộc nhóm đại phân tử protein, RNA DNA xác định thay cho sinh khối tế bào Tuy nhiên, cần phải thận trọng tỷ lệ nguyên liệu tế bào thay đổi theo thời gian nuôi cấy không trải qua sinh trưởng cân 3.4 Giải phóng nhiệt Sự sinh trưởng tế bào phát nhiệt Lượng nhiệt phát tùy thuộc vào hiệu suất sử dụng lượng carbon Vì thế, việc xác định nhiệt độ hệ lên men kết hợp gián tiếp với sinh trưởng tế bào Tuy nhiên, lượng nhiệt toàn phần tích lũy hệ lên men phụ thuộc vào hiệu phối hợp nguồn sinh nhiệt nhiệt khác như: nhiệt từ trình khuấy bay hơi, nhiệt tiêu hao xung quanh thành hệ lên men nhiệt nhạy (sensible heat) luồng không khí Vì thế, để xác định sinh trưởng giải phóng nhiệt, cần phải thiết lập cân lượng hệ lên men công việc không dễ dàng 3.5 Độ nhớt Sinh trưởng thể hệ sợi (nấm) tạo thành polysaccharide làm tăng độ nhớt dịch lên men (fermentation broth) Vì thế, việc xác định độ nhớt dịch lên men hữu ích trình lên men quy mô công nghiệp Độ nhớt biểu kiến đo tốc độ dịch chuyển cố định dùng để đánh giá nồng độ tế bào nồng độ sản phẩm ... nấm) Xác định sinh khối tế bào 2.1 Trọng lượng khô tế bào Trọng lượng khô tế bào xác định trực tiếp cách lấy lượng tối thiểu dịch huyền phù tế bào để ly tâm Sau đổ thể nổi, tế bào rửa nước cất... thay đổi nhỏ sinh khối tế bào Kỹ thuật sử dụng dịch huyền phù dày đặc tế bào phải rửa hoàn toàn khỏi chất ngoại sinh bám vào 2.2 Độ đục dịch huyền phù tế bào Sinh khối tế bào xác định phương pháp... huyền phù ly tâm lần tế bào sau kết đặc lại sấy khô tủ sấy cân để xác định trọng lượng Đây phương thức trực tiếp để xác định số lượng sinh khối tế bào Tuy nhiên, cách xác định tốn nhiều thời gian